本研究室先前的研究發現，給予第 2 型糖尿病 KK 小鼠補充生物素 四週後，可顯著改善其空腹血糖、葡萄糖耐受性、胰島素阻抗性，並會 增加骨骼肌細胞中IRS-1/2、IRS-1/2 與 PI 3-kinase 相連結之蛋白質表現、
GLUT4 的表現量與位移情形。因此本研究欲進一步探討給予不同劑量 生物素對於第 2 型糖尿病 KK 小鼠骨骼肌與肝臟細胞中，影響 GLUT4 位移的分子路徑中 (1)PKCζ 在細胞質與細胞膜的總蛋白表現，並評估其 活化的情形；(2)PKB(Akt)在 Ser473 與 Thr308 調節部位磷酸化蛋白質的 表現。希望藉此探討骨骼肌與肝臟細胞中 PKCζ 與 PKB(Akt) Ser473 與 Thr308 調節部位磷酸化蛋白質所扮演的角色。
第四章 材料與方法
壹、 試驗材料
一、 試驗動物與飼養環境
1. 試驗動物模式
目前，糖尿病動物模式製備方法主要有：手術切除胰腺、
化學藥物誘導、自發性糖尿病動物模式、基因轉殖動物等。
KK/H1J 是具第
2 型糖尿病特徵之糖尿病小鼠，於1944 年由 K.
Kondo 所育成的近親品系小鼠，為一種輕度肥胖型第
2 型糖尿 病動物。其雄性小鼠具有葡萄糖不耐症(glucose intolerance)、高胰島素血症(hyperinsulinemia)與胰島素阻抗性而有高血糖及高 胰島素之症狀及遺傳性，一般多應用於非胰島素依賴型糖尿病 的相關研究。
當雄性KK 小鼠因老化或以高熱量飲食誘導後，會表現出與 第2 型糖尿病人相似的症狀(Ikeda, 1994；Lubec et al., 1997)。8 週齡前便會出現第 2 型糖尿病之症狀；KK 小鼠會有明顯的多 食，從 5 週龄起，血糖、血胰島素水平逐步升高，至 5 月龄時
肥胖及肝臟對胰島素的敏感性可自發恢復正常，但糖尿病KK 小 鼠生命常明顯缩短。
本研究由樂斯科生物科技股份有限公司代理進口(主要購自 美國The Jackson Laboratory)36 隻 8 週大的雄性 KK/H1J 小鼠，
起始體重約30 公克，先以 Formulab Diet 5008(其成份接近 The Jackson Laboratory 所使用之飼料 LabDiet 5K52)使其適應 2 週，
再以高脂高熱量的飲食餵食使其誘發出第 2 型糖尿病症狀，再
經由空腹血糖高於 140mg/dl 之標準作為判定中度血糖異常，隨 後進行分組飼養。
本研究計畫之動物試驗內容已獲中國醫藥大學實驗動物委 員會核准。
2. 飼料與墊料
墊料為Beta Chip 硬木墊料(美國 Northeaston Products Corp 製造)，並每週更換清理一次墊料。飼料是 MILab Diet(美國 PMI 牌實驗動物飼料)，飼料購得後存放於 4℃冰箱中，待餵食時再 酌量取用，並詳細紀錄攝食情況。
墊料與飼料皆由雍力貿易股份有限公司代理購得。
3. 飼料成分
表 4.1、Formulab Diet 5008
Nutrients Amount
Protein 23.5%
Fat 6.5%
Fiber 3.8%
Ash 6.8%
Physiological fuel value(Kcal/gm) 3.50
Biotin(ppm) 0.20 5008 飼料熱量：483.55Kcal/100g product
表 4.2、高脂高熱量(含 35.5% Lard)之飼料成分如下所示
Physiological fuel value(Kcal/gm) 5.03
Biotin (ppm) 0.20
表 4.3、高脂高熱量飼料之卡路里與三大營養素之比例 Calories provided by
Protein(%) 16.3%
Fat(%) 66.6%
Carbohydrate(%) 17.1%
Total Calories＝16.241×4＋66.629×9＋17.133×4
＝733.157 Kcal/100g product
4. 飼養環境條件
飼養於環境溫度22±2℃，溼度 60±5%，光暗循環各 12 小時，
並給予自由進食飼料與去離子水。
5. 生物素的補充
本研究所使用的生物素是白色粉末狀結晶的d-Biotin，待需 要時依不同劑量溶於生理食鹽水備用。
生物素的補充方式是先將生物素溶於 0.9%的生理食鹽水
(saline)後，再以腹腔注射的方式給予至小鼠體內，每週六天，
為期四週。Control 組是給予等體積且不含生物素的 0.9%生理食 鹽水當作對照組。
二、 試驗材料
d-Biotin (Tanabe seipaku co., LTD, Japan)
Human Insulin；Humulin○RR (Lilly France S.A., F67640 Fegersheim, France)
Anti-PKCζ (Upstate Biotechnology)
Anti-phospho-Akt1/PKBα (Thr 308) (Upstate Biotechnology) Anti-phospho-Akt1/PKBα (Ser 473) (Upstate Biotechnology) β actin antibody (Chemicon；Abcam)
HRP-Labeled Anti-Mouse IgG(Goat) (PerkinElmer TM Life Sciences, Inc)
HRP-Labeled Anti-Rabbit IgG(Goat) (PerkinElmer TM Life Sciences, Inc)
Western LightningTM Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer TM Life Sciences, Inc)
貳、 試驗設計與分組
首先將已誘發出第2 型糖尿病之小鼠，依照不同劑量的生物素分成
三組：生理水組 0 mg/kg of body weight (生理水組)、3 mg 生物素補充組 3 mg/kg of body weight (3 mg 組)、6mg 生物素補充組 6 mg/kg of body weight (6 mg 組)。在第四週補充期結束後，分別進行兩種處理方式，其 中胰島素刺激組在小鼠犧牲前 30 分鐘給予腹腔注射 4U/100g regular insulin 進行胰島素誘導試驗，非胰島素刺激組在犧牲前則不給予胰島素 作為對照。
表4.4、本試驗的處理方式與分組 生物素補充劑量
(mg/kg of body weight)
Insulin (-) Insulin(+)
0 (生理水組) n＝12 生理水組 (-) n＝6 生理水組(+) n＝6 3 (3 mg 組) n＝12 3 mg 組(-) n＝6 3 mg 組(+) n＝6 6 (6 mg 組) n＝12 6 mg 組(-) n＝6 6 mg 組(+) n＝6
參、 試驗流程
一、 製備組織樣品
KK/H1J 品系第 2 型糖尿病小鼠
犧牲後取出組織，並以液態氮冷凍保存 分成三組
給予高脂飼料(37%)餵食同時分別補充三種不同計量之生物素 4 週
生理水組(12 隻) 3 mg 組(12 隻) 6 mg 組(12 隻)
每組再細分成注射胰島素與無注射胰島素兩組
Insulin (-) (6 隻)
Insulin (+) (6 隻)
Insulin (-) (6 隻)
Insulin (+) (6 隻)
Insulin (-) (6 隻)
Insulin (+) (6 隻)
二、 骨骼肌肉組織中 PKC ζ 的分析
1. 均質
2. 配方
表4.5、均質液 Buffer A
成分 濃度
Tris (pH7.4) 20 mM
EDTA 10 mM
EGTA 2 mM
β-glycerophosphate 100 nM
Leupeptin 1 mg/ml
Aprotinin 0.1 mg/ml
Ovalbumin 0.1 mg/ml
PMSF 50μg
肌肉組織與均質液以 50mg / 500μl BufferA 混合
在 4℃下，以 12000rpm 離心 20 分鐘
取上清液(細胞質)
沉澱物接著與 100μlBufferA(含 0.5％ Triton X-100)混合
在 4℃下，以 12000rpm 離心 20 分鐘
取上清液(細胞膜)
進行免疫墨點法
三、 骨骼肌中 PKB(Akt)的分析
1. 均質
2. 配方
表4.6、均質液 Buffer B
成分 濃度
HEPES 50 mM
NaCl 150 mM
Na4P2O7 10 mM
Na3VO4 2 mM
NaF 10 mM
EDTA 2 mM
PMSF 2 nM
Leupeptin 5 μg/ml
NP-40 1 %
肌肉組織與均質液以 50mg / 500μl BufferB 混合
在 4℃下，以 12000g 離心 10 分鐘
取上清液 在 4℃下反應 1 小時
進行免疫墨點法
四、 肝臟中 PKC ζ 的分析
1. 均質
2. 配方
表4.7、均質液 Buffer C
成分 濃度
Tris-HCl 20 mM
EDTA 2 mM
EGTA 2 mM
Leupeptin 20 μg/ml
β-mercaptoethanol 6 mM
Aprotinin 4 μg/ml
肝臟組織與均質液以 50mg / 500μl BufferC 混合
在 4℃下，以 100000g 離心 30 分鐘
取上清液(細胞質)
沉澱物接著與 200μlBufferC(含 1％ NP-40)混合
在 4℃下，以 100000g 離心 30 分鐘
取上清液(細胞膜) 在 4℃下反應 30 分鐘
進行免疫墨點法
五、 肝臟中 PKB(Akt)的分析
1. 均質
2. 配方
表4.8、均質液 Buffer D
成分 濃度
Na4P2O7 10 mM
Na3VO4 2 mM
NaF 100 mM
EDTA 5 mM
PMSF 1 mM
Leupeptin 10 μg/ml
NP-40 1%
Tris (pH7.4) 20 mM
Aprotinin 10 μg/ml
肝臟組織與均質液以 50mg / 500μl BufferD 混合
在 4℃下，以 14000g 離心 30 分鐘
取上清液
在 4℃下反應 1 小時
進行免疫墨點法
六、 蛋白質定量
表4.9、蛋白質標準品樣品製備 濃度(μg /ml)
組成
0 2 4 6 8 10
1 mg / ml BSA (μl) 0 2 4 6 8 10 DD H2O (μl) 800 798 796 794 792 790 Dye reagent染劑 200μl
總體積 1000μl
1. 以BSA為蛋白質標準品，依照上表製作蛋白質標準樣品
2. 將配置好的蛋白質標準樣品用分光光度計，在吸光值(O.D.) 590 nm測定各蛋白質標準樣品吸光質的平均值
3. 畫出吸光質與標準樣品相關的檢量線，並求出曲線方程式及 R2值
＊R2值必須≧0.99以上的準確度
4. 取10 μl sample + 790 μl ddH2O + 200 μl dye reagent
5. 放入分光光度計測得O.D.值換，帶入趨勢方程式中，可得稀 釋後sample濃度
6. 乘上稀釋倍數，即是實際的sample濃度
七、 SDS-PAGE
表4.10、膠體電泳下層膠與下層膠製備
下層膠(10 %) 上層膠 (4 %) Acrylamide / Bis (37.5：1) 2.475 ml 0.503 ml
Running gel buffer
1.5 M Tris-HCl pH = 8.8 2.5 ml × Stacking gel buffer
0.5 M Tris-HCl pH = 6.8 × 1.25 ml 10 % SDS 0.1 ml 50 μl
dd H2O 4.925 ml 3.167 ml
10 % APS 50 μl 50 μl
TEMED 5 μl 5 μl
依照上表依序配置下層膠與上層膠
將鑄好的膠片放入電泳槽，加入 Running buffer
marker(5 μl)、positive control(15 μl)、sample+sample buffer(16 μl)先以 95℃加熱 5 分鐘
將加熱好的 marker、positive control、sample+sample buffer 加入樣品槽中
表4.11、4× sample buffer
表4.12、Running gel buffer；Stacking gel buffer
Running gel buffer Stacking gel buffer Tris-base 27.23 g Tris-base 6 g
ddH2O 80 ml ddH2O 60 ml 以6 N HCl 調整至 pH 8.8 以6 N HCl 調整至 pH 6.8
加 ddH2O 至 150 ml 加 ddH2O 至 100 ml
表4.13、10× Running buffer
成分 重量(g)
八、 西方點墨法(WESTERN BLOT)
將 transfer buffer 倒入，以電壓 100V 進行 3 小時 30 分鐘
轉漬好的 PVDF 膜用 5 %的脫脂牛奶(溶於 0.1 % PBS/Tween 20 中)
用 PBS/Tween 20 洗 3 次，每次 5 分鐘
加入適當的 1。抗(overnight)
用 PBS/Tween 20 洗 3 次，每次 5 分鐘
加入適當的 2。抗
用 PBS/Tween 20 洗 3 次，每次 5 分鐘
於暗房中進行壓片
表4.14、Transfer Buffer
成分 重量
Tris 3.03g Glycine 14.4g Methanol 200ml 加ddH2O 至 1000 ml
表4.15、PBS
成分 重量(g)
NaCl 8.00 Na2HPO4．12H2O 1.44
KCl 0.20 KH2PO4 0.24 加ddH2O 至 1000 ml
九、 封片
表4.16、commassie brilliant blue R-250 染劑；去染劑 commassie brilliant blue R-250 染劑 去染劑
CBR 1.5 g Acetic acid 210 ml methanol 250 ml methanol 300 ml
Acetic acid 50 ml ddH2O 4490 ml
ddH2O 250 ml
表4.17、封片液
成分 最終濃度 初濃度 體積
Glycerol 2 % 100 % 0.40 ml 95 % ethanol 30 % 95 % 6.31 ml 100 % acetic acid 10 % 100 % 2 .00ml
將膠片泡於commassie brilliant blue R-250染劑中
染劑回收後改用去染劑去染
當完全沒有顏色之後，在膠片上浸泡加2 % glycerol隔夜
再以玻璃紙封片保存
十、 統計分析
所有的結果均以Mean±S.D.表示，並以變方分析(ANOVA/Duncan)或 Student t-test 檢定各種處理方式之間與不同試驗階段結果的顯著差異。
所有數據以SAS 統計軟體 (SAS for windows, version 8.1)進行統計分 析，以 p<0.05 表示有統計上的顯著性。
第五章 實驗結果
壹、 生物素對骨骼肌肉組織中胰島素訊息傳遞路徑 PKC ζ 的蛋白質表現量的影響
一、
細胞質中總 PKC ζ 蛋白的表現量
本研究顯示，在沒有胰島素刺激的情況(基礎狀態)下，骨骼肌細胞 質的 PKC ζ 蛋白質表現量以生理水組顯著低於補充生物素 6mg 組 (p<0.05)，雖然生理水組與 3mg 組之間沒有顯著的差異，但補充生物素 3mg 其骨骼肌細胞質的 PKC ζ 蛋白質表現量有高於生理水組的趨勢。在 胰島素刺激之後，骨骼肌細胞質的 PKC ζ 蛋白質表現量也同樣的以生理 水組顯著低於補充生物素6mg 組(p<0.05)，且補充生物素 3mg 其骨骼肌 細胞質的PKC ζ 蛋白質表現量有高於生理水組的趨勢。另外，生理水組 的蛋白質表現量發現可增加胰島素刺激後PKC ζ 蛋白質的表現。
A. IB：β-actin
to ta l P K C ζ ex pre ss io n (% of cont ro l In suli n ( -) )
0
to ta l P K C ζ ex pre ss io n (% of cont ro l In suli n ( -) )
圖5.1、三組不同劑量生物素補充 4 週後在基礎狀態或胰島素刺激下，骨骼肌細胞質
中總β-actin、PKC ζ 蛋白質表現量。A：β-actin 免疫墨點法的結果。B：PKC ζ 免疫 墨點法的結果。C：以 Alpha Innotech Corporation ChemiImager TM 440 定量的結果1。 Fig 5.1 Cytosolic PKC ζ protein expression in skeletal muscle on basal or insuin-induced condition after 4 weeks with 0,3,6 mg biotin / kg of body weight supplementation. A：
Immunoblot of β-actin protein. B：Immunoblot of PKC ζ protein. C：Quantification of protein expression by Alpha Innotec Corporation ChemiImagerTM 4401.
1. Each value represents mean ±.S.D. Values with different letter in insulin(-) or (+) group are significantly different(p<0.05).
* mean is significantly different from their insulin(-) group (p<0.05).
二、
細胞膜中總 PKC ζ 蛋白的表現量
本研究結果顯示，在沒有胰島素刺激(基礎狀態)時，生理水組的骨 骼肌細胞膜PKC ζ 蛋白質表現量顯著低於 3mg 組與 6mg 組，並且 6mg 組顯著高於3mg 組(p<0.05)。然而在胰島素刺激之後，生理水組的細胞 膜PKC ζ 蛋白質表現則相反的顯著高於 3mg 組與 6mg 組，並且 6mg 組 顯著低於3mg 組(p<0.05)。另外，不管是否有給予生物素的補充，在胰 島素的刺激之下，生理水組、3mg 組、6mg 組的細胞膜 PKC ζ 蛋白質表 現量皆與沒有胰島素刺激時有顯著的差異(p<0.05)。
A. IB：β-actin
to ta l P K C ζ ex p re ssi o n (% o f c o n tr o l In su lin (-) )
Insulin - + - + - +
to ta l P K C ζ ex p re ssi o n (% o f c o n tr o l In su lin (-) ) 0
to ta l P K C ζ ex p re ssi o n (% o f c o n tr o l In su lin (-) )
圖5.2、三組不同劑量生物素補充 4 週後在基礎狀態或胰島素刺激下，骨骼肌細胞膜
中總β-actin、PKC ζ 蛋白質表現量。A：β-actin 免疫墨點法的結果。B：PKC ζ 免疫 墨點法的結果。C：以 Alpha Innotech Corporation ChemiImager TM 440 定量的結果1。 Fig 5.2 Membrane PKC ζ protein expression in skeletal muscle on basal or insuin-induced condition after 4 weeks with 0,3,6 mg biotin / kg of body weight supplementation. A：Immunoblot of β-actin protein. B：Immunoblot of PKC ζ protein.
C：Quantification of protein expression by Alpha Innotec Corporation ChemiImagerTM 44011.
1 Each value represents mean ±.S.D. Values with different letter in insulin(-) or (+) group are significantly different (p<0.05).
* mean is significantly different from their insulin(-) group (p<0.05).
三、
PKC ζ 蛋白的活化情形
將 PKC ζ 換算成細胞膜佔全細胞的百分比[(細胞膜/細胞質+細胞 膜)×100%]可以觀察到 PKC ζ 從細胞質中位移到細胞膜上的程度，具活 化型態的PKC ζ 必須先由細胞質位移到細胞膜，因為缺乏靈敏性高度分 析PKC ζ 活化的方法，測量細胞膜是最常被使用的方法。由結果顯示，
沒有胰島素刺激時，骨骼肌中6mg 組的 PKC ζ 從細胞質位移到細胞膜的 比例顯著高於 3mg 組與生理水組，並且 3mg 組也顯著高於生理水組 (p<0.05)。給予胰島素刺激後，骨骼肌中 PKC ζ 從細胞質位移到細胞膜 的比例則相反的以生理水組顯著高於 3mg 組及 6mg 組(p<0.05)，雖然 3mg 組、6mg 組之間沒有顯著上的差異，但是 6mg 組 PKC ζ 活化情形 則有較3mg 組減少的趨勢。給予胰島素刺激後，生理水組 PKC ζ 活化情 形較沒有刺激時增加，6mg 組則是減少，可以得知，本研究的生物素補 充不會促進PKC ζ 的活化。