本實驗的在神經分化過程的研究設計上分為四組control、RA、
RA+Wy14643、Wy14643。RA 是促使神經前趨細胞 NT2/D1 分化成 NT2N 所必須的，分化的時間大約需要兩週，而 Wy14643 是 PPARα
的ligand，可用來活化 PPARα，實驗結果發現單獨以 Wy14643 來處 理NT2/D1 細胞並不會促使 NT2/D1 細胞分化，因此，我們將實驗 焦點放在RA 及 RA+Wy14643 這兩組之間，藉以探討有活化 PPARα 和無活化的情狀下對NT2/D1 細胞分化上的影響。
已知CDK5/p35 在神經分化的過程是很重要，可調控細胞由G1 進入G0 時期，因此分化過程中會大量表現[5]。在我們的實驗結果顯 示RA及RA+Wy14643 這兩組在分化過程中CDK5/p35 確實隨著處理 時間越長而增加。不僅在CDK5/p35 而已，在ERK2、JNK、β-catenin 以及pGsk-3β/Gsk-3β也是隨處理時間越長而增加，這些因子的增加 是有助於分化的。β-catenin是Wnt signal pathway重要的中間蛋白。
Wnt signal一開始是發現和果蠅體節分化有關，目前也知道其和神經 分化有關[14]。當Wnt蛋白結合到細胞膜上受器時，會使Gsk-3β磷酸 化而失去活性，進而使β-catenin進入細胞核中與DNA結合而起動下 游基因的表現。因此在分化過程中β-catenin會增加且pGsk-3β/Gsk-3β 的比值亦會增加，而這與實驗結果是相符合的。有趣的是，觀察RA
及RA+Wy14643 這兩組之間，可發現CDK5、ERK2 以及β-catenin在 RA+Wy14643 這組的表現量有較高於RA組，意味著活化PPARα會使 這三個蛋白有較高的表現量，因此由實驗結果可知道的是PPARα會 增加分化相關的蛋白的表現。
除了上述蛋白外，實驗亦測定cyclin D1、CDK1 以及CDK2 的 蛋白表現量，其中cyclin D1 的表現是如預期一樣，隨處理時間越久 而表現量下降，cyclin D1 是調控細胞週期G1 進入S期的，其表現量 下降意味著細胞週期停滯在G1 時期。而較具爭議的是CDK1 和 CDK2 的表現量，如果細胞分化成神經細胞其CDK1 及CDK2 的表現 量應會大量減少，但實驗結果並無降低的趨勢，2004 年Marie的研 究結果[16]亦是相同，在分化過程中CDK1 以及CDK2 的蛋白表現量 並無減少，但其活性是降低，而由於本實驗並無測定其活性，因此 不知道PPARα的活化對其活性有何影響。
在神經退化方面， Aβ42已證實是senile plaque 核心中的主要物 質，目前還不是很清楚阿茲海默症是因為Aβ42所引起的，還是其他 因素造成阿茲海默症而使得Aβ42堆積腦部，雖前因後果還不是很清 楚，但Aβ42已經證實會導致神經細胞的死亡。因此，本實驗以Aβ42來 誘使中樞神經細胞株NT2N凋亡[52]。NT2N細胞株是由NT2/D1 細胞 用RA處理兩週所得到的，實驗分為四組，Control、Aβ42、
Aβ42+Wy14643 及Wy14643，藉以探討PPARα的活化與否在神經細胞 凋亡所扮演的角色。
由流式細胞儀的結果知道0.5 μM的Aβ42在 12 小時後會增加 Sub-G1 的細胞族群且有時間的依存性，不但如此，在 24 小時後，
Aβ42+Wy14643 這一組相較於Aβ4 2組有較多的Sub-G1 細胞族群，因 此PPAR的活化會增加Sub-G1 的細胞族群。在蛋白的表現方面，
Caspase 3 在Aβ42這組與control相比是有顯著性的增加，研究已知 Aβ42會透過Caspase 3 的路徑使NT2N細胞凋亡[68]，因此，這和實驗 結果是相符的，有趣的是在Aβ42+Wy14643 這一組caspase 3 的表現 量與Control相比也是有顯著性的增加但與Aβ42相較卻是無差異，且 再把Wy14643 組和組相比較，Aβ42確實會增加Caspase3 的活性，綜 合上述PPARα的活化會增加Sub-G1 的細胞族群，但卻不會增加 caspase 3 的表現量，也就是說PPARα會加速細胞的凋亡但不是透過 caspase 3 的路徑。而在Endo G的蛋白表現中知道，單獨用Aβ42或 Wy14643 處理皆不增加其表現，但在Aβ42和Wy14643 共同作用下卻 會使Endo G有顯著性的增加，也就是說在Aβ42作用下PPARα會加速 NT2N細胞的凋亡，且不是透過增加caspase 3 而是透過增加Endo G，
這是相當有趣的結果。
第七章 結論
PPARα在retinoic acid（RA）誘導NT2 分化成神經細胞NT2N過 程中的影響是會增加CDK5、ERK2 以及β-catenin蛋白表現，進而影 響NT2/D1 細胞的分化。而PPARα在以Aβ42誘導成熟的神經細胞 NT2N凋亡的過程中所扮演的角色是會增加NT2N的凋亡，透過Endo G的路徑。
？
CDK Cyclin
G0
Neurons p35 CDK5
CDK1 Cyclin B/A
M
G1
CDK4/6 Cyclin D
G2
S
CDK2 Cyclin A
CDK2 Cyclin E
圖一 細胞週期。CDK5/p35 調控神經細胞 G1 進入 G0 期。
圖二 Amyloid precursor protein 的代謝。α：α-secretase；
β：β-secretase；γ：γ-secretase。
圖三 Wy14643 和 RA 對 NT2/D1 細胞生長的影響。細胞分四組，分別 是RA、RA+Wy14643、Wy14643 及對照組。在經四組處理 0 到 48 小 時後，分別以細胞計數器計算0、12、24、48 小時的細胞數。三重覆 的結果以mean ± S.D.呈現。a：p<0.05，表示 RA、RA+Wy14643 及 Wy14643 這三組在不同時間點，分別與對照組比較，在統計上具有顯
Day 1
Day 4
RA RA+Wy14643
Day 7
d c
b a
e f
Day 11
g h
RA RA+Wy14643
Day 14
i j
Day 18
k l
Day 21
m n
Day 23
o p
RA RA+Wy14643
Day 24
q r
Wy14643
Day 24
Control
s t
圖四 RA、RA+Wy14643 及 Wy 對 NT2/D1 細胞分化過程細胞型態的 影響。a、c、e、g、i、k、m、o、q 是 RA 處理組，b、d、f、h、j、l、
n、p、r 是 RA+Wy14643 處理組，s 是 control 組（未加任何藥），t 是 Wy14643 處理組。其中 RA 及 Wy14643 的濃度為 10 μM。RA：retinoic acid。
RA A
Wy
day0 day5 day8 day11 day14 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ － ＋ － ＋ － ＋
β-actin Cx43
B day0 day7 day14 day21 day28 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ － ＋ － ＋ － ＋ RA
Wy Cx43 β-actin
圖五 NT2/D1 細胞經 RA 及 RA+Wy14643 處理不同天數的 Connexin 43 蛋白表現量。（A）0 到 14 天（B）0 到 28 天。RA：retinoic acid，
Wy：Wy14643。
a b
c d
e f
g h
j I
圖六 NT2/D1 細胞經 RA 及 RA+Wy14643 處理不同天數後，以 anti-MAP2 抗體進行細胞螢光染色後用共軛焦顯微鏡觀察 MAP2 蛋白 的表現。a：control，b：Wy14643 處理 14 天，c：RA 處理 9 天，d：
RA+Wy14643 處理 9 天，e：RA 處理 13 天，f：RA+Wy14643 處理 13 天，g：RA 處理 14 天，h：RA+Wy14643 處理 14 天，I：RA 處理 16 天，J：RA 處理 18 天。RA：retinoic acid，Wy：Wy14643。
day0 day5 day8 day1 不同天數的CDK5 蛋白的變化。RA：retinoic acid，Wy：Wy14643。
day0 day5 day8 day1 同天數的p35 蛋白的變化。RA：retinoic acid，Wy：Wy14643。
day0 day5 day8 day1 不同天數的CDK1 及 CDK2 蛋白的變化。RA：retinoic acid，Wy：
Wy14643。
day0 day5 day8 day1
day 0 day5 day8 day11 day14
Relative densitometric units 不同天數的Cyclin D1 蛋白的變化。RA：retinoic acid，Wy：Wy14643。
ERK2
day0 day5 day8 day1 理不同天數的JNK 蛋白的變化。RA：retinoic acid，Wy：Wy14643。
day0 day5 day8 day1
day0 day5 day8 day1 理不同天數的pGsk-3β及 Gsk-3β蛋白的變化。RA：retinoic acid，Wy：
Wy14643。
A
Cell Viavility (% of control)
圖十五 Aβ42濃度對NT2N處理 72 小時的影響。實驗分四組，分別是 對照組（Control）、0.1 μM、0.5 μM及 1.0 μM。在經四組處理 72 小時
後，分別以細胞計數器計算其細胞數。(A)細胞數（B）細胞的存活率。
三重覆的結果以mean ± S.D.呈現。＊：p<0.05，表示 0.1 μM、0.5 μM 及1.0 μM這三組在不同濃度，分別與對照組比較，在統計上具有顯著 性的差異。
0.5 uM AB-time
0 5000 10000 15000 20000 25000
0 6 12 18 24
hour
cell number ＊
＊
＊
＊
圖十六 0.5 μM Aβ42對NT2N細胞處理不同時間的影響。實驗分五個時 間點，分別是對照組（0 小時）、6、12、18、24 小時，Aβ42處理濃度
為0.5 μM。分別以細胞計數器計算其細胞數。三重覆的結果以mean ± S.D.呈現。＊：p<0.05，表示 6、12、18、24 小時這四各時間點，分別 與對照組比較，在統計上具有顯著性的差異。
0.5 uM_AB42-Time
圖十七 Aβ42與Wy14643 對NT2N細胞之細胞週期的影響。NT2N細胞 以control、Aβ42、Aβ42+Wy、Wy14643 四組處理 6-48 小時後PI染色及 流式細胞儀分析細胞週期的變化，其中Aβ42濃度為0.5 μM，Wy14643
為10 μM。A：Control，B：6 hr Wy14643，C：6 hr Aβ42，D：6 hr Aβ42+Wy14643，E：12 hr Aβ42，F：12 hr Aβ42+Wy14643，G：24 hr Aβ42， H：24 hr Aβ42+Wy14643，I：36 hr Aβ42，J：36 hr Aβ42+Wy14643，K：
48 hr Aβ42，L：48 hr Aβ42+Wy14643，M：以Cell Quest進行Sub-G1 的 分析，三重覆的結果以mean ± S.D.呈現。a：p<0.05，表示與對照組比 較，在統計上具有顯著性的差異。b：p<0.05，表示在同時間點的
a a a
Aβ － ＋ ＋ －
control AB AB+Wy Wy
Relative densitometric units control
AB
（control）、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞，
其中Aβ42濃度為0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM。三重覆的結果以 mean ± S.D.呈現。a：p<0.05，表示與對照組比較，在統計上具有顯著 性的差異。b：p<0.05，表示分別與Wy14643 這組比較，在統計上具有 顯著性的差異。
Aβ － ＋ ＋ －
control AB AB+Wy Wy
Relative densitometric units
Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞，其中Aβ42濃 度為0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM。三重覆的結果以mean ± S.D.
呈現。＊：p<0.01，表示分別與其他三組比較，有顯著性意義。
Aβ － ＋ ＋ －
control AB AB+Wy Wy
Relative densitometric units control
AB AB+Wy Wy
α-tubulin
圖二十 不同處理6 小時後Bcl-2/Bax的影響。分為對照組（control）、
Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞，其中Aβ42濃 度為0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM。二重覆的結果以mean ± S.D.
呈現。
Aβ － ＋ ＋ － Wy － － ＋ ＋ p53
p53
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
control AB AB+Wy Wy
Relative densitometric units
control AB AB+Wy Wy
α-tubulin
圖二十一 不同處理 6 小時後p53 的影響。分為對照組（control）、Aβ42、 Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞，其中Aβ42濃度為0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM。三重覆的結果以mean ± S.D.呈現。
Aβ － ＋ ＋ －
control AB AB+Wy Wy
Relative densitometric units
Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞，其中Aβ42濃
度為0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM。三重覆的結果以mean ± S.D.
呈現。a：p<0.05，表示與對照組比較，在統計上具有顯著性的差異。b：
p<0.05，表示與Wy14643 這組比較，在統計上具有顯著性的差異。
Aβ － ＋ ＋ － Wy － － ＋ ＋ pGsk-3β
Gsk-3β
Gsk-3-p/Gsk3
0 0.05 0.1 0.15 0.2
control AB AB+Wy Wy
Relative densitometric units
control AB AB+Wy Wy
α-tubulin
圖二十三 不同處理 6 小時後pGsk-3β/Gsk-3β的影響。分為對照組
（control）、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞 6 小時，其中Aβ42濃度為0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM。二重覆的 結果以mean ± S.D.呈現。
表一 RA 及 Wy14643 對 NT2/D1 細胞 doubling time 的影響
a a,b Doubling time (hours) Control 33.78 ± 1.27
RA 30.59 ± 2.41
RA + Wy14643 27.95 ± 0.15 Wy14643 21.98 ± 3.46
RA、RA+Wy14643、Wy14643 及對照組處理 0 到 48 小時後，以 0、12、
24 及 48 小時的細胞數計算細胞數增加兩倍的時間。三重覆的結果以 mean ± S.D.呈現。a：p<0.001，表示與 Control 比較在統計上具有顯著 性的差異。b：表示與 RA+Wy14643 比較在統計上具有顯著性的差異。
RA：retinoic acid。