683 nm 測 得 吸 收 值 與 藻 體 乾 重 (g/L) 所 對 應 之 曲 線 ， Y(g/L)=0.2786X-0.0961 ; R=0.9936，結果顯示 OD683 與 Biomass 之間 相關性高。黃氏等(2010) 為尋找小球藻(Chlorella spp.)的最佳波長，
從 540-700 nm 中選取 11 個波長進行測定，同時也針對藻體乾重和吸 光值進行線性迴歸分析，研究結果顯示 11 個波長中以 680 nm 最為靈 敏，Y(g/L)=0.25 X(OD680)-0.0015 其 r>0.999，而光密度法測定小球 藻濃度存在一個範圍，以吸光值 0.05～0.5 之間時測得數據有較好的 線性關係。
圖 4-2 Chlorella sp.在 683 nm 與 Biomass 之對應曲線
4-2 空氣流量對 Chlorella.sp 藻體特性及釋出有機物性質之影響 4-2-1 Chlorella sp. 生長速率
圖 4-3(A) 為不同空氣流量培養下 Chlorella sp. 之生長曲線，初 始吸光值皆為0.1 cm-1，圖中顯示空氣流量為0.5 L/min時，第2天時吸 光值增至 0.5 cm-1 培養到第6天和第11天分別為1.5和2.2 cm-1 ，空氣 流量為1.0 L/min時第2天吸光值為0.5 cm-1，第6天和第11天吸光值分
Absorbance (cm-1) at 683 nm
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
B iomass (g /L )
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Y=0.2786X-0.0961 R=0.9936
別為1.8及2.5 cm-1 ，當空氣流量為2.0 L/min時其第2、6及11天之吸光 值分別為0.5、2.3 cm-1 和2.6 cm-1。在第0天到第2天的培養過程中，三 種空氣流量的吸光值增加率皆為80%，培養第2天到第6天的過程中吸 光值增加率最高為空氣流量2.0 L/min的78%其次為1.0 L/min的72%，
最低值為 67% 是空氣流量0.5 L/min，而在第 6 到 11 天之間，吸 光值的增加率隨空氣流量增加而降低，增加率分別為32%、28%和12%。
圖4-3(B)則是不同空氣流量培養時，藻體乾重變化趨勢，變化的趨勢 與OD683吸收值一致，在培養第0及2天時三種空氣流量的結果並無明 顯差異，而培養第6及11天時則是以空氣流量 2.0 L/min 藻體乾重最 大。因為高濃度的二氧化碳促進微藻光合作用，在短時間內快速繁殖，
微藻的生物質量(Biomass)增加，相同培養體積內進氣流量越大，二氧 化碳含量也越高，因此空氣流量 2.0 L/min培養下Chlorella sp.生長速 率最快。
陳氏(2007) Chlorella sp.選擇螢光計數法、血球計數法及鏡檢計數 法，三種方法進行相對差異係數之比較，結果顯示三種方法相對差異 係數均小於 20 %，螢光計數法具有節省時間及人力的優點，因此選 用此法進行藻數計算。三種空氣流量培養 Chlorella sp. 起始 OD683 為 0.1cm-1，取適當藻水進行過濾後，利用螢光顯微鏡配合影像分析 及計數軟體，將軟體計數之藻數帶入公式計算後初始藻數為 106 cells/mL，圖 4-4 為不同空氣流量培養 Chlorella sp. 的藻數變化，空 氣流量 0.5 L/min 時培養到第 6 天時藻數都呈現增加的趨勢，而第 6 天到第 11 天之間則無太大變化。空氣流量變化為 1.0 L/min 時，其 藻數明顯低於另外兩種空氣流量，藻數變化則是隨著培養時間增加而 增加，但第 6 天到第 11 天之間增加並不明顯，藻數增加最明顯的 是空氣流量 2.0 L/min，其藻數在第 2 天到第 11 天呈現直線生長，
顯示空氣流量大對於藻類生長有幫助。
圖 4-3 Chlorella sp.在不同空氣流量時，(A) OD683 (B) 藻體乾重
A bsorba nce (cm -1 ) a t 6 8 3 nm
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
0.5 1.0 2.0
Gas flow rate L/min
Incubation time (days)
0 2 4 6 8 10 12
D rie d Bioma ss (g /L )
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
A
B
Reactor volume 4L
圖 4-4 Chlorella sp.在不同空氣流量對應藻數之變化
4-2-2 Chlorella sp.表面性質
圖4-5 為Chlorella sp. 在空氣流量 1.0 L/min 培養下，於不同倍 率光學及電子顯微鏡下所呈現之外觀，由圖中可看出在光學顯微鏡觀 測下Chlorella sp. 呈現圓形，不具鞭毛構造，利用電子顯微鏡觀測發 現藻體細胞璧表面有不規則線條。
圖 4-5 Chlorella sp.於不同倍率下光學顯微鏡圖 (A-1：400X；A-2：
1,000X)及電子顯微鏡圖(B-1:4,500 X；B-2:8,000X) Incubation time (days)
0 2 4 6 8 10 12
Algal cells measureed by epifluorescent microscope (cells/mL)
3.00e+6 5.30e+7 1.03e+8 1.53e+8
2.03e+8 0.51.0
2.0
Gas flow rate L/min Reactor volume 4L
圖 4-6 為不同空氣流量及天數培養下 Chlorella sp. 藻體之 EEFM 圖，其乃利用藻水之 EEFM 圖扣除藻水以 0.45m 過濾所得之過濾液 的 EEFM。圖中顯示，三種空氣流量培養下之 Chlorella sp.，均在 EX/EM 280/330 nm 出現波峰，根據 Chen et al .(2003)利用三維螢光光 譜圖中激發與發射波長對應位置將有機物區分為五大類：第 I 類為 EX (激發波長) < 250 nm，EM (發射波長) < 330 nm，屬芳香型之蛋白 質 (Aromatic protein)酪胺酸；第 II 類 EX < 250 nm，EM 在 320-380 nm，屬芳香型之蛋白質 (Aromatic protein)與 BOD5有關之物質；第 III 類 EX < 250 nm，EM > 350 nm，屬黃酸 (fulvic acid)物質；第 IV 類 EX 在 250-280 nm，EM < 380 nm，屬於溶解性微生物代謝物質 (Soluble Microbial by-product-like)；第 V 類 EX > 280 nm，EM > 380 nm，屬似腐植酸 (Humic Acid-Like)物質，EX/EM 280/330 nm 屬於溶 解性微生物代謝物質(Soluble microbial by-product-like)，不同空氣流 量培養其波峰強度皆隨培養時間增加而增加，在第 6 天達到最大值而 到第 11 天強度值又下降，培養第 2 天空氣流量 2.0 L/min 的強度值 5,562 為最高，空氣流量 0.5 及 1.0 L/min 的強度值分別為 4,846 和 5,031，
第 6 天波峰強度值最高是空氣流量 0.5 L/min 的強度值 6,739 ，空氣 流量 2.0 L/min 的強度值 6,160 次之，空氣流量 1.0 L/min 為 6,001，
三者差異不大，第 11 天時空氣流量 1.0 L/min 強度值 2,748 為最低，
其餘 2 種流量分別為 3,946、3,807 差異不大。
圖 4-6 Chlorella sp.在不同空氣流量(A) 0.5 (B) 1.0 (C) 2.0 L/min 及天 數(1)0 (2)2 (3)6 (4)11 days 培養下藻體之 EEFM 圖
0 100 200 300 400 500 600 700
0 1000 2000 3000 4000 5000
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Emission (nm)
300 350 400 450 500 550
0 500 1000 1500 2000 2500
0 100 200 300 400 500 600
0 1000 2000 3000 4000 5000
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
300 350 400 450 500 550
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
200 250 300 350 400
0 100 200 300 400 500 600
200 250 300 350 400
0 1000 2000 3000 4000
Exci tation (nm)
200 250 300 350 400
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
300 350 400 450 500 550 200
250 300 350 400
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
A-2
A-1 B-1
B-2
C-1
C-2
B-3 C-3 A-3
A-4 B-4 C-4
圖 4-7 是 Chlorella sp. 藻體之總螢光強度值及各類有機物平均 螢光強度百分比，三種空氣流量的總螢光強度值皆隨培養天數增加而 增加，在第 6 天達到最大值，空氣流量 0.5 L/min 的強度值 3230 為 最高 ，而第 11 天強度值則下降，空氣流量 2.0 L/min 的強度值 2191 為最高，在五類有機物平均螢光強度部分，第 I 類有機物在三種空氣 流量所佔比例隨天數增加而增加，不同培養天數下所占比例差異不大，
第 II 類有機物在不同天數所佔比例以第 0 天最多，其中以 0.5 L/min 的 29% 最高，第 2 天比例減少，第 6 及 11 天則有些微增加，三種空 氣流量在第 2 、 6 及 11 天的變化都不大，第 III 類有機物在第 0 天所占比例約 16-21%，三種空氣流量以 0.5 L/min 所佔比例為最高，
但第 2、6 及 11 天所佔比例均小於 6%，第 IV 類有機物則是在五類有 機物中佔最高比例，以第 2 天為最大值，三種空氣流量以空氣流量 0.5L/min 含有 69% 為最高，其次為 2.0L/min ，第 IV 類有機物從第 2 天到第 11 天所佔比例會隨時間增加而減少，第 V 類有機物所佔比 例均在 5%以下，由上述結果歸納出，隨著培養天數增加第 I 及 II 類 有機物的比例，第 0 到 2 天會減少，第 2 到 11 天則隨天數增加而增 加，第 III 類有機物的比例則是隨時間增加而減少，第 IV 類有機物所 佔比例，第 0 到 2 天會增加，第 2 到 11 天則是隨天數增加而減少。
圖 4-7 Chlorella sp.在不同空氣流量及天數培養下之總螢光強度值及 各類有機物平均螢光強度百分比變化
Incubation time (days)
Average fluorescence intensity (%)
0 20 40 60 80 100
29
Total AFI
0 1000 2000 3000 4000
V IV III II I
0 2 6 11 0 2 6 11 0 2 6 11
Gas floe rate
(L/min) 0.5 1.0 2.0
15 17 19
25 14 18
19 28
14
17 19 21
19 16
30
69 62
57 37
62 60 57 41
66 60 53
Her et al. (2004) 利用研磨、超音波震盪、浸泡甲醇等不同萃取 方式，比較藻體中葉綠素萃取效果之差異性，發現 Chlorophyll a 在 EX278-593/EM673 nm 有波峰，陳氏(2007)配製 Chlorophyll a 標準 品進行 EEFM 測定，發現共有 4 個波峰，激發波長分別為 390、
440、580 與 620 nm，發射波長均為 670 nm；Chlorophyll c2，則於 450/630 出 現 單 一 波 峰 19´-Hex-fucoxanthin 則 僅 有 一 波 峰 位 置 (410/660 nm)，Zeaxanthin 有 4 個位置 410/660、460/650、510/660 與 540/660 nm， prasionxanthin 則有 620/660 與 430/660 nm 二波峰。
圖 4-8 可看到在 EX 440、480 及 620 nm /EM 680 nm 處皆出現明顯波 峰，與陳氏(2007) 研究結果相呼應，屬於葉綠素 a(chlorophyll a)。
將 圖 4-8 的 波 峰 區 分 為 EX 400-530 及 540-630 nm 固 定 EM 650-750 nm兩個區塊，將兩個區塊的平均螢光強度所佔比例繪製如圖 4-9 (A-1、B-1及C-1)，由圖可看出第 0 及 2 天在EX 400-530 nm 所 佔比例較高，第 6 及 11 天則是EX 540-630 nm 所佔比例較高，而 兩個區塊相加之總螢光強度則繪製成圖4-9 (A-2、B-2及C-2)，總螢光 強度隨培養天數增加而增加，且空氣流量 2.0 L/min 強度值最高。
圖 4-8 Chlorella sp.藻體於不同空氣流量(A) 0.5 (B) 1.0 (C) 2.0 L/min 及天數(1)0 (2)2 (3)6 (4)11 days 培養下對應高激發及高發射之 EEFM 圖
400 450 500 550 600
A-1 A-2 A-3 A-4
400 450 500 550 600
B-1 B-2 B-3 B-4
0 20 40 60 80 100
0 100 200 300 400
0 100 200 300 400 500 600 700 800
0 100 200 300 400 500 600 700
0 20 40 60 80 100
0 100 200 300
0 100 200 300 400 500 600 700 800
0 100 200 300 400 500 600
650 700 750
400 450 500 550 600
650 700 750 650 700 750650 700 750
C-1 C-2 C-3 C-4
Emission (nm)
0 20 40 60 80 100
0 100 200 300 400
0 100 200 300 400 500 600 700 800
0 100 200 300 400 500 600 700 800
圖 4-9 Chlorella sp.在不同空氣流量(A) 0.5 (B) 1.0 (C) 2.0 L/min 及天 數 培 養 下 (1) 平 均 螢 光 強 度 (2) 總 螢 光 強 度 變 化 (EX400-630/EM650-750 nm)
0 20 40 60 80 100
400-530 540-630
0 100 200 300 400 Excitation (nm)
Average fluorescence intensity (%)
0 20 40 60 80 100
Total Average fluorescence intensity
0 100 200 300 400
0 20 40 60 80 100
0 100 200 300 400
0 2 6 11 0 2 6 11
Incubation time (days)
A-1 A-2
B-1 B-2
C-1 C-2
利用 FTIR 分析不同空氣流量培養 Chlorella sp.藻體表面官能基 變化之圖譜如圖 4-10 所示，藻體表面官能基包括有 OH 基(3470 cm
-1 )、CH2基(2925 cm -1 )、AmideΙ(C=O)基(1652 cm -1 )、AmideⅡ(N-H) 基(1542 cm -1 )、羧酸(C=O) (1245 cm -1 )及多醣體(1130-1160cm -1 )等，
與 邱 氏 (2007) 研 究 三 種 藻 Chlorella vulgaris 、 Chodatella sp.
Microcystis sp.之藻體官能基變化，分析結果一致，上述官能基主要由
多醣體和蛋白質所構成，不同空氣流量對藻體官能基變化影響不大，但高空氣流量 OH 基和 CH2基之穿透率較差，羧酸和多醣體官能基 穿透率較佳，低空氣流量則相反之。
圖 4-10 不同空氣流量培養 Chlorella sp.藻體之 FTIR 圖譜
圖 4-11 是不同空氣流量培養 Chlorella sp. 藻體界達電位的變化 圖，三種空氣流量培養的起始值約為 -16.5 mV，培養第 2 天時電位 變化分別為-16.4 及-17 mV，第 6 天時空氣流量 1.0 L/min 的藻體電位 約為-15.5 mV 較其他兩種空氣流量為高，但到第 11 天時三種空氣流 量的藻體電位均在-17 到-18 mV 之間，結果顯示藻體電為均介於-15 到-18 mV 之間，空氣流量不會對藻體電位造成太大變化。
Wavelength number (cm
-1)
400 900 1400 1900 2400 2900 3400 3900
Transm it tance
0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
0.5 1.0 2.0 Gas flow rate L/min
3470 cm-1 2925 cm-1
1542 cm-1
1652 cm-1
1245 cm-1 1115 cm-1
617 cm-1
圖 4-11 Chlorella sp.在不同空氣流量及天數培養下，藻體界達電位之 變化
張氏(2006) 研究發現藻體經激發螢光照射後會產生自發性螢光，
藻類持續曝光於激發螢光下，產生自發性螢光顏色之變化，可發現激 發螢光照射時間越長，顏色亦會有所變化及強度衰減之現象發生，顯 示自發性螢光物質亦會被消耗或破壞。為瞭解Chlorella sp.之自發性 螢光在不同空氣流量培養過程中是否有衰變之現象，利用Image ProPlus 5.0影像分析軟體配合影像擷取器進行藻體螢光影像拍攝，選 取 20 個視野平均藻數約在 30-100 個，將螢光影像(圖4-12(A))透過 影像分析軟體轉換為灰階(圖4-12(B))，在進行計算每個藻體發出之螢 光強度值， 取其平均值。結果繪製如圖 4-13。圖中顯示 Chlorella sp.
在培養期間之螢光強度值，第0及2天時以0.5 L/min強度值最高，隨著 培養時間增加到第 6 天時 2.0 L/min最高，到第11天三種空氣流量的 螢光強度相差不多。顯示空氣流量對於藻體自發性螢光並無太大影 響。
Incubation time (days)
0 2 4 6 8 10 12
Z eta p o ten tia l ( mV )
-30 -25 -20 -15 -10 -5 0
0.5 1.0 2.0
Gas flow rate L/min
Reactor volume 4L
圖 4-12 Chlorella sp.之(A)螢光顯微鏡觀測圖(B)灰階圖(空氣流量 1.0 L/min 培養 6 天)
Incubation time (days)
Auto flu ores cenc e
0 50 100 150 200 250
0.5 1.0 2.0
0 2 6 11
Gas flow rate (L/min)
圖 4-13 Chlorella sp.在不同空氣流量及天數培養後，藻體自發性螢光 強度值之變化
A B
4-2-3 釋出液有機物性質
圖 4-14 為 Chlorella sp.在不同空氣流量培養時，第 0 及 11 天 NPDOC 變化量，由圖中可看出 NPDOC 值明顯增加，Chlorella sp. 在 培養過程中釋出許多有機物，但 NPDOC 值僅能看出有機物釋出總量，
無法得知有機物的性質，為要瞭解 Chlorella sp. 在培養過程中釋出有 機物性質，將在下面章節進行有機物性質探討。
圖 4-14 Chlorella sp.在不同空氣流量培養下，初始及最終期間 NPDOC 值之變化
Gas flow rate (L/min)
N PD OC ( mg /L)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 11
Incubation time (days)
0.5 1.0 2.0
圖 4-15 為不同空氣流量培養 Chlorella sp.藻水經 0.45μm 過濾所 得過濾液在不同天數 EEFM 變化圖，由圖中可看出初始的 Chlorella sp.
過濾液(A-1、B-1 及 C-1)，出現一個波峰位於 EX280/EM330 nm，屬 於溶解性微生物代謝物質(Soluble microbial by-product-like)，培養到 第 2 天時開始出現 EX410-420/EM460 nm 及 EX260-270/EM450-460 nm 都屬於似腐植質(humic-like)，第 6 天出現的波峰與第 2 天相同，
強度有增加的趨勢，而培養到第 11 天時會增加 EX330-350/EM410-420 nm 屬於似腐植質(humic-like)。
蔣鳳華等(2008) 培養中肋骨條藻，利用 EEFM 分析溶解性有機 物三維螢光特徵，激發和發射之間距(interval)與光柵(slit)寬度均為 5 nm，發現波峰 S (Ex = 230～240 nm / Em = 330～ 360 nm)、A (250
～ 275 nm / 445～ 480 nm) 、T (275～ 285 nm / 345～ 360 nm) 和 C ( 345～355 nm / 440～ 450 nm) 的強度都有不同程度的增加，進入 衰減階段後，類蛋白螢光峰 S 和 T 的強度繼續增加，達到最大值 後逐漸下降，類腐植質螢光峰 A 和 C 的強度一直增加。在不同空 氣流量培養 Chlorella sp. 的釋出液，第 0 天出現的波峰位置與 T 峰相 近，第 2 天開始出現的似腐植質波峰則與 A 峰相近，第 11 天增加 EX 330-350/EM 410-420 nm 則是與 C 峰相近，波峰強度增強趨勢也與文 獻相呼應，類蛋白螢光峰的強度值在第 6 天達最大值後，第 11 天的 強度值呈現下降，這是由於藻類生長過程中分泌少量類蛋白有機物，
藻細胞死亡後分解釋放出類蛋白有機物，因此培養液中類蛋白螢光峰 強度增加，強度降低則是因為類蛋白物質以分解為主，而類腐植質的 螢光峰強度則是持續增強，且會增加波峰，腐植質是細菌利用藻體分 泌有機物過程中的產物，在初始階段藻類分泌的有機物較少，因而腐 植質增加比較緩慢，在類蛋白有機物明顯增加以後，類腐植質也開始 增加。