第一節 Wy14643 活化 PPARα對 NT2/D1 細胞分化過程之影響 5-1-1 Wy14643 和 RA 對 NT2/D1 細胞生長的影響
如圖三,實驗共分四組,分別是RA、RA+Wy14643、Wy14643 及對照組,分別以細胞計數器計算0、12、24 及 48 小時的細胞數。
分析結果發現,Wy14643 這一組在 48 小時比起 48 小時的對照組有 顯著性的意義(p<0.05),表示 Wy14643 處理 48 小時後會增加 NT2/D1 細胞的增生,另外若同時處理RA 及 Wy14643 比只處理 Wy14643 可顯著降低細胞生長(p<0.05)。
以0、12、24 及 48 小時 4 個時間點及其細胞數,進一步計算 NT2/D1 細胞的 doubling time(表一),對照組細胞數增生為兩倍的 時間為33.78 ± 1.27 小時,RA 處理的為 30.59 ± 2.41 小時,
RA+Wy14643 這一組為 27.95 ± 0.15 小時,Wy14643 這一組為 21.98
± 3.46 小時。分析結果發現 RA+Wy14643 及 Wy14643 這兩組和對照 組比較有顯著性的意義(p<0.001)。表示此 RA+Wy14643 及 Wy14643 處理後會使NT2/D1 細胞加快增生的速度。此外,只處理 Wy14643 比同時處理RA 及 Wy14643 可縮短細胞的 doubling time(p<0.05)。
5-1-2 RA、RA+Wy14643 及 Wy 對 NT2/D1 細胞分化過程細胞型態影響 如圖四,由細胞型態上觀察Control、RA、RA+Wy14643、
Wy14643 四組處理 NT2/D1 細胞 28 天發現 Control 及只用
Wy14643,細胞型態並無很大的變化。而由細胞型態上觀察 RA 和 RA+Wy 這兩組可發現細胞型態有很大的變化,都有看到神經軸的 生長。經RA 誘導 23 天後細胞開始死亡。
5-1-3 成熟神經細胞的 mark protein:Connexin 43 和 MAP2
分化過程中,connexin 43(Cx43)此蛋白會隨著 RA 的處理逐 漸不表現(圖五),不管是RA 或是 RA+Wy14643 這組,在處理十 四天後幾乎看不見Cx 43 的表現。換言之,在 NT2/D1 細胞時會表 現Cx 43,而在分化後的 NT2N 細胞並不會表現此蛋白。
在microtubule-associated protein 2(MAP2)的表現恰與 Cx 43 相反,MAP2 只在 NT2N 神經細胞表現。利用共軛焦顯微鏡觀察處 理九至十八天的神經細胞可以看到不管是在RA 或是 RA+Wy14643 這兩組都有MAP2 的表現。但 Control 與只單獨 Wy14643 處理十四 天的細胞並無看到MAP2 的表現(圖六)。因此,RA 或 RA+Wy14643 的處理確實可以促使NT2/D1 分化為神經細胞 NT2N,而單獨只處 理Wy14643 並不會使其分化。
5-1-4 RA 及 Wy14643 對 NT2/D1 細胞分化為 NT2N 細胞的過程中對 CDK5/p35 的影響
CDK5/p35 是神經分化 G1 進入 G0 的重要調控點。在 RA 及
RA+Wy14643 這兩組中,隨著處理時間越來越長,其兩組的 CDK5
(圖七)和p35(圖八)蛋白的表現量皆有增加的趨勢,且 CDK5 在RA+Wy14643 這一組增加的較多(圖八)。
5-1-5 RA 及 Wy14643 對 NT2/D1 細胞分化為 NT2N 細胞的過程中對 CDK1/CDK2 的影響
在 NT2/D1 細胞的分化成 NT2N 的過程 CDK1 和 CDK2 的表現 量應是會越來越低,但在實 RA 組及 RA+Wy14643 組並無明顯差別
(圖九)。
5-1-6 RA 及 Wy14643 對 NT2/D1 細胞分化為 NT2N 細胞的過程對 Cyclin D1 的影響
Cyclin D1 可促使細胞週期由 G1 進入 S 期。由圖十可發現在 兩組的Cyclin D1 表現都是隨時間而下降的。
5-1-7 RA 及 Wy14643 對 NT2/D1 細胞分化為 NT2N 細胞的過程對 ERK2/JNK 的影響
ERK2 和 JNK 都可促使 NT2/D1 分化為 NT2N,在實驗中可看 到ERK2(圖十一)和 JNK(圖十二)在 RA 及 RA+Wy14643 這兩組 中都有增加的趨勢,且ERK2 在 RA+Wy14643 這組的表現量增加較 多。
5-1-8 對 β-catenin 的影響
β-catenin 在 RA 及 RA+Wy14643 這兩組中都有增加的趨勢(圖 十三),且在RA+Wy14643 有較高的趨勢。
5-1-9 RA 及 Wy14643 對 NT2/D1 細胞分化為 NT2N 細胞的過程對 pGsk-3β/Gsk-3β的影響
Gsk-3β無磷酸化的狀態是具活性的,有磷酸化的狀態是失活 的。因此,pGsk-3β/Gsk-3β 的比值如越高表示 pGsk-3β的量相對較
多,此時是不具活性的;反之,如越低則是表示具活性的狀態是較 高的。由圖十四可發現在NT2/D1 分化越完全時 pGsk-3β/Gsk-3β的 比值有越來越高的趨勢的。
第二節 活化 PPARα對 NT2N 細胞退化之影響 5-2-1 Aβ42濃度對NT2N細胞處理 72 小時的影響
Aβ42濃度分為四組,分別是對照組(Control)、0.1、0.5 及 1.0 μM。此四組處理 72 小時後,計算其細胞存活率(圖十五),由結果 發現0.1、0.5 及 1.0 μM與對照組比較皆有顯著性的意義(圖十 五.A),0.1、0.5 及 1.0 μM此三組的細胞存活率分別為 66%、59%、
45%(圖十五.B)。由於三組濃度皆會對NT2N細胞存活率有顯著性 影響。因此,實驗採用0.5 μM此濃度來處理細胞。
5-2-2 Aβ42對NT2N細胞處理不同時間的影響
Aβ42以0.5 μM處理五個時間點,分別是對照組(0 小時)、6、
12、18、24 小時,並以細胞計數器計算其細胞數,結果發現在 6 小 時細胞數已開始下降,與Control相較下,有統計上的意義(圖十六)。 除6 小時外,其他的時間點的細胞數與對照組相較也是有統計上的 意義的。
5-2-3 Aβ42與Wy14643 對NT2N細胞之細胞週期的影響
以0.5 μM Aβ42及10 μM Wy14643 處理NT2N細胞 0 到 48 小時。
實驗共分四組,分別為control、Aβ42、Aβ42+Wy、Wy14643。由流式 細胞儀的結果發現Aβ42在12 小時Sub-G1 的細胞族群開始增加且呈 時間依存性,而且Aβ42+Wy14643 24 小時後明顯高於只加Aβ42
(P<0.05)。
5-2-4 Aβ42及Wy14643 對NT2N細胞處理 6 小時後Caspase 3 之影響 經對照組(control)、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組 處理NT2N細胞 6 小時後(其中Aβ42濃度為 0.5 μM,而Wy14643 濃度
為10 μM),如圖十八結果顯示Aβ42及Aβ42+Wy14643 分別和control 及Wy14643 比較,Caspase 3 皆有顯著的增加(p<0.05)。
5-2-5 Aβ42及Wy14643 對NT2N細胞處理 6 小時後Endo G的影響
經對照組(control)、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組 處理NT2N細胞 6 小時後(其中Aβ42濃度為 0.5 μM,而Wy14643 濃度
為10 μM),如圖十九結果顯示Aβ42+Wy14643 這一組相較其他三組 在 Endo G的表現有明顯的增加(p<0.05)。
5-2-6 Aβ42及Wy14643 對NT2N細胞處理 6 小時後Bcl-2/Bax的影響 Bcl2/Bax的相對值是與細胞凋亡有關的,Bcl-2/Bax的比值較低 表示Bax有相對較高的量,此時會促使細胞走向凋亡。經對照組
(control)、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞 6 小時後(其中Aβ42濃度為0.5 μM,而Wy14643 濃度為 10 μM),如 圖二十結果顯示Bcl2/Bax在Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 相較於 control其比值皆較低。
5-2-7 Aβ42及Wy14643 對NT2N細胞處理 6 小時後p53 的影響
經對照組(control)、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組 處理NT2N細胞 6 小時後(其中Aβ42濃度為 0.5 μM,而Wy14643 濃度
為10 μM),對p53 的影響在四組之間並未觀察到的明顯變化(圖二十 一)。
5-2-8 Aβ42及Wy14643 對NT2N細胞處理 6 小時後β-Catenin的影響 經對照組(control)、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組 處理NT2N細胞 6 小時後(其中Aβ42濃度為 0.5 μM,而Wy14643 濃度 為 10 μM),圖二十二結果顯示β-Catenin在Aβ42及Aβ42+Wy14643 這 二組相較於其他組都有較高的表現(p<0.05)。
5-2-9 Aβ42及Wy14643 對NT2N細胞處理 6 小時後pGsk-3β/Gsk-3β之影 響
經對照組(control)、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組 處理NT2N細胞 6 小時後(其中Aβ42濃度為 0.5 μM,而Wy14643 濃度 為10 μM),圖二十二結果顯示Aβ42這一組pGsk-3β/Gsk-3β有較低的 比值,表示此組具活性的Gsk-3β較多。