大仁科技大學環境管理研究所
碩士學位論文
不同培養條件對光生物反應器中 Chlorella sp.物化性質之影響
Effects of incubated conditions on the physicochemical properties for Chlorella sp. grown in photo-bioreactor
指 導 教 授 ：賴 文 亮 博士
研 究 生：何 曉 蓉
中 華 民 國 一 0 二 年 七 月
摘要
本研究利用自行設計之光生物反應器培養 Chlorella sp.，反應槽 屬聚丙烯(Polypropylene, PP)材質之圓柱體 ( 13cmH 65 cm)，並利 用日光燈光源控制光照強度在 1,700 Lux，光反應時間為 12 小時，並 變換 3 種氣體流速與添加爐石，探討生物質體表面特性及藻體釋出有 機物性質之變化，前者利用傅立葉轉換紅外線光譜(Fourier transform infrared spectroscopy , FTIR)、表面電位測定儀、環境電子顯微鏡 (Environmental Scanning Electron Microscope, ESEM)、螢光顯微鏡，
後者則是利用 UV-Vis 與螢光激發發射光譜儀 (excitation emission fluorescent matrix , EEFM)，另 HPSEC (high performance size exclusion chromatography) +DAD(diode array detector)系統可測定溶解性有機物 之分子量大小。
實驗結果顯示，生物質體 OD683 及藻體乾重隨空氣流量增加而 增加；在固定氣體流量下，轉爐石量會抑制生物質體之產量，但隨轉 爐石量增加時，此抑制現象愈不明顯。不同空氣流量下，Chlorella sp.
藻體表面電荷介於-15 到-18 mV 之間，但添加不同轉爐石量，藻體表 面之負電性隨轉爐石量之增加而趨向正值。Chlorella sp.藻體在不同 空氣流量培養，表面上的官能基分別為羥基、胜肽鍵、羧酸和多醣體 為主，但添加轉爐石後，多醣體官能基之透光率有減少。藻體的自發 性螢光強度，對有添加轉爐石者高於未添加者。在藻體部分發現 EX 280/EM 330 nm (protein-like)和 EX 440-480/680 nm (pigment) 兩類波 峰，而添加轉爐石後，螢光強度隨添加量增加而減少。
至於藻類在不同空氣流量及轉爐石量對釋出有機物性質之影響，
在不同空氣流量下，似蛋白質(protein-like)及似腐植質(huimc-like)成 份均被發現，其含量(螢光強度值)隨氣體流量之增加而減少，在添加 轉爐石後，兩種物質的螢光強度都以添加 670 mg/L 為最高；分子量 大小，以 102-103 Da 為主，在添加轉爐石後，分子量之變化隨培養天 數增加向大分子移動；固碳效率則是氣體流量越小固碳率越高，在添 加轉爐石後，不利於固碳效率之提昇。
關鍵字: 光生物反應器；螢光激發發射光譜；分子量；固碳效率
Abstract
In this study, photobioreactor with 4 L of volume to cultivate
Chlorella sp. was conducted for comparing the variations between algal
surface and released organic matter while air gas flow rate and basic oxygen furnace slag were respectively changed. All experiments were controlled at light reaction of 12 hrs. with 1,700 lux. Also, the organic fluorescence of algae, expressed in excitation emission fluorescent matrix (EEFM), was obtained from the deduction of algal solution by the filtrate obtained from the 0.45m membrane filtration of algal solution.
Also, the surface charge and functional group were respectively measured by zeta meter and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). As for the molecular weight of dissolved organic matter, it was measured by hybrid system of HPSEC (high performance size exclusion chromatography) plus DAD (diode array detector).
Biomass expresses by the absorbance value at 683 nm (OD 683) or dried biomass reveals that photobioreactor operated in high flow rate produced more increase of biomass than low flow rate. Algal growth was inhibited by addition of basic oxygen furnace slag as the air gas flow rate was constantly compared. However, high amount of basic oxygen furnace slag (BOFS) could promote more algal biomass than low amount of basic oxygen furnace slag. Without addition of basic oxygen furnace slag, the surface electricity of algae was ranged from -15 to -18 mV. Higher amount of BOFS could alter the algal electricity from negative to positive.
It may be attributed from metal ions released from BOFS adsorbed on surface of algae. Chlorella sp. cultured at different air flow on the surface functional groups are hydroxyl, peptide bond, carboxylic acids and polysaccharides based, but the addition of BOFS reduces transmittances polysaccharide functional groups. Auto fluorescent intensity of Chlorella sp. with BOFS was higher than that without BOFS. Regarding to the organic fluorescent characteristic for Chlorella sp., two peaks location
were appeared in EX 280/EM 330 nm (protein-like) and EX 440-480/
680 nm (pigment). The more amounts of BOFS, the more decrease of fluorescence intensities in both peaks were found.
The released organic compounds from Chlorella sp. at different gas flow rates and BOFS, like protein (protein-like) and the like humus (huimc-like) components were measured from EEFM. Both fluorescent intensities decreased with the increasing air flow rate. The sutibale additiuon of BOFS could result in the increase of fluorescent intensities in both peaks than without BOFS. Regarding to molecular weight cut-off for released organic matter, its size was mainly located to 102-103 Da.
After the addition of BOFS, the change of molecular weight was shifted from low fraction into high fraction, especially in longterm cultivation.
For carbon fixation efficiency (CFE) , high air gas flow rate was less than low air gas flow rate. The addition of BOFS is not beneficial for the increase of CFE；however, CFE in higher amount of BOFS was larger that that in lower amount of BOFS.
Keywords : Photobioreactor ；Excitation emission fluorescent matrix
(EEFM)；Molecular weight ; Efficiency of carbon fixation誌謝
碩士論文得以完成，首先感謝恩師賴文亮教授給予學生最大幫助，
在實驗室這麼多年，老師的研究態度、創新思考及行動力，讓學生有 著深刻印象在心中，感謝老師為我打下基礎，幫助我不斷茁壯成長，
給予我許多從沒想過的機會與體驗，讓我在實驗室的生活多采多姿，
如今我將往另一個階段前進，在老師實驗室的點滴回憶將成為我心中 最大的奠基石，讓我繼續向上建造。
此外，亦感謝本校陳振正博士與國立中山大學高志明教授，在百 忙之中抽空給於論文的建議與指正，使得論文更加完整。
論文進行期間，感謝書豪學長、博名學長、建立學長、上權學長、
靜雯學姊，學弟聖閔、明遠於論文及實驗上，給予協助與建議。同時 感謝同學鈺鉦、威翰、冠文、明翰，同儕間的關心、支持與鼓勵，謝 謝你們。另外感謝 U610 實驗室的育儒學長、雅萍學姊，還有學弟右 良、憲庭、柏樺、學妹湘嵐，大家一起生活的點滴回憶，還有在實驗 上的協助，獻上感恩。
最後，特別感謝奶奶、父母親及姊姊。謝謝你們讓我自由發展，
快樂的生活學習，給予我信心支持與鼓勵，讓我碩士生涯順利結束。
僅以本論文獻給以上協助我的人，表達無盡感謝之意。
目錄
摘要 ... I Abstract ... II 誌謝 ... IV 目錄 ... V 圖目錄 ... VIII 表目錄 ... XI
第一章 前言... 1
1-1 研究背景………... 1
1-2 研究目的………... 2
第二章 文獻回顧 ... 3
2-1 藻類基本介紹……….. 3
2-1-1 藻體表面性質...……… 3
2-1-1-1 螢光特性………...3
2-1-1-2 帶電性……….5
2-1-2 影響藻類生長因素……… 5
2-1-3 藻類培養系統………7
2-1-3-1 開放式養殖系統………..7
2-1-3-2 密閉式養殖系統………..7
2-2 二氧化碳控制方法………..………...8
2-2-1 化學性………..………..8
2-2-2 物理性………..………..8
2-2-3 生物性………..………..8
2-3 藻體之固碳機制及釋出有機物………10
2-3-1 固碳機制………..…………...10
2-3-2 各種微藻可利用之碳源………..11
2-3-3 色素………..………...12
2-3-4 藻類有機物之釋出………...13
2-4 螢光光譜在有機物量測之應用………....14
第三章 研究架構、系統及實驗分析方法 ... .17
3-1 研究架構………..……….……17
3-2 實驗方法………..……….……17
3-2-1 藻種之選擇與批次培養……….……..17
3-2-2 光生物反應器設置……….…....19
3-3 參數分析………..………...20
3-3-1 基本環境及水質參數……….. 20
3-3-1-1 溫度、pH、溶氧………..20
3-3-2 藻類外觀觀測、計數、含碳量測定與二氧化碳固定能 力……….. ……...………..20
3-3-2-1 電子顯微鏡之觀測………20
3-3-2-2 光學顯微鏡觀測及藻體計數………....21
3-3-2-3 藻體自發性螢光強度………....22
3-3-2-4 藻體界達電位………....22
3-3-2-5 生物質量(Biomass)………23
3-3-2-6 藻體乾重之含碳量………23
3-3-2-7 固碳量之計算………....24
3-3-3 有機性參數………..……...24
3-3-3-1 紫外光及可見光譜儀(UV-Vis Spectrophotometer) ………... ….24
3-3-3-2 螢光激發發射光譜(Excitation Emission Fluorescence Matrix,EEFM)………...25
3-3-3-3 非揮發性溶解性有機碳(Non-Purgeable Dissolved Organic Carbon, NPDOC)………...26
3-3-3-4 有機物分子量(Molecular weigth)………27
3-3-3-5 藻體表面官能基測定……….…28
第四章 結果與討論 ...29
4-1 Chlorella sp.之可見光波長吸收值及對應藻體質量 29 4-2 空氣流量對 Chlorella.sp 藻體特性及釋出有機物性質之影響 ……….. ……...………30
4-2-1 Chlorella sp. 生長速率 ………30
4-2-2 Chlorella sp.表面性質 ………..33
4-2-3 釋出液有機物性質 ……….. …43
4-3 不同轉爐石重量對 Chlorella sp.藻體特性及釋出有機物性質 之影響 ……….. ……...………54
4-3-1 添加轉爐石對 Chlorella sp. 生長速率變化 …………..54
4-3-2 添加轉爐石對 Chlorella sp. 藻體特性變化 …………..57
4-3-3 釋出液之有機物性質 ………..67
4-4 固碳量之計算 ……….. ……...…78
第五章 結論與建議 ... 81
5-1 結論 ……….. ……...…………...81
5-2 建議 ……….. ……...…………....82
參考文獻 ... 83
作者簡介 ... 89
圖目錄
圖 2-1 螢光染劑之激發光與釋放光頻譜圖 ... 4
圖 2-2 pH 對碳型態分佈之影響 ... 11
圖 3-1 研究架構圖 ... 18
圖 3-2 光生物反應系統圖 ... 19
圖 3-3 分子量與停滯時間關係圖 ... 28
圖 4-1 Chlorella sp.在可見光吸收波長 550-800 nm 之對應吸收值 .. 29
圖 4-2 Chlorella sp.在 683 nm 與 Biomass 之對應曲線 ... 30
圖 4-3 Chlorella sp.在不同空氣流量時，(A) OD683 (B) 藻體乾重 ... 32
圖 4-4 Chlorella sp.在不同空氣流量對應藻數之變化 ... 33
圖 4-5 Chlorella sp.於不同倍率下光學顯微鏡圖 (A-1：400X；A-2： 1,000X)及電子顯微鏡圖(B-1:4,500 X；B-2:8,000X) ... 33
圖 4-6 Chlorella sp.在不同空氣流量(A) 0.5 (B) 1.0 (C) 2.0 L/min 及天 數(1)0 (2)2 (3)6 (4)11 days 培養下藻體之 EEFM 圖 ... 35
圖 4-7 Chlorella sp.在不同空氣流量及天數培養下之總螢光強度值及 各類有機物平均螢光強度百分比變化 ... 36
圖 4-8 Chlorella sp.藻體於不同空氣流量(A) 0.5 (B) 1.0 (C) 2.0 L/min 及天數(1)0 (2)2 (3)6 (4)11 days 培養下對應高激發及高發射之 EEFM 圖 ... 38
圖 4-9 Chlorella sp.在不同空氣流量(A) 0.5 (B) 1.0 (C) 2.0 L/min 及天 數培養下(1)平均螢光強度 (2)總螢光強度變化 (EX400-630/EM650-750 nm) ... 39
圖 4-10 不同空氣流量培養 Chlorella sp.藻體之 FTIR 圖譜 ... 40
圖 4-11 Chlorella sp.在不同空氣流量及天數培養下，藻體界達電位之 變化 ... 41
圖 4-12 Chlorella sp.之(A)螢光顯微鏡觀測圖(B)灰階圖(空氣流量 1.0 L/min 培養 6 天) ... 42
圖 4-13 Chlorella sp.在不同空氣流量及天數培養後，藻體自發性螢光 強度值之變化... 42 圖 4-14 Chlorella sp.在不同空氣流量培養下，初始及最終期間 NPDOC
值之變化 ... 43 圖 4-15 Chlorella sp.釋出液在不同空氣流量(A) 0.5 (B) 1.0 (C) 2.0 L/min 及天數(1)0 (2)2 (3)6 (4)11 days 之 EEFM 圖 ... 45 圖 4-16 Chlorella sp.釋出液在不同空氣流量及天數培養後，總螢光強 度值及各類有機物平均螢光強度百分比 ... 46 圖 4-17 Chlorella sp.在不同空氣量培養下藻水過濾液 (A)腐植化指數 (Humification index, HIX)；(B)生物指數(Biological index, BIX)；
(C)F450/F500 指數 ... 48 圖 4-18 不同培養天數 Chlorella sp.經 0.45μm 過濾液 UV-VIS 吸收光 譜圖(A) 0.5 (B) 1.0 (C) 2.0 L/min ... 51 圖 4-19 Chlorella sp.在不同空氣流量及天數培養下，藻水過濾液 之 (A)URI；(B)UV280；(C)UV253/ UV 203 值變化 ... 52 圖 4-20 Chlorella sp.在不同空氣流量(A) 0.5 (B) 1.0 (C) 2.0 L/min 及天 數培養過程中水相溶解性分子量大小變化 ... 53 圖 4-21 Chlorella sp.在不同爐石添加量時，(A) OD683 (B) 藻體乾重 ... 55 圖 4-22 Chlorella sp.在不同爐石添加量時對應藻數變化 ... 56 圖 4-23 Chlorella sp.添加爐石培養 ESEM 觀測圖(A:20,000 X；
B:5,000X) ... 57 圖 4-24 不同爐石添加量對藻水之 pH 之影響 ... 58 圖 4-25 不同爐石添加量對藻體表面含不同元素量百分比之比較 .... 58 圖 4-26 Chlorella sp.在不同爐石添加量(A) 300 (B) 670 (C) 1200 mg/L 培養下於不同天數(1)0 (2)2 (3)6 (4)11 days 藻體之 EEFM ... 60 圖 4-27 Chlorella sp.在不同爐石添加量及天數培養下之總螢光強度值 及各類有機物平均螢光強度百分比變化 ... 61 圖 4-28 Chlorella sp.於不同爐石重量(A) 300 (B) 670 (C) 1200 mg/L 及 不同天數(1)0 (2)2 (3)6 (4)11 days 培養下藻體對應高激發及高發射之 EEFM ... 63 圖 4-29 Chlorella sp.在不同爐石添加量(A) 300 (B) 670 (C) 1200 mg/L 及天數培養下 (1)平均螢光強度(2)總螢光強度變化
(EX400-630/EM650-750 nm) ... 64
圖 4-30 不同爐石重量培養 Chlorella sp.藻體之 FTIR 圖譜 ... 65 圖 4-31 Chlorella sp.在不同爐石添加量及天數培養下界達電位變化 66 圖 4-32 Chlorella sp.在不同爐石添加量及天數培養後，藻體自發性螢 光強度值之變化 ... 67 圖 4-33 Chlorella sp.在不同爐石添加量培養下，初始即最終期間 NPDOC 值之變化 ... 67 圖 4-34 Chlorella sp.釋出液在不同爐石添加量(A) 300 (B) 670 (C) 1200 mg/L 及天數(1)0 (2)2 (3)6 (4)11 days 之 EEFM 圖 ... 69 圖 4-35 Chlorella sp.釋出液在不同爐石添加量及天數培養後，總螢光 強度值及各類有機物平均螢光強度百分比 ... 70 圖 4-36 Chlorella sp.在不同爐石添加量培養下藻水過濾液 (A)腐植化 指數(Humification index, HIX)；(B)生物指數(Biological index, BIX)；
(C)F450/F500 指數 ... 72 圖 4-37 不同培養天數 Chlorella sp.經 0.45μm 過濾液 UV-VIS 吸收光 譜圖(A) 300 (B) 670 (C) 1200 mg/L ... 75 圖 4-38 Chlorella sp.在不同爐石添加量及天數培養下，藻水過濾液之 (A)URI；(B)UV280；(C)UV253/UV203 值變化 ... 76 圖 4-39 Chlorella sp.在不同爐石量(A) 300 (B) 670 (C) 1200 mg/L 及天 數培養過程中水相溶解性分子量大小變化 ... 77 圖 4-40 空氣流量對 Chlorella sp.固定二氧化碳百分比之影響 ... 79 圖 4-41 不同爐石添加量對 Chlorella sp. 固定二氧化碳百分比之影響 ... 80
表目錄
表 2-1 常用螢光染劑資料 ... 4
表 2-3 不同藻種對無機碳型態利用之差異 ... 12
表 3-1 Chlorella sp. 營養鹽濃度 ... 17
表 3-2 掃瞄式電子顯微鏡之操作條件 (S-2500, Hitachi, Japan) ... 21
表 3-3 紫外光及可見光譜儀參數設定值 ... 25
表 3-4 EEFM 之操作參數設定值 ... 26
第一章 前言
1-1 研究背景
Chlorella sp. 是一種常見的綠藻類，生長速率快可在多元環境生
長，藻體含有多醣體、蛋白質、脂質等物質，可製成保健食品、飼料，近年來也被開發利用於產製生質酒精、柴油，微藻在生長過程中需要 碳源供給，利用微藻來固定二氧化碳，並進行藻體後續再利用之開發，
可提昇整體再利用之經濟價值，然而本研究團隊在過去執行之產業合 作計畫，發現爐石對於微藻生長及煙氣中二氧化碳之固碳效能可能有 所助益，但由於現場之物理及化學因子無法有效控制，故無法真正評 估爐石對微藻固碳效能，基於上述理由，若能將爐石對於微藻生長有 助益的因素找出，開拓爐石再利用之另一市場，並有效提昇微藻固定 二氧化碳效能，對於工業之綠色發展是有正向幫助。
過去針對 Chlorella sp.的成份及營養價值已有許多研究，藻體在 培養過程中可能會釋出有機物質，而藻體性質變化或其釋出有機物會 影響微藻採薄膜收集上的困難，然卻少見文獻針對藻類培養過程物化 性質變化之研究，因此實驗室建立之快速及簡便之螢光光譜分析設備 進行藻體及釋出液有機物特性之比較，應可提供未來培養液回收再利 用及藻體收集之效能。
至於藻體之培養，兩種培養系統，包括開放式系統及密閉式光生 物反應器，但以密閉式之反應器因具污染風險較低，可有效控制變量，
因此本研究室透過自行設計開發之密閉式光生物反應器，作為培養
Chlorella sp.之反應器，進行各項研究目的，其說明如下小節。
1-2 研究目的
本研究探討空氣流量及轉爐石量對於 Chlorella sp.生長之表面物 化特及釋出有機物性質影響，可透過傅立葉轉換紅外線光譜(Fourier transform infrared spectroscopy , FTIR)、表面電位測定儀、環境電子顯 微鏡(Environmental Scanning Electron Microscope, ESEM)、螢光顯微 鏡，後者則是利用 UV-Vis 與螢光激發發射光譜儀 (excitation emission fluorescent matrix , EEFM)，另 HPSEC (high performance size exclusion chromatography) +DAD(diode array detector)進行討論說明，並預期得 到如下結果；
(1) 瞭解空氣流量及轉爐石量對藻體表面電性、有機物螢光 特性及表面官能基之差異性。
(2) 瞭解空氣流量及轉爐石量對藻體釋出液中有機物性質與 分子量大小之影響。
(3) 瞭解空氣流量及轉爐石量對藻體固碳效能之差異性。
第二章 文獻回顧
2-1 藻類基本介紹
藻類是最原始植物，大部分藻類主要生存於水體環境之中，如淡 水、半鹼水及海水水域。藻類在水域生態系統為最基層之生產者，除 了提供水中溶氧以外，藻類亦是水中底層生物之重要食物來源。人類 會直接攝取藻類或其加工品作為食物與藥物來源，故對人類經濟發展，
有重大的貢獻。
藻類依細胞結構不同可則分成兩類，一為原核 (Procaryotic)藻 類，另一為真核 (Eucaryotic)藻類。原核藻類細胞其胞器(Organelles) 缺 乏核膜 包覆，如 細胞核 (Nuclei)、 葉綠體 (Chloroplast)、 粒腺 體 (Mitochondria)、高基氏體(Golgi body)等，藍綠藻(Blue-green algae)便 是原核藻類其中代表，其餘藻類皆屬真核藻類。真核藻類細胞胞器是 被細胞壁包圍著，內有許多胞器，其中之一為細胞核，核內有染色體 與核液，核外由兩層膜包覆，為基因遺傳中心。葉綠體亦由兩層膜包 覆著，葉綠體有類囊體(Thylakoids)負責光合作用，而外圍細胞壁主 要成分為聚醣類(Polysaccharide)與纖維素(Cellulose)，其中聚醣類部分 是 由 高 基 氏 體 分 泌 而 來 ， 細 胞 壁 之 內 有 一 層 原 生 質 膜(Plasmalemma)，原生質膜主要作用為控制原生質之進出，
原生質大多是一種蛋白質膠體合成物。
小球藻 (Chlorella sp.) 對環境的適應性強，營養豐富，多用於 培 養 輪 蟲 。 小 球 藻 在 分 類 上 屬 於 綠 藻 門 (Chlorophyta) ， 綠 藻 綱 (Chlorophyceae) ， 綠 球 藻 目 (Chlorococcales) ， 卵 囊 藻 科 (Oocystaceae) ，綠藻類 (Chloreceae) 。其外形特徵多為球形或廣 橢圓形、無鞭毛或纖毛 (森若與齊, 1996) 。
2-1-1 藻體表面性質 2-1-1-1 螢光特性
螢光是一種藉著分子吸收某物質或能量後，所產生的自發光。螢 光物質(螢光染劑)受到較短波長( FITC：激發波長~488nm)和足夠能量
的光所激發，當回到穩態的能階時，會釋放出較長波長的螢光(如 FITC：螢光~520nm)如圖 2-1。表 2-1 為常用螢光染劑資料表。自體 螢光(Auto-fluorescence)又稱為主要螢光(Primary fluorescence)，是在 未加螢光染劑之前題下，觀測物本身也能自發性地產生螢光之現象。
一般此種螢光會影響實際要觀察的樣品，或者其自體螢光會干擾或覆 蓋實際要觀察的螢光，讓我們無法真正的判定螢光產生的物質及部位。
所以利用特定之螢光染劑來表現特定的物質與部位，而此種由染劑所 釋出的螢光，我們一般稱之為次級螢光(Secondary fluorescence)。螢 光物質(螢光染劑)受到較短波長的光及足夠的能量所激發，當要回到 穩態的能階時，會釋出較長波長的螢光，非螢光物質則成為黑色的背 景。(王淳弘,2007)
圖 2-1 螢光染劑之激發光與釋放光頻譜圖 (顏毅廣,2004) 表 2-1 常用螢光染劑資料 (顏毅廣,2004)
Fluorochrome
Excitation Wavelength(nm)
Emission Wavelength(nm)
Suggested Laser Wavelength(nm)
Suggested Laser
Calcium Green 505 530 488 or 514 Ar;Ar-Kr
Cyanine Cy3 575 605 568 Kr;Ar-Kr
Cyanine Cy5 640 705 632 or 647 HeNe;Ar-Kr
DAPI 345 475 325 or 345 ArUV;He-Cd
Fluo3 480 520 488 Ar;Ar-Kr
FITC 490 525 488 Ar;Ar-Kr
Lucifer Yellow 428 540 442 He-Cd;Ar-Kr
Rhodamine 123 540-560 580 532 or 543 Green HeNe
Lichtenthaler et al. (2000) 以 flash-lamp chlorophyll fluorescence imaging system (FL-FIS) 對植物生長過程活性之監測，植物葉面經 FL-FIS 中 Xenon 燈源激發後，透過 UV-A 濾光片 (280-400 nm, λmax = 340 nm) ，擷取葉綠體所需光源波長後，葉綠體在 FL-FIS 呈 現紅色點，再以 CCD-Digital camera 拍取所需之視野，研究者發現 葉綠體經由 Xenon 光源激發後，會有衰退現象之產生，其活性會隨 著燈源照射時間的增加降低活性，在 20 分鐘後其葉綠體的活性由激 發後的紅色亮點轉變為暗點，其也說明了在觀測標的物有此現象時，
須在短時間內完成。
由於葉綠素存在於藻體，在使用螢光顯微鏡觀測藻類之時，更增 添其便利性與非破壞性之優勢， Walker et al. (2002) 亦利用螢光顯微 鏡並選用適合葉綠素波長之濾光片 (exciter filter [band-pass]: BP520–
550, dichroic mirror: DM565, barrier filter [low-pass]:BA580IF) 以及 配合 Digital colour CCD 系統與軟體，對湖水中之藻類進行分類，對 目標物以螢光激發後，測定出 120 種特徵，利用這些特徵經過先前 在電腦所建立之 microalgae database 去比對進行分類統計，其亦提出 若藻體無經過螢光激發，在拍攝過程中無法拍到所需之影像及標的物，
更遑論利用電腦分析及分類，這分析技術及方法亦可對藻類及非藻類 達到分類及鑑定的效能。
2-1-1-2 帶電性
藻類在天然水體中，大多呈現負電性(Bernhardt and Clasen, 1994)，
且因親水性效應(Hydrophilic effects)、立體效應(Steric effects)及靜電 斥力之作用，使藻體於天然水體中成為穩定之生物顆粒(Edzwald, 1993)。此外，部分研究(Clasen et al., 2000；Parent et al., 1996)更發現，
天然水體中藻類表面有吸附腐植質等天然有機物之現象，因而使其性 質更加穩定(陳振正,2005)。
2-1-2 影響藻類生長因素
氮源是構成藻體中的蛋白質、胺基酸、酵素、輔酵素、葉綠素和 細胞膜等重要化合物的必要成份，其比例約佔藻體乾重的7-10%
（Hu,2004），培養基中的營養鹽對於藻類生長有相當程度的重要性，
一般的微藻培養營養鹽包括氮、磷、鐵、矽、鎂和鈉等主要元素與銅、
錳、鋅、鉬和鈷等礦物離子以及維生素等微量元素。
光是微藻固定 CO2過程中最重要的因子，藻類細胞內所含有的葉 綠體無法吸收太微弱的光照強度，因此不會進行光自營生長，此情況 稱之為光限制現象（Photolimition）；而維持藻類生長所需要基本光 照強度，稱為臨界光強度（Light intensity threshold）。太強的光照強 度會導致藻類光合作用效能降低，使細胞所含葉綠體因強光導致損害，
使 藻 類 行 光 合 作 用 的 能 力 降 低 ， 也 就 是 所 謂 的 光 抑 制 現 象
（Photoinhibition）(王智昱,2007)。
一 般 而 言 ， 介 於 380 至 750 nm 的 光 波 長 稱 為 光 合 有 效 輻
（photosynthetically active radiation，PAR），且隨著藻類存有的葉綠 素種類以及含量不同，使得進行光合作用所能吸收的光波長有所差異。
為 探 討 不 同 波 長 色 光 的 光 合 作 用 效 率 ， 德 國 植 物 學 家 Thomas Engelmann 利用稜鏡將光分成不同波長的色光，將之照射綠藻培養系 統，而結果得知紅光區（450-475 nm）和藍紫色光區（630-675 nm）
的光合作用效率較佳 (黃毓涵,2009)。
藻體約含有 40-50 %的碳，若是要生成 1 公斤的藻類細胞，需 要約 1.5-2.0 公斤的二氧化碳以供生長代謝，故碳對於藻類的重要性 可見一般。就自營藻類來說，能利用無機碳源進行生長。溶於水中的 無機碳源，包含 CO2、H2CO3，HCO3-與 CO3-
型態。CO2則是藻類最 普遍也是最通用的碳源。CO2 佔空氣的 0.03 % (v/v)，而且 CO2又不 易溶解於水中，當藻類培養於高濃度的時候，所需碳源也逐漸增加。
所以在藻類培養系統中，常用純 CO2與空氣混合(CO2-enriched air)來 提供藻類充足的碳源(洪志瑞,2007)，因此，CO2量的多寡會影響到藻 類的生長，藻體在高濃度的 CO2裡生長較快，因此高濃度的 CO2是 必要的。但是，CO2濃度過高反而會抑制微藻的生長(超過 10%的 CO2 濃度量)，像是 Chlorella KR-1，顯示出在 5％和 10％的 CO2濃度培養 環境下有最大的生長量，但生長速率在培養於 10％ CO2後，隨著濃 度增加而下降。(吳欣慧,2009) 此外，溫度上升會導致二氧化碳溶解 度下降，使得碳源不足，進而影響光合作用之進行，亦會提升呼吸作
用，淨光合作用效率降低(Pulz,2001)。
2-1-3 藻類培養系統 2-1-3-1 開放式養殖系統
開放式培養系統置於戶外進行，以商業大規模生產為主，以太陽 光為其光源進行培養，培養系統類型包括水道池(Raceway pond)、圓 形池(Circular pond)及階梯池(Cascades pond)等，主要之發展重點在於 防止微藻沉降及提高光利用效率。具操作簡易及較低之操作費用之優 點。 ( Pulz,2001; 葉俊良,2006)
2-1-3-2 密閉式養殖系統
密閉式系統大致分成發酵槽、培養袋、管狀光生化反應器、板式 光生化反應器。目前已有許多密閉式反應器被開發，密閉式系統由透 明物質所製成，故可使光順利通過。反應器特點為具有大的表面積與 體積比(surface-to-volume ratio)，密閉式系統能抵抗污染，提高產率，
可降低後續分離純化所需成本，且培養系統易於控制，穩定性佳。開 放式與密閉式系統優缺點比較整理如 2-2。 (葉俊良,2006)
表 2-2 開放系統與密閉系統之優缺點比較(Pulz,2001)
因子 開放式反應器 密閉式反應器
汙染風險 非常高 低
空間需求 高 低
水分流失 非常高 幾乎沒有
二氧化碳流失 高 幾乎沒有
生質量品質 無法控制 可控制
可培養之藻種 限制於某些藻種 幾乎所有藻種皆適合
可生產之產品 針對單一產品 可變化生產不同產品
生產變數的再現性 不可能 可能
程序控制 不容易 容易
標準化 不可能 可能
氣候 相關 無關
培養所需時間 長，約 6-8 周 短，約 2-4 周
最終生質量 低，約為 0.1-0.2g/L 高，約為 2-8g/L
2-2 二氧化碳控制方法
根 據 聯 合 國 氣 候 變 化 綱 要 公 約 (United Nations Framework Convention on Climate Change, UNFCCC)之建議，解決CO2問題可透 過三個手段來達成：(1) 以提高效率及節約能源手段進行CO2排放量 之控制。(2) 發展低碳、無碳能源取代現有能源。(3) 將產生的CO2
以捕捉及封存之技術，為人類爭取更多的時間，尋求CO2根本性解決 之道。
2-2-1 化學性
CO2化學固定技術主要有以下幾類:1.利用乙醇胺類吸收劑對CO2
進行分離回收；2.CO2與H2、CH4、H2O、CH3OH等反應分別合成甲醇、
C2烴、合成氣、碳酸二甲酯等許多有價值的化學品；3.將CO2置入到 金屬、碳、矽、氫、氧、氮、磷、鹵素等元素組成的化學鍵中，以製 備各種羧酸或羧酸鹽、氨基甲酸酯、碳酸酯、有機矽、有機磷化合物；
4.CO2和環氧化物共聚合成新型CO2樹脂材料。化學固定法常需純的 CO2，而排放的CO2純度一般只有 20 %左右，這就需要昂貴的分離成 本(楊忠華等,2008)。
2-2-2 物理性
目前已知利用物理方式進行二氧化碳固定處理的減量技術，主要 包括將二氧化碳儲存于海洋、地下含水層(Saline Aquifier)、廢棄煤礦 區(Unminable Coal Beds)、耗乏天然氣礦區(Depleted Gas Reserves)和 耗乏原油礦區(Depleted Oil Reserves)等，都具備可進行大規模二氧化 碳儲置能力。然而，從實際儲置觀點而言，不論是採用陸地儲置或海 洋儲置方式，都將面臨適當儲置場址不易獲得，以及大量二氧化碳長 期儲置過程中，其對周遭環境可能造成衝擊的因素無法有效掌握(徐 強,2010)。
2-2-3 生物性
生物方法固定CO2 的基本原理是光合作用，主要包括光合細菌
法、高等植物光合固定法和藻類光合吸收法。
(1)光合細菌
光合細菌是地球上出現最早具有光能生物合成體系的原核生物，
是一類在厭氧條件下進行不放氧光合作用細菌的總稱，光合作用共同 反應式：
CO2+2 H2A →(CH2O) +2A + H2O
其中H2A為光合作用的供氫體，如果光合細菌的供氫體是硫化物 或有機物，則在光合過程中可能產生氧氣，也可能會產生氫氣或其他 產物。
(2)高等植物
根據光合CO2固定方式的不同，高等植物可分為C3、C4植物和 CAM植物，相應的，高等植物固定CO2的生化途徑有三種，即卡爾文 迴圈(C3途徑)、四碳二羧酸途徑(C4途徑)和景天科植物酸代謝途徑 (CAM途徑)，例如Darlington等人(1996)建立了一個包括陸生、水生植 物，脊椎和無脊推動物共存的生態系統，開展了生物濾池室內空氣污 染去除試驗，結果表明CO2可以通過光合作用代謝，水生植物是加速 分離室內污染物的主要原因。
林俊成等人(1999)分析種植柳杉造林儲存二氧化碳之成本評估，
每公噸CO2儲存成本為NT$ 269.18元，固碳成本低廉。但以陸地上植 物之種植固定CO2，有種植土地之限制，且其生長速率可能不足以處 理大量人為排放至大氣中之CO2。另一生物固碳之角色為藻類，地球 表面約70%是海洋，且海洋中擁有成千上萬種之浮游植物，且單一個 體如植物浮游生物微細藻類，其增殖率最短是2小時，而高等植物最 少也需24小時，故植物浮游生物顯得有較高二氧化碳的利用率(張富 龍及林畢修平,2005)。
(3)微藻
微藻是一類單細胞或多細胞形體微小的藻類的總稱，微藻與微生 物非常相似，同時又由於具有與植物細胞相近的光合器官，因此被認 為是介於陸生微生物與植物細胞之間的一類生物，微藻通常無複雜的 生殖器官，繁殖方式簡單，生長週期短，易於大規模培養，微藻可以 利用溶解于水中的CO2或HCO3-離子作為碳源進行光合作用。而光合
細菌法與高等植物均可藉光合作用進行CO2之固定。
Moheimani et al. (2006) 認為以光合作用藻類固定CO2，較植物有 高之單位面積產率，且可生長在海水及鹼性水源，故不會與農耕或其 他用途之淡水水源及耕地競爭。而藻類之生長速率較植物迅速，生長 週期亦較植物為短，故以藻類進行生物固定CO2有較高之發展潛能。
2-3 藻體之固碳機制及釋出有機物 2-3-1 固碳機制
綠色植物的光合作用可以用下列的反應式表示:
CO2+2H2O (CH2O) +H2O +O2
光合作用（photosynthesis）是葉綠素在光照作用下，將二氧化碳合成 醣類，同時釋放出氧氣的過程。光合作用是由光反應和暗反應組成的，
先行光反應，再行暗反應。光反應發生於葉綠體的類囊體膜（thylakoid membrane）上將光能轉化成化學能，還原 NADP+成 NADPH2 以及 產生高能量化合物 ATP；暗反應發生於葉綠體基質 (stroma) 中，利 用光反應形成的 NADPH 2 與 ATP 將二氧化碳轉變成碳水化合物。
光反應由兩個系統串聯而成，先發生光系統 II (photosystem II, PSII)然後再發生光系統 I (photosystemI, PSI)，光系統 II 是由葉綠素 與其他輔助色素吸收光能，將光能傳遞到 PSII 的反應中心 P680，引 起光化學反應，將水分子裂解轉化成氧氣且釋放電子；光系統 I 則 是接受水分子分解後所釋放的電子，並轉移給 NADP+（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate ）使其還原成 NADPH。PSI 和 PSII 所引起的一連串電子傳遞造成類囊體膜內外氫離子的濃度梯度，
使 ADP 進行光磷酸化(photophosphorylation)反應生成 ATP 。暗反應 是經由卡爾文循環(Calvin cycle)，利用從光反應所產生之 ATP 及 NADPH2 將二氧化碳固定，透過體內代謝途徑轉化成碳水化合物。
暗反應必須要有 ATP 及 NADPH2的供應才能發生，不需要光也可進 行，但是沒有光就不能驅動光反應的進行，暗反應就不會進行，因此 光反應與暗反應並不會個別發生，而是伴隨進行的(葉俊良, 2006；洪 志瑞, 2007；黃郁涵, 2009)。
2-3-2 各種微藻可利用之碳源
微藻大多數是光自營，利用無機碳通過光合作用轉化為生物質。
利用溶于水中的無機碳中獲取碳源，如 CO2、H2CO3、HCO3
-及 CO2 -3
等型態，各型態所占比例因 pH 不同而異，在不同的 pH 值所存在 的比率如圖 2-2，當 pH 值在 4 以下時，碳酸幾乎全部以 CO2和 H2CO3
的形式存在；隨著 pH 值提高，碳酸氫根的比率增加，當 pH 值為 8 時的碳酸氫根約達 98%；pH 值進一步提高，碳酸根比率也增加，當 pH 值為 12 時，只有碳酸根。但不是每種無機碳型態都能被微藻所利 用，微藻的無機碳利用形式如表 2-3，有些細胞可以利用 HCO3-和 CO2 ， 並且含有胞外碳酸酐酶(CA)，有的可以利用 HCO3-和 CO2但不含胞外 CA。無機碳源的利用與藻種類別和環境條件有關，而 H2CO3和 CO2 -3
型態則是微藻無法利用(程麗華, 2006；楊忠華等, 2008)。
圖 2-2 pH 對碳型態分佈之影響(程麗華,2006)
表 2-3 不同藻種對無機碳型態利用之差異(程麗華,2006)
Species HCO
3-CO
2External CA
Chlamydomonas reinhardtii + + +
Dunaliella terteolecta + + +
Scenedesmus obliquus + + +
Chlorella saccharophila + + +
Chlorella vulgaris C-3 + + +
Chlorella pyrenoidosa + + +
Chlorella spirulina + + +
Chorococcum littorale + + +
Chlorella ellipsoidea + + ─
Chlorella kesslerii + + ─
Chlorella vulgaris 11h ─ + ─
Chlorella miniata ─ + ─
2-3-3 色素
藻類的生長來自於胞內葉綠素行光合作用後，轉換碳源提供藻體 所 需 之 能 量 ， 然 而 自 然 界 中 存 在 於 胞 內 之 色 素 體 除 了 葉 綠 素 (Chlorophylls) 外 ， 尚 有 類 胡 蘿 蔔 素 (carotenoids) 、 藻 膽 蛋 白 (phycobiliproteins)，這三種色素體皆構成藻體光合作用系統所需之要 素，葉綠素呈現之顏色以綠色為主，葉綠素可細分成四類，依據旁鏈 結構的差異性，分別是葉綠素 a、b、c 與 d，葉綠素 a 為進行光 合作主要的核心色素，而葉綠素 b、c 與 d 則是扮演輔助的角色用 以延伸光合系統的吸光範圍，而葉綠素 a 光吸收波長分別落於 450
～475 nm 和 650～675 nm 範圍。類胡蘿蔔素呈現之顏色為黃色、橘 色、紅色為主，類胡蘿蔔素的吸光範圍則落於 400～550 nm 之間，
類胡蘿蔔素在光合系統中主要扮演光能吸收輔助角色並保護光合系 統不會被過強的光源照射所破壞。由於類胡蘿蔔素具有高度的抗氧化
活性，是健康食品所標榜的內容物。另外藻膽蛋白分為藻紅蛋白 (phycoerythrin) 與藻藍蛋白 (phycocyanin) ，藉由色基團之差異，其 吸收光譜亦不相同，藻膽蛋白在藍綠藻與紅藻中扮演了主要吸收光能 的天線，藻藍蛋白的吸光範圍位於 500～650 nm (Wright et al., 1991；
Jeffery et al., 1997；陳彥宏,2007；王智昱,2007)。
Her et al. (2004)利用研磨、超音波震盪及浸泡甲醇等不同萃取方 式萃出藻體色素，利用螢光光譜儀進行測定，發現葉綠素屬長發射波 長之位置，而葉綠素 a 位置為長激發/發射波長範圍在 EX: 278-593/EM:
673 nm，皆有連續波峰，從螢光光譜儀之特徵波峰技術來看，配合如 液相層析儀等工具，可提供藻類有機物及其萃取物定性及定量之依 據。
Pinto et al. (2001)以螢光光譜儀(Turner 10-AU fluorometer)配合特 定發射波長為 680 nm 之濾光鏡，取表面水體之水樣以非破壞藻體活 性測定藻體中葉綠素 a 之含量，並可達到現地連續監測之效能，此方 法之優勢的開發有助於往後對於水體藻類多寡有相當大之效益。
Eullaffroy and Vernet (2003)利用葉綠素為基礎進行水生植物之研究，
研究中添加抑制劑抑制水生植物的光合作用，再以螢光光譜儀對葉綠 素進行定性定量，結果顯示發射波長在 684 與 735 nm 有葉綠素之波 峰存在，以葉綠素在螢光光譜儀所對應之強度決定葉綠素於水體中之 含量多寡，而葉綠素之含量可作為藻體生長狀態之依據，故葉綠素之 螢光強度大或其含量高，可能代表藻體量高及生理狀態較佳。
2-3-4 藻類有機物之釋出
不同藻種因其生長時期、外在環境及藻體生理狀態之不同，其代 謝或釋出有機物之種類亦不相同，藻類在水體中最主要之養分來源為 PO43-、NH4+
-N以及NO3-
-N類等，並配合適當的溫度及陽光，致光合 作用相當旺盛，造成藻類大量的增殖。然而當藻類死亡後，本身所含 之有機磷及有機氮被釋放出來，有機磷分解成無機磷，有機氮則會分 解成氨氮後，再氧化成亞硝酸鹽氮及硝酸鹽氮，而這些有機物經分解 及氧化後的無機物質，將再度被水體中植物性浮游生物所吸收利用。
優養化水庫藻類大量繁殖是造成水質惡化之主要因素，然而藻類生長 過程中所釋放及代謝之有機物質種類繁多，這些由藻類代謝及釋放之 有機物，於水中產生臭、味及色度等問題，此外藻體所產生之有機物，
亦造成微生物的生長，以及當水體有機物腐敗時，亦會有臭味產生；
不同藻體本身均帶有不同之色素及顏色，故藻類大量繁殖後，水體顏 色亦會產生變化（Konno, 1993），並影響水中pH值之高低，另外，當 藻類增加時，亦會增加水體之濁度，當濁度提高時，水體透明度則相 對降低。
原水中存在藻類的物種繁多，而某些藻類會帶有胞外物質，藻類 胞外物質，亦稱黏質層 (mucilage)。在天然的情況下，黏質層常會從 生物體中擴散至海水中，在海水中常以群聚 (aggregation)或溶解 (dissolution)的方式存在，使其分佈的範圍非常廣，其大小範圍從膠體 狀 DOM 至非定形(amorphous)的顆粒狀物質之間（Decho and Herndl, 1995）EPS以多醣體 (polysaccharide)和蛋白質(protein)為主要成份，
多醣體為EPS較主要的物質，而蛋白質是較次要的成份，通常都以醣 蛋白(glycoprotein)的形式存在，胞外物具有高負電荷密度，胞外物質 大部份為親水性物質(Nguyen et al., 2005). Jørgensen and Jensen (1994) 表示 Soluble EPS 占湖泊中 DOC 1-30%不等，為湖泊中 DOC 之主 要成分。EPS之質和量會受藻種生存環境，包括水溫、光照強度及營 養鹽等環境影響。(邱鈺婷,2007)
2-4 螢光光譜在有機物量測之應用
螢光光譜廣泛應用於水中有機物定性之研究，然其亦可應用於藥 學及微生物領域蛋白質及核酸分析，例如以細菌細胞中似色胺酸 (Tryptophan-like) 之 螢 光 特 性 進 行 生 物 反 應 器 之 醱 酵 控 制 (Li and Humphrey, 1990)。天然蛋白質中具有螢光特性之芳烴基胺基酸主要包 括色胺酸、酪胺酸及苯丙胺酸，而苯丙胺酸之螢光強度明顯較低。似 蛋白質(protein -like)之螢光主要來自於芳香族，兩種螢光之蛋白質波 峰似色胺酸 (Tryptophan-like)及似酪胺酸(Tyrsine-like)被證實存於 DOM 之樣本中(Coble, 1996；Yamashita and Tanoue, 2003)。Mayer et al.
(1999)之文獻指出，標準品之酪胺酸及色胺酸各自含高及低激發波長
之螢光波峰，酪胺酸之高及低激發波長分別為 270-280 nm 及 220-230 nm，其發射波長為 300-310 nm；色胺酸之高及低激發波長分別為 270-280 nm 及 220-230 nm，其發射波長為 340-350 nm，總稱似蛋白 質。Determann et al. (1998)以 UV 激發及對應之發射光譜進行海水細 菌及浮游植物調查，並將發射波長定為 340 nm (λex=230 nm)之強度 與細菌數、蛋白質含量呈現線性相關，而此研究使用之十四種浮游植 物，如 Ditylum brightwelli.、Nitzschia sp.、Skeletonema costatum.、
Dunaliella tertiolecta. 、 D. tertiolecta. 、 Chrysochromulina sp. 、 Chrysochromulina sp.、Phaeocystis sp.、Phaeocystis globosa.、P. globosa.、
Prymnesium、parvuum.、 Isochrysis sp.、Rhodomonas sp.，大部分在 305 nm 有微弱之發射光強度，此特徵圖譜亦被證實為 Tryptophan 與 Tyrosine 所致。
Mopper and Schultz (1993)進行海水螢光光譜之特性分析，發現波 長 270-360 nm 有明顯之發射值，此訊號主要為蛋白質、芳香族之胺 基酸(Aromatic amino acid)及相關代謝物產生，而 Determann et al.
(1998)之研究則指出於 280-325 nm 有較高 之發射值，其可能為 Tyrosine-like 及 Tryptophan-like 物質所致。De Souza Sierra et al. (1997) 調查世界海域有機物之螢光分析均發現有兩個 Fluorophores，且此雙 Fluorophores 之強度隨有機物來源及性質會有所改變，而 Matthews et
al. (1996)以激發發射波長(EX/EM)為 310/430 nm、340/450 nm、
390/490 nm 與 280/320-350 nm 進行比較珊瑚礁、礁岩萃取液、海水 及商業用之腐植酸螢光圖譜之差異性，其中 280/320-350 代表蛋白質 產生螢光之位置，結果顯示所有研究對象在四種激發發射波長均有波 峰，但強度有明顯之差異，與物種之濃度相關。郝瑞霞等人(2007)以 三維螢光光譜法研究城市污水處理過程中溶解性有機碳之螢光特性 變化規律。研究結果顯示，生活污水中螢光類溶解性有機物主要為似 蛋白質、UV 腐植質及可見腐植質為主，其螢光激發發射(EX/EM)波 峰分別介於 275/340、230/430 及 330/ 425 nm 附近，且經生物處理程 序後之原水，其似蛋白質螢光波峰近乎消失，且 UV 腐植質及可見腐 植質之螢光強度值亦較原水為低，故將螢光光譜應用於處理程序效率 上，亦有一定之發展空間。
Determann et al. (1996)取東大西洋(Eastern altantic ocean)之水樣 進 行 螢 光 分 析 ， 發 現 在 海 水 表 面 存 在 之 Tryptophan-like 與 Tyrosine-like 較深海處多，並認為黏狀之有機物(Particulate organic matter)及衍生物之有機物(Derived dissolved organic)為可能之來源。
Her et al. (2004)利用研磨、超音波震盪及浸泡甲醇等不同萃取方式萃 出之藻體有機物與 SRHA (Suwannee River Humic Acid)比較，發現 EEFM 圖譜中有相似之腐植質波峰位置(EX：352-360 nm/EM：441 nm)，
因此證明水體中有機物之來源乃為藻體所貢獻。Mcknight et al. (2001) 以螢光光譜儀比較河水及微生物產生之黃酸有機物性質差異之比較，
發現在激發波長為 370 nm，放射波長在 450 nm 與 500 nm 之螢光強 度值可作判斷不同來源有機物性質之指標，當比值為 1.9 時，水中之 黃酸有機物可能來自微生物，比值為 1.4 時，該物質可能來自陸域。
Suzuki et al. (2001) 利 用 同 步 (Synchronous) 及 微 分 同 步 (Derivative synchronous)螢光光譜儀進行自然水體螢光物質特性分析，前者可約 略瞭解螢光物質之特性，而後者可明確判斷波峰位置，其在海水與河 水中均可發現到似腐植質(如 Humic acid 與 Fulvic acid)與似蛋白質(如 Tyrosine 與 Tryptophan)之螢光物質。
高解析度螢光光譜儀可應用於河水、海岸與海水中溶解性有機物 性 質 之 確 認 ， 並 發 現 似 腐 植 質 (Humic-like) 、 Tyrosine-like 與 Tryptophan-like 等三種性質之有機物。Humic-like 之螢光物質包含兩 個波峰，一個屬 UV 之激發範圍之波峰，另一則屬可見光範圍之波峰，
而後者在河水中為 EX/EM 之最大波峰位置為 340/448 nm，海岸水樣 則落在 342/442 nm，海水淺處為 342/442 nm，海水淺處之變化端 (Marine shallow transitional)為 310/432 nm，優養化海水淺處 299/289 nm，深海處 340/438 nm (Goble, 1996)。
第三章 研究架構、系統及實驗分析方法
3-1 研究架構
本研究之架構如圖 3-1 所示，主要分三階段進行，第一階段決定 研究議題、文獻收集及建立分析參數；第二階段是生物反應器設計、
架設及測試；第三階段則是針對不同試程包括空氣流量、爐石量，培 養 Chlorella sp.，並進行藻體表面特性及釋出液有機物性質之比較，
量 測 參 數 包 括 外 觀 、 藻 體 含 碳 量 、 非 揮 發 性 溶 解 性 有 機 碳 (non-purgeable dissolved carbon, NPDOC)、分子量大小、傅立葉轉換 紅外線光譜(Fourier Transform Infrared Spectrometry, FTIR)、螢光激發 發射光譜、紫外光吸收之分析，藉以瞭解不同試程對 Chlorella sp. 生 長過程釋出有機物性質及藻體物理特性變化，以及 Chlorella sp. 之固 碳能力評估。
3-2 實驗方法
3-2-1 藻種之選擇與批次培養
本研究以 Chlorella.sp 為培養藻種，其營養鹽參考 Andersen(2005) 之著作，並整理如表 3-1。Chlorella sp.則取自東港水試所蘇惠美博士 實驗室，反應器體積約 4 L，在反應器週圍適當距離設置光源，進行 光 照 ， 每 日 光 照 12 小 時 。 培 養 過 程 中 ， 利 用 空 氣 幫 浦 ( AL-6A,ALITA , Taiwan) 連接曝氣石(5/8"×7/8")將空氣導入反應器 中，提供樣本所需碳源及均勻翻滾水體避免沉澱。
表 3-1 Chlorella sp. 營養鹽濃度
培養液(g / L)
Components 濃度 Components 濃度
KNO3 5.00×10-3 M H3BO3 2.31×10-2 M KH2PO4 5.00×10-4 M MnSO4‧H2O 6.21×10-3 M K2HPO4 5.00×10-4 M ZnCl2 3.67×10-4 M MgSO4‧7H2O 2.00×10-3 M CuSO4‧5H2O 1.60×10-4 M Ca(NO3)2 3.05×10-5 M H2MoO4‧H2O 5.56×10-5 M FeSO4‧7H2O 1.08×10-5 M
文獻閱讀
藻種培養
氣體流量 爐石
研究目標
· 探討不同培養條件對微藻生長之影響
· 藻體表面特性觀察
· 藻體釋出液有機物性質之變化
· 微藻固碳效益評估
藻 體
· 藻體外觀
· 螢光強度
· 表面電性
· 元素分析
· FTIR
藻體釋出液
(經0.45um過濾)
· 有機物性質
· NPDOC
· 分子量
· 胺基酸
環境及水質參數
· pH、溶氧、鹼度
· 溫度、光強度
· 生長曲線、Biomass
圖 3-1 研究架構圖
3-2-2 光生物反應器設置
本研究設計之生物反應器系統圖，如圖 3-2 所示，配合計畫需求，
設計為可移動之系統，區分為三部分(1)二氧化碳或空氣產生器及氣 體流量偵測器；(2)藻類生長反應器；(3)二氧化碳偵測器。二氧化碳 來源利用二氧化碳及高純氮氣(99.999%)進行混合，配製不同二氧化 碳濃度，空氣來源則是以空氣幫浦(ALITA , Air Pump AL-6A, Taiwan) 通入空氣，氣體由反應器底端進入，並藉由 5/8"×7/8" 曝氣石進行曝 氣；氣體在通入反應器前會經過氣體流量計控制進氣流量，並裝設止 逆閥避免液體流入流量計及幫浦。反應器主體長、寬及高分別為 50、
50 及 170cm，並在四邊支架各設置 1 支日光燈管(東亞照明, FL 30D/29, Taiwan) 模擬光照，光照控制在 1.7 klux，並設有定時器控制光照時 間，藻類培養反應器為透明袋狀材質為聚丙烯(Polypropylene, PP)，直 徑及高度分別為 13 和 65 cm，培養體積約 4L，兩塊鐵弗龍材質圓盤 將透明袋固定其中，用 8 根螺絲釘鎖緊確保不會漏水，並利用 2 條之 鋼纜吊掛於反應器上緣處，藉以固定反應器。
圖 3-2 光生物反應系統圖
3-3 參數分析
3-3-1 基本環境及水質參數 3-3-1-1 溫度、pH、溶氧
培養期間之水質參數監測項目包括水溫、pH值、光照強度、溶 氧。藻水之溫度、pH值及溶氧量以手提式多參數水質分析儀(Multi 340i, WTW, Germany)測定；而光反應器藻水表面之光源強度以照度 計(TES-1335,TES,Taiwan)測定。
3-3-2 藻類外觀觀測、計數、含碳量測定與二氧化碳固定能力 3-3-2-1 電子顯微鏡之觀測
取適量含藻體之樣品以0.2 µm之Nylon 濾膜(Nylon membrane filters, whatman, England) 進行過濾，再將濾膜剪裁成四等份，將剪裁 過濾膜其過濾面朝內側相對，使用銅鐶以三明治的方式夾緊，將夾緊 後的銅鐶放入磷酸緩衝溶液中 (pH=7.0) 浸泡10-15分鐘 (or 浸泡三 次，每次 10 分鐘) 進行表面清洗，再放入2.5 %戊二醛 (Glutaldehyde Solution, Merck, Germany) 固定液中，隨後置入 4 ℃ 冰箱 2-16 時 進行固定之動作，前述動作完畢後，再以磷酸緩衝溶液( pH=7.0) 浸 泡樣本 10-15 分鐘 (or 浸泡三次，每次 10 分鐘) 。上述動作完成 後，開始進行脫水之工作，首先將絕對酒精 (Ethanol absolute, Ferak Berlin GmbH, Germany) 分別稀釋成10、25、50、75、90、95 % 不同 濃度之酒精；脫水分為兩階段，第一階段將濾紙放入漸次遞增濃度10、
25、50、75 % 酒精各浸泡一次，每次 10-15 分鐘；第二階段需以 90、
95 % 之酒精浸泡清洗一次，每次約30分鐘，最後以絕對酒精(酒精純 度為 99.8 %)浸泡 3 次，每次 30 分鐘。
前項作業完成後，使用臨界乾燥器 (HCP-2 critical point dryer, Hitachi, Japan) ，進行乾燥。乾燥完成後，使用黑色雙面膠帶將樣本 固定於樣本座上，樣本座材質可為銅製或鋁製，完成後使用真空蒸鍍 機 (Engineering IB-2 Ion, Eiko, Japan) ，進行樣本鍍金。鍍金主
要目的為增加導電性。鍍金結束後，即可使用掃描式電子顯微鏡 (S-2500 scanning electron microscope, Hitachi, Japan) 進行觀測，
操作條件如下表 3-2 所示：
表 3-2 掃瞄式電子顯微鏡之操作條件 (S-2500, Hitachi, Japan)
項目 操作條件
解析力 1.5nm (15KV), 5.0 nm (1.0KV) 加速電壓 0.5 kv to 30 kV (100V steps)
倍率 x 10 to x 500,000
GUN 熱場效型 In-Lens Thermal
影像模式 SEI (二次電子影像)
BEI TOPO/COMP (背向電子影像)
樣品最大容許 150.0 mm 直徑 X10 mm 高
即時影像顯示 1280 x 1024 pixels
樣品台
Eccent ri c X=70mm, Y=50mm , Z=3mm - 41mm
R=360°, T= -5 -60°
3-3-2-2 光學顯微鏡觀測及藻體計數
取適量藻水以 0.45 μm硝酸纖維膜(GN-6 Metrice® Grid 47mm, PALL, USA)過濾，將過濾後之濾膜適當裁剪，置於載玻片上，放入 乾燥器自然乾燥後，滴2-3滴顯微鏡專用鏡油，傾斜蓋上蓋玻片，以 光學顯微鏡(E400, Nikon, Japan)配合CCD影像擷取器(Digital sight DS-U3, Nikon, Japan)擷取影像及影像處理軟體 (ImageProPlus 5.0, MediaCybernetics, USA)進行觀測。
以 0.45 μm 之硝酸纖維膜 (Mixed cellulose ester, Advantec MFS Inc., USA ) 進行過濾，過濾後之濾膜經適當剪裁後，置於螢光 顯微鏡之載玻片上，並以蓋玻片覆蓋於螢光光學顯微鏡 (Fluorescence Microscope) (E-400, Nikon, Japan) 下，以濾光片 (G-2A, Nikon, Japan) 觀察螢光標記物，並以 CCD 影像擷取器 (Digital sight DS-U3, Nikon, Japan) 擷 取 影 像 ， 並 配 合 影 像 處 理 軟 體 (Image ProPlus 5.0, MediaCybernetics, USA) 計算藻體數。目鏡下選擇 20 個視野進行觀
察，並計算其平均值，再乘以視野面積，即可得出藻體數，最後再除 以取樣體積即可求出水樣之總藻體數，單位為 cells/mL 。
cells= CCD 擷取視野之總藻體數
216×162(μm)= CCD 擷取視野之面積 (μm2) 9.6×108= 樣本之過濾有效面積 (μm2)
X= 過濾樣本藻水之體積
cells/mL= 單位體積之總藻體數
3-3-2-3 藻體自發性螢光強度
以 0.45 μm 之硝酸纖維膜 (Mixed cellulose ester, Advantec MFS Inc., USA ) 進行過濾，過濾後之濾膜經適當剪裁後，置於螢光 顯微鏡之載玻片上，並以蓋玻片覆蓋於螢光光學顯微鏡 (Fluorescence Microscope) (E-400, Nikon, Japan) 下，以濾光片 (G-2A, Nikon, Japan) 觀察螢光標記物，利用 CCD 影像擷取器 (Digital sight DS-U3, Nikon, Japan) 擷 取 影 像 ， 並 配 合 影 像 處 理 軟 體 (Image ProPlus 5.0, MediaCybernetics, USA)進行影像擷取，選擇 20 個視野每個視野平 均藻數約在 30-100 個，利用影像處理軟體將藻體螢光畫面先清除背 景雜訊後轉換為灰階，利用軟體內強度計算功能選取平均強度，將該 視野內螢光標記物的強度列出，並轉換成Excel檔，而後將 20 個視 野之螢光強度利用Excel進行平均，計算藻體自發性螢光平均強度 值。
3-3-2-4 藻體界達電位
本 研 究 使 用 之 界 達 電 位 分 析 儀(Zetasizer NanoZ, Malvern, U.K.)，是以PCS (Photon correlation spectroscopy)法進行偵測 溶液或懸浮液中顆粒之擴散速率，利用兩束雷射光束交叉於量測管內 之靜止層(Stationary layer)，使其產生干涉條紋(Interference fringe)。樣
mL cells mL
X m m cells
/ 10
6 . ) 9 ( 162 216
8 2
2
品 粒 子 在 干 涉 條 紋 中 移 動 時 所 產 生 之 散 射 光 ， 經 由 PM (Photo-multiplier)管收集後，以其強弱及變化速率，準確偵測出粒子 之電泳速度，再計算出其界達電位值。水樣分析前，先以標準品進行 儀 器 之 校 正 。 本 儀 器 所 使 用 之 界 達 電 位 標 準 品 (Zeta potential transfer standard, DTS1050) 乃 參 考 NIST Goethite standard SRM1980，並由儀器商提供。標準品注入前先以去離子水潤洗量測管，
並確定其光散射強度小於10 Kcps (Kilo-counts per second)。若非介於 此範圍內，則取出量測管以甲醇清洗。標準品注入量測管後，選擇界 達電位模式，設定偵測溫度25℃，確定黏滯係數(Viscosity)、電解常 數 (Dielectric constant)，而偵測時間 (Measurement duration) 設定在 自動 (Auto) 狀態，並設定偵測次數，按下“GO” 鍵後，開始進行 偵測。標準品偵測出之界達電位值需為 -50~5 mV。若非介於此範圍 內，則請儀器商進行儀器之校正。水樣之偵測步驟同標準品。
3-3-2-5 生物質量(Biomass)
生物質量濃度之測定前，先以 1.5μm 濾紙(934AH, Whatman, UK)利用抽氣裝置以二段水浸濕後，置於鋁盤上，以烘箱 (OV50, Hipoint, Taiwan)於80℃下烘乾1小時後，取出置於乾燥箱內至室溫，
與鋁盤一同秤重並記錄為W0備用。依藻體增殖之情況，取適量藻水 (記錄為V)以秤重後備用之濾紙進行過濾，將濾紙及鋁盤一同放置於 80℃烘箱1小時，取出秤重則記錄為W1，依下列公式計算求得生物質 量濃度(g dried weight L-1)。
生物質量濃度(g DW L-1) = ((W1-W0)1000)/ V(L)
3-3-2-6 藻體乾重之含碳量
取冷凍乾燥之藻粉約 2-3 mg，利用四位數天秤進行秤重記錄後，
以錫盒進行樣品包覆動作，置於元素分析儀(Vario-EL Ⅲ, Elementar, Germany)在燃燒管 1150℃ 下燃燒產生氣體，以不同元素吸附管柱吸 附並於相對溫度脫附，以熱傳導偵測器，進行資料處理運算進行，比 對標準品檢量線計算藻體單位乾重含碳量(g C g-1 Dried Weight)。
3-3-2-7 固碳量之計算
關於固碳量之計算，本研究參考 De Morais and Costa (2007)所提 出之方法，其計算式如(1)式，FA 表示在一段時間內二氧化碳聚集的 量，而固碳率以 FD% 表之，如(2)式。
FA = (𝑋𝑡− 𝑋0) × 𝑚𝑐𝑏𝑚 × 𝑉𝑉𝑇𝑃× 𝑀𝐶
𝑀𝐶𝑂2 …………..(1) Xt： 藻體在 t 時間之濃度 (g/L)
X0： 藻體初始濃度 (g/L)
mcbm ：每克藻體乾重所含碳之重量 (g/g) VVTP：反應槽體積 (L)
Mc：碳之分子量(g/mol)
MCO2：二氧化碳之分子量(g/mol) FD = (𝐹𝐴(𝑡−1)𝑀 −𝐹𝐴𝑡)
𝑖𝑑 × 100% …………..(2)
FA(t-+1)：在 t+1 時間內，二氧化碳聚集量(g)
FA0：在 t 時間內，二氧化碳聚集量(g) Mid：二氧化碳注入量 (g)
3-3-3 有機性參數
3-3-3-1 紫外光及可見光譜儀(UV-Vis Spectrophotometer)
測定UV-vis時，將紫外光及可見光譜儀（U-2900, Hitachi, Japan) 之波長範圍設定於 200-900 nm，測定前使用實驗室之超純水置於一 公分之石英比色管中，並置入樣品槽，進行儀器歸零校正之步驟，隨 後取約八分滿之水樣於一公分之石英比色管中，將其置入樣品槽內，
進行樣本分析。
表 3-3 紫外光及可見光譜儀參數設定值
Parameter Value
Measurement type Wavelength scan
Data mode Abs
Start Wavelength 900 nm
End Wavelength 200 nm
Slit Width 1.5 nm
Scan speed 400 nm/min
3-3-3-2 螢 光 激 發 發 射 光 譜 (Excitation Emission Fluorescence Matrix,EEFM)
本研究以螢光光譜儀 (F-4500, Hitachi, Japan)進行藻類或其釋出 有機物之螢光分析，光源採用氙燈作為光源，功率為150 W，偵測器 採用光電倍增管，其功能除了傳統單一波長掃描外，並具有三度位向 測量EEFM之功能，藉此功能可將激發及發射波長分別繪製於X及Y 軸上，並將螢光強度顯示於Z軸。依光柵寬度設定，產生數百至數千 筆之數據資料。以儀器附屬之分析軟體FL Solutions進行3-D圖譜之繪 製，而後將其數據輸出轉成EXCEL.CSV檔，原本EXCEL.CSV為距陣 型式之數據，經轉檔後變為直列型式數據，並匯入SURFER軟體，繪 製出與FL Solutions軟體相同之螢光圖譜。使用FL Solutions軟體判讀 EX/EM (Excitation/ Emission)之效率較佳，故圖譜之判讀與繪成螢光 圖譜採分開作業之方式進行。
取 Chlorella sp. 藻 水 ， 經 0.45μm 濾 膜 (Mixed cellulose ester, Advantec MFS Inc., USA)過濾，以未過濾之藻水作為藻體樣本，藻水 之過濾液則為釋出有機物分析之樣本。進行樣本之螢光分析時，設定 激發發射波長之全譜3-D掃瞄，分析前將實驗室之二段水注於一公分 之四面透明石英比色管中，並置入樣品槽掃瞄，作為空白3-D掃瞄，
隨後取約八分滿之藻體水樣或藻水之過濾液，進行樣本3-D掃瞄。掃 瞄後利用螢光圖譜分析軟體，將水樣圖譜扣除空白圖譜後，得到樣本
之螢光圖譜。螢光光譜儀之操作條件如表3-4所示。
以螢光激發發射光譜儀之全譜掃描後，將數據扣除背景值後將數 據輸出，輸出之激發發射波長為 Ex/Em：200-400/280-550 nm，數 據輸出後並將水中之 OH-及石英 cell 折射之 Rayleigh-Tyndall 去 除，接著參考Chen et al .(2003)利用三維螢光光譜圖中激發與發射波 長對應位置將有機物區分為五大類：第I 類為 EX (激發波長) < 250 nm，EM (發射波長) < 330 nm，屬芳香型之蛋白質 (Aromatic protein) 酪胺酸；第II類 EX < 250 nm，EM在 320-380 nm，屬芳香型之蛋白 質 (Aromatic protein)與 BOD5有關之物質；第 III類 EX < 250 nm，
EM > 350 nm，屬黃酸 (fulvic acid)物質；第 IV類 EX在 250-280 nm，
EM < 380 nm ， 屬 於 溶 解 性 微 生 物 代 謝 物 質 (Soluble Microbial by-product-like)；第 V類EX > 280 nm，EM > 380 nm，屬似腐植酸 (Humic Acid-Like)物質，以儀器附屬之分析軟體FL Solutions進行3-D 圖譜之繪製，將數據輸出轉成EXCEL檔，將各區塊之螢光強度進行 累加、平均強度及組成百分比之運算。
3-3-3-3 非揮發性溶解性有機碳(Non-Purgeable Dissolved Organic Carbon, NPDOC)
本研究以總有機碳分析儀(Multi N/C 3000, Analytik Jena AG, Germany)進行藻水中非揮發性溶解性有機碳含量之測定。藻水之前處
表 3-4 EEFM 之操作參數設定值
Parameter Value
Measurement type 3-D scan
Data mode Fluorescence
EX & EM Start – End WL 200 - 900 nm EX & EM Slit 10 nm
Scan speed 30000 nm/min
PMT Voltage 700 V
理，以 0.45μm 濾膜(Cellulose acetate, MFS, USA)進行細濾，經過濾 方式去除水中雜質及藻體後，以磷酸(H3PO4, Merck, USA)進行酸化至 pH 小於 2 。樣本分析前，先以純氮氣吹拂 5-10 分鐘，即可將樣本 置於總有機碳分析儀之吸取處，水樣經由吸取器，注入裝填高感度觸 媒(Cerium Oxide, Merck, Germany)之高溫爐中，在 850℃ 下與氧氣 反應生成 CO2，並藉載流氣體攜帶 CO2，流經無機碳反應器，並除 濕 、 降 溫 及 乾 燥 ， 最 後 CO2送 至 非 分 散 紅 外 線 吸 收 偵 檢 器 (Non-dispersive Infrared Absorption Detector)中，偵測讀值。檢量線之 製作，以磷苯二鉀酸氫鉀(KHP)配製成有機碳(Organic Carbon, OC) 儲備溶液，再以有機碳儲備溶液配製成ㄧ系列之檢量線濃度，完成檢 量線之R2值需大於0.995，方可進行樣本分析，以確保正確性。所得 之結果配合一系列適當濃度之標準溶液所得檢量線，求得樣本中非揮 發性溶解性有機碳含量(mg/ L)。
3-3-3-4 有機物分子量(Molecular weigth)
利用高效能液相層析儀 HPLC (L-7455, Hitachi, Japan)配合 DAD 偵檢器(Diode array detector)進行分子量之測定。移動相(Mobile phase) 為 2.4 mM NaH2PO4、1.6 mM Na2HPO4及 25 mM Na2SO4混合成 pH 6.8 離子強度 100 mM 之磷酸緩衝液，流速為 0.5 mL/min。水樣以 0.45 μm 之濾膜(Mixed cellulose ester, Advantec MFS Inc., USA)過濾非水溶性 物質後隨即分析。分析管柱安裝於外部尺寸(W×D×H)：185 ×108 × 490 mm，烘箱尺寸：45 × 26 × 330 mm 恆溫箱(CH-900, ChromTech, Taiwan) 內，固定溫度 30℃，溫度穩定性±0.3℃，避免移動相因溫差所產生之 氣泡干擾。DAD 偵檢器偵測波長設定為 210 nm，分析管柱為 TSK HW-55S(Tosoh, USA)，內徑、長度分別為 7.8 mm 及 300 mm，內部 填物為 hydroxylated methacrylic polymer，粒徑及平均孔徑大小為 20
－40 µm 與 125 Å，pH 穩定範圍為 2－13。為了得知樣本分子量分佈，
以一系列已知分子量且分佈狹窄之高分子聚合物作為標準品，建立一 條律定曲線。使用 polyethylene glycol, PEG (Sigma, USA)作為標準 品，分別選用分子量大小為 410,000、150,000、50,000、25,000、5,000 及 1,000 Da，將標準品以移動相稀釋成適當濃度後，以 150 μL 平頭
