第三章 葉綠素的水萃取物質對過氧化氫所誘導淋巴球細胞 DNA 損傷
第二節 結果
一、葉綠素水萃取物純度分析
所有葉綠素水萃取物經過 RP-HPLC 的分析，其純度均達 99％以 上(圖十七~圖二十)。
圖十七： 葉綠素水萃取物-Chlorophyllide a 成分之 RP-HPLC 分析圖 Figure 17：Elution profile of the chlorophyllide a by RP-HPLC.
相對強度(mV)
滯留時間(min)
圖十八 葉綠素水萃取物-Chlorophyllide b 成分之 RP-HPLC 分析圖 Figure 18：Elution profile of the chlorophyllide b by RP-HPLC.
相對強度(mV)
滯留時間(min)
圖十九 葉綠素水萃取物-Pheophorbide a 成分之 RP-HPLC 分析圖 Figure 19：Elution profile of the Pheophorbide a by RP-HPLC.
相對強度(mV)
滯留時間(min)
圖二十 葉綠素水萃取物-Pheophorbide b 成分之 RP-HPLC 分析圖 Figure 20：Elution profile of the Pheophorbide b by RP-HPLC.
相對強度(mV)
滯留時間(min)
二、細胞存活率分析
由表三的結果顯示，人類淋巴球細胞在添加不同種類與濃度的葉 綠素水萃取物(5、20、50µM) 30 分鐘與 H2O2(0、10、50µM) 5 分鐘後 細胞的存活率。其中以添加 50µM Pho b 的細胞活率最高(99.8±2.6) ， 而添加Pho b 與 50µM H2O2的細胞活率最低(95.2±2.8)。然而所有組 別當中並沒有統計上的差異，且細胞存活率都達到 95％以上。表四 顯示細胞在無添加葉綠素的情形下給予 10µM 或 50µM 的 H2O2來誘 導DNA 的氧化傷害，經過 5 分鐘的共同培養之後，亦沒有明顯造成 細胞死亡的現象。因此，後續實驗則利用上述濃度的各種葉綠素水萃 取物作為本研究的對象。
表三：人類淋巴球細胞加入葉綠素水萃取物與H2O2培養的存活率 1 Table 3 Effect of chlorophyll derivatives and H2O2 on human lymphocyte viability1
lymphocyte viability (%)
Chlorophyll derivatives 5µM 20µM 50µM Chlorophyllide a 97.5±6.4 98.4±5.3 96.2±4.3 Chlorophyllide a + 10µM H2O2 96.8±2.5 97.8±3.8 97.5±2.4 Chlorophyllide a + 50µM H2O2 95.8±3.2 96.1±2.5 97.1±3.4 Chlorophyllide b 98.8±2.2 96.8±3.5 99.2±4.4 Chlorophyllide b + 10µM H2O2 97.±4.2 97.9±3.8 98.1±4.5 Chlorophyllide b + 50µM H2O2 96.±2.8 96.9±3.3 96.5±2.5 Pheophorbide a 95.8±6.5 96.9±3.4 99.4±2.5 Pheophorbide a + 10µM H2O2 96.8±3.5 97.7±3.2 95.7±4.2 Pheophorbide a + 50µM H2O2 95.2±2.4 96.5±2.8 96.3±3.2 Pheophorbide b 98.4±1.6 99.7±3.3 99.8±2.6 Pheophorbide b + 10µM H2O2 97.2±2.6 96.5±4.3 97.2±1.6 Pheophorbide b + 50µM H2O2 95.2±2.8 95.1±0.3 98.1±2.5 Chlorophyllin 98.5±2.3 96.4±2.2 95.4±6.1 Chlorophyllin + 10µM H2O2 96.0±0.3 97.8±1.2 96.8±2.1 Chlorophyllin + 50µM H2O2 96.7±2.3 99.1±0.9 97.5±3.8
1 Mean±SD, Viability (measured by the MTS assay) was determined both prior to (100%) and following chlorophyll derivatives and H2O2.
表四：人類淋巴球細胞加入H2O2培養後的存活率 1
Table 4 Effect of pretreated H2O2 on human lymphocyte viability1 lymphocyte viability (%)
10µM 50µM H2O2 99.4±2.4 98.2±7.1
1 Mean±SD, Viability (measured by the MTS assay) was determined both prior to (100%) and following H2O2
treatment.
三、清除1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH)自由基能力
圖二十一顯示葉綠素水萃取物對於清除DPPH 自由基的能力。清 除自由基的能力由強至弱依次為 Pho b＞Pho a＞Chlin＞Chlide b＞
Chlide a。如果以葉綠素的種類區分時: Pho＞Chlin＞Chlide，且 b form
＞a form。其中達到 50％清除 DPPH 自由基(IC50)所需要的葉綠素濃 度分別是Pho b：75 µM，Pho a：120 µM,，Chlin：360 µM，Chlide a，
Chlide b：＞800 µM (表五)。
Chlorophyll derivatives (uM)
0 100 200 300 400
Free radical inhibition ( % )
0 20 40 60 80 100
Chlorophyllide a Chlorophyllide b Pheophorbide a Pheophorbide b Chlorophyllin
圖二十一：葉綠素水萃取物清除DPPH 自由基的能力。
Figure 21：DPPH-scavenging capacity of chlorophyll derivatives. The absorbance inhibition for DPPH was monitored at 515 nm. Results represent the mean±SD (●:Chlorophyllide a, ○: Chlorophyllide b, ▲:
Pheophorbide a, △: Pheophorbide b, ■: Chlorophyllin.)
表五：清除50%的 DPPH 自由基(IC50)所需要的葉綠素濃度
Table 5: DPPH radical scavenging effect of chlorophyll derivatives calculated in terms of IC50
Treatment IC50(µM) Chlorophyllide a ＞800 Chloropyhllide b ＞800 Pheophorbide a 120 Pheophorbide b 75
Chlorophyllin 360
四、H2O2誘導 DNA 氧化損傷
本實驗的設計將人類淋巴球細胞在 95%的細胞存活率下，檢視 DNA 的氧化損傷情形。由表四可看出細胞在不同濃度的 H2O2 作用 下，都保持穩定的存活率，但在這樣的濃度下是否會誘導DNA 氧化 損傷，利用單細胞膠體電泳法直接在電子顯微鏡下測量DNA 的斷裂 程度，或是測量DNA 氧化產物 8-OHdG 的含量，即可驗證 H2O2在人 類淋巴球細胞中是否造成 DNA 損傷。表六顯示淋巴球細胞 DNA 損 傷的程度，以彗星分析之平均尾動量而言，10µM H2O2之氧化損傷較 控制組增加60 倍(尾動量 100 vs 6386)；50µM H2O2之氧化損傷較控 制組增加150 倍(尾動量 100 vs 14537) 。圖二十二顯示在螢光顯微鏡 下所呈現之DNA 斷裂彗星分析電泳圖，以以及利用 VisCOMET® 軟 體分析所得的結果。此外，測量DNA 氧化損傷產物-8-OHdG 的含量，
發現10µM H2O2之 8-OHdG 較控制組增加 4 倍(0.55 vs 2.30)；50µM H2O2之氧化損傷較控制組增加7 倍(0.55 vs 3.98)。因此無論利用彗星 分析 DNA 斷裂或測量氧化代謝產物，均顯示淋巴球細胞之 DNA 損 傷，都隨著H2O2暴露濃度的增加而提高。
表六：H2O2 對於人類淋巴球細胞氧化損傷的影響
Table 6. Effect of H2O2 upon human lymphocyte DNA damage1
DNA damage
Comet assay2 8-OHdG(ng /µg DNA) H2O2 10µM 6386±803a 2.30±0.13a
H2O2 50µM 14537±1692b 3.98±0.33b Control 100±21c 0.55±0.06c
1Mean±SD; Values featuring different letters differ significantly as regards H2O2 levels (ANOVA p < 0.05),
2Mean tail moment (TM) was calculated for the comet assay.
圖二十二：以彗星分析DNA 損傷的結果
Figure 22：The tail moment (integrated value of DNA density multiplied by the DNA migration distance) was used as the primary measure of DNA damage
五、葉綠素對於H2O2誘導淋巴球細胞 DNA 氧化損傷的影響
圖二十三與圖二十四顯示添加各種不同濃度的葉綠素水萃取物 質後，再給與10µM H2O2所誘導氧化損傷的人類淋巴球細胞DNA 損 傷的結果。葉綠素水萃取產物在 a form 與 b form 之間都沒有統計上 的差異，但是無論是添加何種類型的葉綠素水萃取物質或是銅鈉葉綠 素，其細胞氧化損傷都隨著濃度的增加而減少，顯示這些物質藉由抗 氧化作用減少DNA 的氧化傷害，其中又以脫去鎂離子的 Pho 效果最 好(與對照組作比較時，Pho a 與 b 的抑制效果分別為 75.28% 和 76.17%)。
圖二十五及二十六顯示細胞在接受高濃度 50µM 的 H2O2後各種 葉綠素的保護效果。細胞的氧化傷害增加，然而Chlide 或 Chlin 都無 法對細胞進行保護作用，僅 Pho 降低細胞的氧化傷害(與對照組作比 較時，Pho a 與 b 的抑制效果分別為 19.63% 與 20.18%)。
Chlorophyll derivatives(uM)
0 10 20 30 40 50
DNA damage(Tail Moment)
1000 Pheophorbide b Pheophorbide b Chlorophyllin
圖二十三：添加各種不同濃度的葉綠素水萃取物質後再給與 10µM H2O2所誘導氧化損傷的人類淋巴球細胞DNA 損傷的結果(彗星分析) Figure 23: Effect of Chlororphyll derivatives pretreatment upon 10µM hydrogen peroxide-induced DNA damage for isolated human lymphocytes. DNA oxidative damage was measured using the comet assay in lymphocyte DNA. Results are the mean±SD. (●:Chlorophyllide a, ○: Chlorophyllide b, ▲: Pheophorbide a, △: Pheophorbide b, ■:
Chlorophyllin.) Values with different letters differ significantly as regards oxidative damage when comparing between different chlorophyll derivatives (ANOVA, p < 0.05); * p < 0.05 refers to differences in oxidative damage as compared with the control (without chlorophyll derivatives).
Chlorophyll derivatives (uM)
0 10 20 30 40 50
8-OH dG level (ng /ug D N A )
0.0 Figure 24: Effect of chlorophyll derivatives pretreatment upon 10µM hydrogen peroxide-induced DNA damage for isolated human lymphocytes. DNA oxidative damage was measured using the 8-OHdG levels in lymphocyte DNA. Results are the mean±SD. (●:Chlorophyllide a, ○: Chlorophyllide b, ▲: Pheophorbide a, △: Pheophorbide b, ■:
Chlorophyllin.) Values with different letters differ significantly as regards oxidative damage when comparing between different chlorophyll derivatives (ANOVA, p < 0.05); * p < 0.05 refers to differences in oxidative damage as compared with the control (without Chlorophyll
*a
Chlorophyll derivatives (uM)
0 10 20 30 40 50
DN A damage (Tail moment)
10000
17000 Chlorophyllide a
Chlorophyllide b
Figure 25: Effect of chlorophyll derivatives pretreatment upon 50µM hydrogen peroxide-induced DNA damage for isolated human lymphocytes. DNA oxidative damage was measured using the comet assay in lymphocyte DNA. Results are the mean±SD. (●:Chlorophyllide a, ○: Chlorophyllide b, ▲: Pheophorbide a, △: Pheophorbide b, ■:
Chlorophyllin.) Values with different letters differ significantly as regards oxidative damage when comparing among different chlorophyll derivatives (ANOVA, p < 0.05); *p<0.05refers to differences in oxidative damage as compared with the control (without chlorophyll derivatives).
a a
Chlorophyll derivatives (uM)
0 10 20 30 40 50
8-OHdG level (ng/ug DNA)
1.0
4.5 Chlorophyllide a
Chlorophyllide b
Figure 26: Effect of chlorophyll derivatives pretreatment upon 50µM hydrogen peroxide-induced DNA damage for isolated human lymphocytes. DNA oxidative damage was measured using the 8-OHdG levels in lymphocyte DNA. Results are the mean±SD. (●:Chlorophyllide a, ○: Chlorophyllide b, ▲: Pheophorbide a, △: Pheophorbide b, ■:
Chlorophyllin.) Values with different letters differ significantly as regards oxidative damage when comparing among different chlorophyll derivatives (ANOVA, p < 0.05); * p < 0.05 refers to differences in oxidative damage as compared with the control (without chlorophyll
a a
第三節 討論
一、植物性化學物質抗氧化性的比較
1954 年自由基的發現，證實與許多慢性疾病有關；長期暴露在含 氧的自由基環境中將導致氧化壓力。一般生物體內的抗氧化系統與活 性氧是維持在一個平衡的狀態，當體內活性氧分子多時，它們將破壞 細胞中的蛋白質、脂質甚至DNA，最後造成細胞的老化或死亡(Sies, 1986； Halliwell and Gutteridge, 1999)。
許多天然的植物性食物(phytochemicals)或維生素都是抗氧化物 的最佳來源。由於近年來，一些蔬果中的植物性化學物質，例如：葉 綠素、類胡蘿蔔素、維生素 C、維生素 A 以及維生素 E 等物質，在 正常的攝取下具有抗氧化、抗突變性等保健功能。Ong 等學者在 1989 年的研究發現在上述的這些植物性化學物質中，葉綠素能發揮最佳的 抗突變性表現。此外，Kamat 等學者(2000)的研究指出葉綠素的抗氧 化效果比維生素C、glutathione 或 mannitol 來的好。
二、葉綠素在體內的代謝
葉 綠 素 主 要 以 兩 種 形 式 存 在 於 新 鮮 的 蔬 菜 水 果 中 ， 分 別 是 chlorophyll a 與 b (Almela, et al., 2000)，以新鮮菠菜為例，chlorophyll a 與 b 的含量比約為 2.5：1 (Ferruzzi, et al., 2001) 。但是隨著綠色 蔬菜種植的老化，葉菜中的 chlorophyllase 的濃度隨之增加，使葉綠
素脫去非極性的植醇鏈而產生極性較高的脫植醇葉綠素(Chlide) (Trebitsh, et al., 1993)。此外，當它們在酸性環境下，例如葉菜類食 物在烹調、製備或加工等過程中加入酸性物質例如醋；或是攝取食糜 後進入胃與胃酸混合之後，會失去其葉綠素中心 porphyrin 環內的鎂 離子而轉變成脫鎂葉綠素(Phe)，或脫鎂脫植醇葉綠素(Pho)。Ferruzzi 等學者(2001) 利用模擬人體小腸 Caco-2 細胞模式的研究發現，Phe 可以經由人類體內的乳糜微粒吸收進入循環系統。動物的研究發現 (葉, 2003)，這些葉綠素的代謝產物透過門靜脈到達肝臟後，幾乎轉 變成 Chlide 或 Pho。因此本實驗以 Chlide 或 Pho 等葉綠素的代謝產 物來進行研究，除可以比較各種葉綠素衍生物之抗氧化能力外，還可 以藉此模擬葉綠素代謝物質對人體所發揮的抗氧化效力。
三、葉綠素含量對人體淋巴球細胞的影響
Frenzilli 等學者(2000) 曾針對銅鈉葉綠素(Chlin)以及過氧化氫等 18 種化合物，添加在人類淋巴球細胞後，探討劑量對其細胞存活率 的影響；研究顯示要達到 95％以上的細胞存活率時，添加於細胞中 的葉綠素或過氧化氫的最大濃度分別為200 µM 與 50 µM。此研究 結果與本實驗表三與表四所呈現細胞的存活率一致。此外，Frenzilli 等學者(2000)也分析淋巴球細胞 DNA 的損傷程度，發現 DNA 的氧化 損傷隨著細胞添加過氧化氫濃度增加而增加，此結果與本實驗中表五
DNA 氧化損傷的結果一致。
本實驗對人體淋巴球細胞(2000 個/毫升)所使用的葉綠素最高濃 度為50 µM。若是依據健康的人體中淋巴球細胞約有 1.5×107 個來換 算，約需要0.3 公克的葉綠素才能在血液中達到相對濃度。惟目前缺 乏葉綠素生體可利用率的相關資料。根據 Ferruzzi 等學者(2001) 的 研究指出：約有 5-10%經過乳糜化的葉綠素可以進入人類 Coca-2 小 腸細胞，估算人體約需從飲食中攝取3~6 公克的葉綠素。一般新鮮菠 菜中平均大約含有2% 的葉綠素(L´opez-Ayerra, et al., 1998），因此推 估在理想的狀態下至少需攝取約300 公克的新鮮菠菜。此項結果符合 行政院衛生署建議每日蔬菜攝取量。惟上述的推估是在最理想的轉換 率下計算而得，有關食物從攝取進而達到人體內細胞的實際含量，必 須經過更進一步研究，包括葉綠素的生體可利用率、或是葉綠素代謝 產物的轉換率等，才可確認。
四、銅鈉葉綠素的抗氧化作用
銅鈉葉綠素廣泛的用於各種的成藥、食品中，因此與其相關的抗 氧化、抗腫瘤研究亦是備受注目。Kumar 等學者在 1999 年第一位提 出Chlin 抗氧化的量化研究；發現當 plasmid DNA 暴露在 6 Gy 的 γ 輻射線照射下會產生氧化傷害而造成單股斷裂，若DNA 在照射前先 添加不同濃度的Chlin (10µM~100µM) ，其 DNA 的氧化傷害保護效
果隨著 Chlin 劑量的增加而有顯著的效果 (22.6~68.1%的抑制 DNA 單股斷裂) ，接著利用 pulse radiolysis 來實際測量 Chlin 捕捉自由基 的能力亦發現：這些自由基 (hydroxyl radical、deoxyribose peroxyl radical、singlet oxygen) 與 Chlin 結合的比例隨著劑量的增加而提高，
且具有相當高的反應常數 (rate constant) (Kumar, et al., 1999；Kamat, et al., 2000) 。
此外，利用 Electron Spin Resonance (ESR)來分析 Chlin 與
此外，利用 Electron Spin Resonance (ESR)來分析 Chlin 與