3-1 研究架構
本研究之架構如圖 3-1 所示，主要分三階段進行，第一階段決定 研究議題、文獻收集及建立分析參數；第二階段是生物反應器設計、
架設及測試；第三階段則是針對不同試程包括空氣流量、爐石量，培 養 Chlorella sp.，並進行藻體表面特性及釋出液有機物性質之比較，
量 測 參 數 包 括 外 觀 、 藻 體 含 碳 量 、 非 揮 發 性 溶 解 性 有 機 碳 (non-purgeable dissolved carbon, NPDOC)、分子量大小、傅立葉轉換 紅外線光譜(Fourier Transform Infrared Spectrometry, FTIR)、螢光激發 發射光譜、紫外光吸收之分析，藉以瞭解不同試程對 Chlorella sp. 生 長過程釋出有機物性質及藻體物理特性變化，以及 Chlorella sp. 之固 碳能力評估。
3-2 實驗方法
3-2-1 藻種之選擇與批次培養
本研究以 Chlorella.sp 為培養藻種，其營養鹽參考 Andersen(2005) 之著作，並整理如表 3-1。Chlorella sp.則取自東港水試所蘇惠美博士 實驗室，反應器體積約 4 L，在反應器週圍適當距離設置光源，進行 光 照 ， 每 日 光 照 12 小 時 。 培 養 過 程 中 ， 利 用 空 氣 幫 浦 ( AL-6A,ALITA , Taiwan) 連接曝氣石(5/8"×7/8")將空氣導入反應器 中，提供樣本所需碳源及均勻翻滾水體避免沉澱。
表 3-1 Chlorella sp. 營養鹽濃度
培養液(g / L)
Components 濃度 Components 濃度
KNO3 5.00×10-3 M H3BO3 2.31×10-2 M KH2PO4 5.00×10-4 M MnSO4‧H2O 6.21×10-3 M K2HPO4 5.00×10-4 M ZnCl2 3.67×10-4 M MgSO4‧7H2O 2.00×10-3 M CuSO4‧5H2O 1.60×10-4 M Ca(NO3)2 3.05×10-5 M H2MoO4‧H2O 5.56×10-5 M FeSO4‧7H2O 1.08×10-5 M
文獻閱讀
藻種培養
氣體流量 爐石
研究目標
· 探討不同培養條件對微藻生長之影響
· 藻體表面特性觀察
· 藻體釋出液有機物性質之變化
· 微藻固碳效益評估
藻 體
· 藻體外觀
· 螢光強度
· 表面電性
· 元素分析
· FTIR
藻體釋出液
(經0.45um過濾)
· 有機物性質
· NPDOC
· 分子量
· 胺基酸
環境及水質參數
· pH、溶氧、鹼度
· 溫度、光強度
· 生長曲線、Biomass
圖 3-1 研究架構圖
3-2-2 光生物反應器設置
本研究設計之生物反應器系統圖，如圖 3-2 所示，配合計畫需求，
設計為可移動之系統，區分為三部分(1)二氧化碳或空氣產生器及氣 體流量偵測器；(2)藻類生長反應器；(3)二氧化碳偵測器。二氧化碳 來源利用二氧化碳及高純氮氣(99.999%)進行混合，配製不同二氧化 碳濃度，空氣來源則是以空氣幫浦(ALITA , Air Pump AL-6A, Taiwan) 通入空氣，氣體由反應器底端進入，並藉由 5/8"×7/8" 曝氣石進行曝 氣；氣體在通入反應器前會經過氣體流量計控制進氣流量，並裝設止 逆閥避免液體流入流量計及幫浦。反應器主體長、寬及高分別為 50、
50 及 170cm，並在四邊支架各設置 1 支日光燈管(東亞照明, FL 30D/29, Taiwan) 模擬光照，光照控制在 1.7 klux，並設有定時器控制光照時 間，藻類培養反應器為透明袋狀材質為聚丙烯(Polypropylene, PP)，直 徑及高度分別為 13 和 65 cm，培養體積約 4L，兩塊鐵弗龍材質圓盤 將透明袋固定其中，用 8 根螺絲釘鎖緊確保不會漏水，並利用 2 條之 鋼纜吊掛於反應器上緣處，藉以固定反應器。
圖 3-2 光生物反應系統圖
3-3 參數分析
3-3-1 基本環境及水質參數 3-3-1-1 溫度、pH、溶氧
培養期間之水質參數監測項目包括水溫、pH值、光照強度、溶 氧。藻水之溫度、pH值及溶氧量以手提式多參數水質分析儀(Multi 340i, WTW, Germany)測定；而光反應器藻水表面之光源強度以照度 計(TES-1335,TES,Taiwan)測定。
3-3-2 藻類外觀觀測、計數、含碳量測定與二氧化碳固定能力 3-3-2-1 電子顯微鏡之觀測
取適量含藻體之樣品以0.2 µm之Nylon 濾膜(Nylon membrane filters, whatman, England) 進行過濾，再將濾膜剪裁成四等份，將剪裁 過濾膜其過濾面朝內側相對，使用銅鐶以三明治的方式夾緊，將夾緊 後的銅鐶放入磷酸緩衝溶液中 (pH=7.0) 浸泡10-15分鐘 (or 浸泡三 次，每次 10 分鐘) 進行表面清洗，再放入2.5 %戊二醛 (Glutaldehyde Solution, Merck, Germany) 固定液中，隨後置入 4 ℃ 冰箱 2-16 時 進行固定之動作，前述動作完畢後，再以磷酸緩衝溶液( pH=7.0) 浸 泡樣本 10-15 分鐘 (or 浸泡三次，每次 10 分鐘) 。上述動作完成 後，開始進行脫水之工作，首先將絕對酒精 (Ethanol absolute, Ferak Berlin GmbH, Germany) 分別稀釋成10、25、50、75、90、95 % 不同 濃度之酒精；脫水分為兩階段，第一階段將濾紙放入漸次遞增濃度10、
25、50、75 % 酒精各浸泡一次，每次 10-15 分鐘；第二階段需以 90、
95 % 之酒精浸泡清洗一次，每次約30分鐘，最後以絕對酒精(酒精純 度為 99.8 %)浸泡 3 次，每次 30 分鐘。
前項作業完成後，使用臨界乾燥器 (HCP-2 critical point dryer, Hitachi, Japan) ，進行乾燥。乾燥完成後，使用黑色雙面膠帶將樣本 固定於樣本座上，樣本座材質可為銅製或鋁製，完成後使用真空蒸鍍 機 (Engineering IB-2 Ion, Eiko, Japan) ，進行樣本鍍金。鍍金主
要目的為增加導電性。鍍金結束後，即可使用掃描式電子顯微鏡 (S-2500 scanning electron microscope, Hitachi, Japan) 進行觀測，
操作條件如下表 3-2 所示：
表 3-2 掃瞄式電子顯微鏡之操作條件 (S-2500, Hitachi, Japan)
項目 操作條件
解析力 1.5nm (15KV), 5.0 nm (1.0KV) 加速電壓 0.5 kv to 30 kV (100V steps)
倍率 x 10 to x 500,000
GUN 熱場效型 In-Lens Thermal
影像模式 SEI (二次電子影像)
BEI TOPO/COMP (背向電子影像)
樣品最大容許 150.0 mm 直徑 X10 mm 高
即時影像顯示 1280 x 1024 pixels
樣品台
Eccent ri c X=70mm, Y=50mm , Z=3mm - 41mm
R=360°, T= -5 -60°
3-3-2-2 光學顯微鏡觀測及藻體計數
取適量藻水以 0.45 μm硝酸纖維膜(GN-6 Metrice® Grid 47mm, PALL, USA)過濾，將過濾後之濾膜適當裁剪，置於載玻片上，放入 乾燥器自然乾燥後，滴2-3滴顯微鏡專用鏡油，傾斜蓋上蓋玻片，以 光學顯微鏡(E400, Nikon, Japan)配合CCD影像擷取器(Digital sight DS-U3, Nikon, Japan)擷取影像及影像處理軟體 (ImageProPlus 5.0, MediaCybernetics, USA)進行觀測。
以 0.45 μm 之硝酸纖維膜 (Mixed cellulose ester, Advantec MFS Inc., USA ) 進行過濾，過濾後之濾膜經適當剪裁後，置於螢光 顯微鏡之載玻片上，並以蓋玻片覆蓋於螢光光學顯微鏡 (Fluorescence Microscope) (E-400, Nikon, Japan) 下，以濾光片 (G-2A, Nikon, Japan) 觀察螢光標記物，並以 CCD 影像擷取器 (Digital sight DS-U3, Nikon, Japan) 擷 取 影 像 ， 並 配 合 影 像 處 理 軟 體 (Image ProPlus 5.0, MediaCybernetics, USA) 計算藻體數。目鏡下選擇 20 個視野進行觀
察，並計算其平均值，再乘以視野面積，即可得出藻體數，最後再除 以取樣體積即可求出水樣之總藻體數，單位為 cells/mL 。
cells= CCD 擷取視野之總藻體數
216×162(μm)= CCD 擷取視野之面積 (μm2) 9.6×108= 樣本之過濾有效面積 (μm2)
X= 過濾樣本藻水之體積
cells/mL= 單位體積之總藻體數
3-3-2-3 藻體自發性螢光強度
以 0.45 μm 之硝酸纖維膜 (Mixed cellulose ester, Advantec MFS Inc., USA ) 進行過濾，過濾後之濾膜經適當剪裁後，置於螢光 顯微鏡之載玻片上，並以蓋玻片覆蓋於螢光光學顯微鏡 (Fluorescence Microscope) (E-400, Nikon, Japan) 下，以濾光片 (G-2A, Nikon, Japan) 觀察螢光標記物，利用 CCD 影像擷取器 (Digital sight DS-U3, Nikon, Japan) 擷 取 影 像 ， 並 配 合 影 像 處 理 軟 體 (Image ProPlus 5.0, MediaCybernetics, USA)進行影像擷取，選擇 20 個視野每個視野平 均藻數約在 30-100 個，利用影像處理軟體將藻體螢光畫面先清除背 景雜訊後轉換為灰階，利用軟體內強度計算功能選取平均強度，將該 視野內螢光標記物的強度列出，並轉換成Excel檔，而後將 20 個視 野之螢光強度利用Excel進行平均，計算藻體自發性螢光平均強度 值。
3-3-2-4 藻體界達電位
本 研 究 使 用 之 界 達 電 位 分 析 儀(Zetasizer NanoZ, Malvern, U.K.)，是以PCS (Photon correlation spectroscopy)法進行偵測 溶液或懸浮液中顆粒之擴散速率，利用兩束雷射光束交叉於量測管內 之靜止層(Stationary layer)，使其產生干涉條紋(Interference fringe)。樣
mL cells mL
X m m cells
/ 10
6 . ) 9 ( 162 216
8 2
2
品 粒 子 在 干 涉 條 紋 中 移 動 時 所 產 生 之 散 射 光 ， 經 由 PM (Photo-multiplier)管收集後，以其強弱及變化速率，準確偵測出粒子 之電泳速度，再計算出其界達電位值。水樣分析前，先以標準品進行 儀 器 之 校 正 。 本 儀 器 所 使 用 之 界 達 電 位 標 準 品 (Zeta potential transfer standard, DTS1050) 乃 參 考 NIST Goethite standard SRM1980，並由儀器商提供。標準品注入前先以去離子水潤洗量測管，
並確定其光散射強度小於10 Kcps (Kilo-counts per second)。若非介於 此範圍內，則取出量測管以甲醇清洗。標準品注入量測管後，選擇界 達電位模式，設定偵測溫度25℃，確定黏滯係數(Viscosity)、電解常 數 (Dielectric constant)，而偵測時間 (Measurement duration) 設定在 自動 (Auto) 狀態，並設定偵測次數，按下“GO” 鍵後，開始進行 偵測。標準品偵測出之界達電位值需為 -50~5 mV。若非介於此範圍 內，則請儀器商進行儀器之校正。水樣之偵測步驟同標準品。
3-3-2-5 生物質量(Biomass)
生物質量濃度之測定前，先以 1.5μm 濾紙(934AH, Whatman, UK)利用抽氣裝置以二段水浸濕後，置於鋁盤上，以烘箱 (OV50, Hipoint, Taiwan)於80℃下烘乾1小時後，取出置於乾燥箱內至室溫，
與鋁盤一同秤重並記錄為W0備用。依藻體增殖之情況，取適量藻水 (記錄為V)以秤重後備用之濾紙進行過濾，將濾紙及鋁盤一同放置於 80℃烘箱1小時，取出秤重則記錄為W1，依下列公式計算求得生物質 量濃度(g dried weight L-1)。
生物質量濃度(g DW L-1) = ((W1-W0)1000)/ V(L)
3-3-2-6 藻體乾重之含碳量
取冷凍乾燥之藻粉約 2-3 mg，利用四位數天秤進行秤重記錄後，
以錫盒進行樣品包覆動作，置於元素分析儀(Vario-EL Ⅲ, Elementar, Germany)在燃燒管 1150℃ 下燃燒產生氣體，以不同元素吸附管柱吸 附並於相對溫度脫附，以熱傳導偵測器，進行資料處理運算進行，比 對標準品檢量線計算藻體單位乾重含碳量(g C g-1 Dried Weight)。
3-3-2-7 固碳量之計算
關於固碳量之計算，本研究參考 De Morais and Costa (2007)所提 出之方法，其計算式如(1)式，FA 表示在一段時間內二氧化碳聚集的 量，而固碳率以 FD% 表之，如(2)式。
FA = (𝑋𝑡− 𝑋0) × 𝑚𝑐𝑏𝑚 × 𝑉𝑉𝑇𝑃× 𝑀𝐶
𝑀𝐶𝑂2 …………..(1) Xt： 藻體在 t 時間之濃度 (g/L)
X0： 藻體初始濃度 (g/L)
mcbm ：每克藻體乾重所含碳之重量 (g/g) VVTP：反應槽體積 (L)
Mc：碳之分子量(g/mol)
MCO2：二氧化碳之分子量(g/mol) FD = (𝐹𝐴(𝑡−1)𝑀 −𝐹𝐴𝑡)
𝑖𝑑 × 100% …………..(2)
FA(t-+1)：在 t+1 時間內，二氧化碳聚集量(g)
FA0：在 t 時間內，二氧化碳聚集量(g) Mid：二氧化碳注入量 (g)
3-3-3 有機性參數
3-3-3-1 紫外光及可見光譜儀(UV-Vis Spectrophotometer)
測定UV-vis時，將紫外光及可見光譜儀（U-2900, Hitachi, Japan) 之波長範圍設定於 200-900 nm，測定前使用實驗室之超純水置於一 公分之石英比色管中，並置入樣品槽，進行儀器歸零校正之步驟，隨 後取約八分滿之水樣於一公分之石英比色管中，將其置入樣品槽內，
進行樣本分析。
表 3-3 紫外光及可見光譜儀參數設定值
Parameter Value
Measurement type Wavelength scan
Data mode Abs
Start Wavelength 900 nm
End Wavelength 200 nm
Slit Width 1.5 nm
Scan speed 400 nm/min
3-3-3-2 螢 光 激 發 發 射 光 譜 (Excitation Emission Fluorescence Matrix,EEFM)
本研究以螢光光譜儀 (F-4500, Hitachi, Japan)進行藻類或其釋出 有機物之螢光分析，光源採用氙燈作為光源，功率為150 W，偵測器 採用光電倍增管，其功能除了傳統單一波長掃描外，並具有三度位向 測量EEFM之功能，藉此功能可將激發及發射波長分別繪製於X及Y 軸上，並將螢光強度顯示於Z軸。依光柵寬度設定，產生數百至數千 筆之數據資料。以儀器附屬之分析軟體FL Solutions進行3-D圖譜之繪 製，而後將其數據輸出轉成EXCEL.CSV檔，原本EXCEL.CSV為距陣 型式之數據，經轉檔後變為直列型式數據，並匯入SURFER軟體，繪 製出與FL Solutions軟體相同之螢光圖譜。使用FL Solutions軟體判讀 EX/EM (Excitation/ Emission)之效率較佳，故圖譜之判讀與繪成螢光 圖譜採分開作業之方式進行。
取 Chlorella sp. 藻 水 ， 經 0.45μm 濾 膜 (Mixed cellulose ester, Advantec MFS Inc., USA)過濾，以未過濾之藻水作為藻體樣本，藻水 之過濾液則為釋出有機物分析之樣本。進行樣本之螢光分析時，設定 激發發射波長之全譜3-D掃瞄，分析前將實驗室之二段水注於一公分 之四面透明石英比色管中，並置入樣品槽掃瞄，作為空白3-D掃瞄，
隨後取約八分滿之藻體水樣或藻水之過濾液，進行樣本3-D掃瞄。掃 瞄後利用螢光圖譜分析軟體，將水樣圖譜扣除空白圖譜後，得到樣本
之螢光圖譜。螢光光譜儀之操作條件如表3-4所示。
以螢光激發發射光譜儀之全譜掃描後，將數據扣除背景值後將數 據輸出，輸出之激發發射波長為 Ex/Em：200-400/280-550 nm，數 據輸出後並將水中之 OH-及石英 cell 折射之 Rayleigh-Tyndall 去 除，接著參考Chen et al .(2003)利用三維螢光光譜圖中激發與發射波 長對應位置將有機物區分為五大類：第I 類為 EX (激發波長) < 250 nm，EM (發射波長) < 330 nm，屬芳香型之蛋白質 (Aromatic protein) 酪胺酸；第II類 EX < 250 nm，EM在 320-380 nm，屬芳香型之蛋白 質 (Aromatic protein)與 BOD5有關之物質；第 III類 EX < 250 nm，
EM > 350 nm，屬黃酸 (fulvic acid)物質；第 IV類 EX在 250-280 nm，
EM < 380 nm ， 屬 於 溶 解 性 微 生 物 代 謝 物 質 (Soluble Microbial by-product-like)；第 V類EX > 280 nm，EM > 380 nm，屬似腐植酸 (Humic Acid-Like)物質，以儀器附屬之分析軟體FL Solutions進行3-D 圖譜之繪製，將數據輸出轉成EXCEL檔，將各區塊之螢光強度進行 累加、平均強度及組成百分比之運算。
3-3-3-3 非揮發性溶解性有機碳(Non-Purgeable Dissolved Organic Carbon, NPDOC)
本研究以總有機碳分析儀(Multi N/C 3000, Analytik Jena AG, Germany)進行藻水中非揮發性溶解性有機碳含量之測定。藻水之前處
表 3-4 EEFM 之操作參數設定值
Parameter Value
Measurement type 3-D scan
Data mode Fluorescence
EX & EM Start – End WL 200 - 900 nm EX & EM Slit 10 nm
Scan speed 30000 nm/min
PMT Voltage 700 V
理，以 0.45μm 濾膜(Cellulose acetate, MFS, USA)進行細濾，經過濾 方式去除水中雜質及藻體後，以磷酸(H3PO4, Merck, USA)進行酸化至 pH 小於 2 。樣本分析前，先以純氮氣吹拂 5-10 分鐘，即可將樣本 置於總有機碳分析儀之吸取處，水樣經由吸取器，注入裝填高感度觸 媒(Cerium Oxide, Merck, Germany)之高溫爐中，在 850℃ 下與氧氣 反應生成 CO2，並藉載流氣體攜帶 CO2，流經無機碳反應器，並除 濕 、 降 溫 及 乾 燥 ， 最 後 CO2送 至 非 分 散 紅 外 線 吸 收 偵 檢 器 (Non-dispersive Infrared Absorption Detector)中，偵測讀值。檢量線之 製作，以磷苯二鉀酸氫鉀(KHP)配製成有機碳(Organic Carbon, OC) 儲備溶液，再以有機碳儲備溶液配製成ㄧ系列之檢量線濃度，完成檢 量線之R2值需大於0.995，方可進行樣本分析，以確保正確性。所得 之結果配合一系列適當濃度之標準溶液所得檢量線，求得樣本中非揮 發性溶解性有機碳含量(mg/ L)。
3-3-3-4 有機物分子量(Molecular weigth)
利用高效能液相層析儀 HPLC (L-7455, Hitachi, Japan)配合 DAD 偵檢器(Diode array detector)進行分子量之測定。移動相(Mobile phase) 為 2.4 mM NaH2PO4、1.6 mM Na2HPO4及 25 mM Na2SO4混合成 pH 6.8 離子強度 100 mM 之磷酸緩衝液，流速為 0.5 mL/min。水樣以 0.45 μm 之濾膜(Mixed cellulose ester, Advantec MFS Inc., USA)過濾非水溶性 物質後隨即分析。分析管柱安裝於外部尺寸(W×D×H)：185 ×108 × 490 mm，烘箱尺寸：45 × 26 × 330 mm 恆溫箱(CH-900, ChromTech, Taiwan) 內，固定溫度 30℃，溫度穩定性±0.3℃，避免移動相因溫差所產生之 氣泡干擾。DAD 偵檢器偵測波長設定為 210 nm，分析管柱為 TSK HW-55S(Tosoh, USA)，內徑、長度分別為 7.8 mm 及 300 mm，內部 填物為 hydroxylated methacrylic polymer，粒徑及平均孔徑大小為 20
－40 µm 與 125 Å，pH 穩定範圍為 2－13。為了得知樣本分子量分佈，
以一系列已知分子量且分佈狹窄之高分子聚合物作為標準品，建立一 條律定曲線。使用 polyethylene glycol, PEG (Sigma, USA)作為標準 品，分別選用分子量大小為 410,000、150,000、50,000、25,000、5,000 及 1,000 Da，將標準品以移動相稀釋成適當濃度後，以 150 μL 平頭
微量注射針(Gasstight, USA)抽取並注入體積為 100 μL 之 Sample loop，由各標準品之 SEC 圖譜(圖 3-2)可得其停留時間與分子量之線 性關係式。
圖 3-3 分子量與停滯時間關係圖
3-3-3-5 藻體表面官能基測定
為觀察確認藻體表面之官能基之變化，以紅外線光譜分析儀 (BRUKER 66v/s)進行表面分析。將欲分析之藻水以離心機(CR22GIII, Hitachi, Japan)收集藻泥，將所得藻泥冷凍乾燥(FDU-2100, EYELA, Japan)以去除水分，將藻粉與KBr混合打片直徑約1 cm，放入紅外線 光譜分析儀，進行紅外線光譜分析，分析範圍為400-400 cm-1，解析 度4 cm-1。
Retention Time (min)
0 10 20 30 40
Molecular Weight (Log Da)
0 2 4 6 8 10
log(M)=-5.503x + 41.122*Ve R=0.992