過氧化酶體增生接受器-alpha對神經細胞分化及退化的影響; Effects of peroxisome proliferator-activated receptor alpha on neuronal differentiation and degeneration

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(1)第一章. 前言. 第一節實驗緣起阿茲海默症（Alzheimer's disease，AD）是一種神經退化性疾病（neurodegenerative disorder），至今阿茲海默症是造成失智症的最常見原因，八十五歲以上的老年人的失智症幾乎有百分之五十是阿茲海默症所引起的。而六十五歲以上得到阿茲海默症的人口約佔百分之十，但亦有小於65歲甚至更小的人罹患此病症。究其原因年齡增加和家族遺傳是最重要的危險因子。在所有的AD之病例當中，只有10 %的病例具有家族遺傳性（Familial Alzheimer's disease， FAD），而其他90 %的病例則原因未明。且由FAD病人的研究證實和四個基因有高度關係，分別是β-amyloid precursor protein（βAPP）、 Presenilin-1（PS1）、 Presenilin-2（PS2）和Apolipoprotein E（ApoE）。除上述四個基因外最近的研究已證實peroxisome proliferator-activated receptor-α (PPARα) 基因的多型性會增加阿茲海默症的罹患率。因此，活化PPARα基因的表現是否影響神經細胞的分化或者影響Aβ42所誘導的神經細胞毒性作用，乃是本實驗所要探討的重要課題。. 1.

(2) 第二節實驗目的主要探討活化PPARα在NTERA-2 cl.D1（NT2/D1）神經前趨細胞的分化過程以及NT2N神經細胞退化過程的所扮演的角色。實驗分為兩大部分：（一）探討以retinoic acid（RA）誘導NT2/D1細胞分化成神經細胞NT2N的過程中，同時給予Wy14643活化PPARα基因表現對於神經細胞分化有何影響。（二）探討活化PPARα在以Aβ42誘導成熟的神經細胞NT2N凋亡的過程中所扮演的角色。. 2.

(3) 第二章文獻探討第一節神經細胞的分化過程 2-1-1 神經細胞的分化哺乳類動物中樞神經系統中的神經分化及發育是經由一連串事件發生累積而來的[1]。神經系統的發育是由胚胎不斷分裂及分化形成的，而中樞神經系統 (centrol nervous system,CNS) 的發育是由外胚層 (ectoderm) 形成神經板 (neural plate)，再向內凹形成神經溝 (neural groove)，最後形成神經管 (neural tube)。隨著神經管的形成，神經管由原來的柱狀上皮變為偽複層上皮，此時稱為神經上皮（neuroepithelium）或增殖上皮（germinal epithelium）。神經上皮細胞能產生神經元和神經膠質細胞，在上皮細胞進行最後一次有絲分裂後便停止DNA的合成，停滯於細胞週期的G1期，此時停止分裂的細胞開始向神經管外壁遷移形成外套層（mantle layer），而外套層的細胞便會開始進行分化形成軸突和樹突。軸突和樹突是透過生長錐（growth cone）進行生長的，生長錐是位於神經纖維最前喙的一個特殊結構，它具有可動性，亦能向前擴展形成變形蟲樣的指狀突起，稱為纖狀足（filopodia），直接受到生長訊號的調節及來至細胞間隙中的其他分子所引導。可以吸引生長錐導致神經突起轉向或使突起避開訊號來源轉向其他方向，此類的分子稱為化學趨向分. 3.

(4) 子（chemoattractants）及化學排斥分子（chemorepellents）；化學趨向分子可吸引生長錐而化學排斥分子可使生長錐轉向。神經分化的過程期間，細胞間隙存在一些可溶性蛋白，它們對生長中的神經元生長錐的運動具有定像的調節作用。這些蛋白稱做神經營養分子（neurotrophins），它們對神經突起的向外生長，甚至對於神經元的存活都是非常重要的。神經營養分子是由神經元支配的目標組織分泌產生一種蛋白或是多肰分子，藉由神經元上的專一的受器所接收，可維持神經元的存活並可促使分化形成成熟神經細胞。其家族包括有神經生長分子（nerve growth factor , NGF）、brain-derived neurotrophic factor （BDNF）、 neurotrophin-3（NT-3）及NT-4/5[2] 等等。 2-1-2 神經分化過程的調控路徑（一）神經生長因子目前研究發現NGF大概有三條路徑可影響神經細胞的表現及分化。其中較為清楚的一條是：NGF透過其受器 Trk A（receptor tyrosine kinases A）將訊息傳入細胞，活化Ras、Raf，並藉由 mitogen-activated protein kinases（MAPK）之Extra-signal response kinase（ERK）訊息傳導路徑來活化Activator protein 1（AP-1） [3]，進一步誘發神經分化。AP-1 為調控細胞增殖及分化之即發性早期. 4.

(5) 蛋白，可參與多種基因轉錄調節的過程 [4]。神經生長因子（NGF）另外兩條的研究並無像Ras那樣清楚，其中一個路徑是藉由trk A活化 phospholipase C，phospholipase C作用於脂膜上使釋放出兩個細胞內分子： inositol 1,4,5 triphosphate（IP3）和diacylglyceral（DG）。IP3 增加了細胞內Ca2+的濃度， DAG活化了PKC（protein kinase C），藉此間接影響基因的表現。第三條路徑是透過 PI3K （phosphatidylinositol 3-kinase），目前此路徑發現似乎跟神經存活有關。事實上還有許多訊號分子的作用還有待釐清。（二）CDK5/p35 pathway CDK（cyclin dependent kinase）為一系列serine/threonine kinase，正常細胞週期藉由不同時期的Cyclin與不同的CDK結合而運行，而 CDK5 已經知道可以調控細胞週期的G1 進入G0 期（圖一）[5]。實驗證實在哺乳類動物，Cdk5 是需要被p35/p39 所結合活化的[6]，而缺少Cdk5 或是p35/p39 的老鼠，在出生前或出生後期神經軸突會大量的崩解[7-8]。因此Cdk5 和p35/p39 對神經的分化是很重要的。（三）JNK、ERK2 pathway 在分化過程JNK和ERK2 會被活化，進而分別抑制了E2F和eIF4E 使DNA複製受到抑制[9-11]。（四）p38 MAPkinase pathway. 5.

(6) 分化過程p38 會被活化進而抑制cyclin D，抑制了cell cycle的G1 進入S期，p38 以可活化ERK2 而抑制DNA複製[12-13]。（五）Wnt signal 和 GSK-3β pathway Wnt蛋白一開始是發現在果蠅的體節分化有關，目前也已發現根神經分化有關[14]。在神經分化時Wnt signal啟動時會磷酸化Gsk-3β 而抑制GSK-3β活性使得β-catenin不被分解而進入細胞核中與DNA 結合啟動下游基因[15]，因此，分化過程中β-catenin表現量會增加而 GSK-3β會下降。然而，有的研究結果卻是在分化過程早期GSK-3β 蛋白的表現量且活性都是有增加的，但到分化後期GSK-3β表現量並無持續增加而是維持一定的表現量[16]，更有研究指出GSK-3β在 PC12 細胞方面可誘發軸突的分化、樹突的生成[17]。（六）PPARα pathway 最近研究發現GSK-3β是peroxisome proliferator-activated receptor-α (PPARα)的目標基因，可以down regulation GSK-3 的表現 [18]. 。雖有相關文獻指出PPARγ和分化有關，但目前還不是很確定. PPARα是否有相同效果。. 2-1-3 體外研究神經細胞分化的模式外胚層幹細胞從形成了神經前趨細胞(neural progenitor cells). 6.

(7) 最後成為成熟的神經元 (neurons) 或神經膠細胞 (glia) [19]。在這分化過程當中不只是在不同時期會表現不同基因產物，同時也受到不同生長因子的調控，但在這分化過程還有許多地方能須釐清。由於成熟的神經細胞以不再進行細胞分裂，因此，很多學者利用許多具有神經性的細胞株來研究神經系統的發育及細胞分化。在 1981 年 Martin 等人成功自鼠類囊胚中分離培養出胚胎幹細胞 (embryonic stem cells, ES cells)，這些幹細胞可於體外培養並且不斷分裂增生，在一些誘發劑處理後幹細胞可以分化為各類型細胞，像是內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、神經元、神經膠細胞及平滑肌等[20]。P12 和 P19 就是由鼠類所培養出來的細胞株且都已被證實可利用神經生長因子 (NGF) 或retinoic acid(RA) 使其分化成神經細胞[21]，而 NTERA-2 cl.D1 (NT2/D1) 是人類畸胎瘤中培養出可分化為神經元的細胞株，經由RA 處理NT2/D1 細胞數週之後，細胞會形成許多神經突 (neurites) 結構並表現多種成熟神經特有蛋白質，此分化的細胞稱為NT2N[22-23]。因此NT2/D1 是用來研究神經分化很好的模型。而有另一種神經細胞-神經前趨細胞 (Neural progenitor cell) 亦被用於研究上，神經前趨細胞存在於中樞神經系統 (central nervous system, CNS)，在胚胎期動物主要位於大腦皮質、小腦、脊髓及海馬迴 (hippocampus)[24-25]，在成年期動物主要位於側腦室之腦室下區域. 7.

(8) (subventricular zone, SVZ) 及海馬迴 (hippocampus) 之齒狀腦迴 (dentate gyrus)；相較於幹細胞，神經前趨細胞其具有受限的 (limited) 神經生長及分化能力。神經前趨細胞的培養是利用數種有絲分裂因子，如神經生長因子 (nerve growth factor, NGF)、上皮生長因子 (epidermal growth factor, EGF)等處理之[26-27]，再以含有 N2 或 B27 血清培養液去誘發分化成神經細胞。上述細胞都是常用於研究神經細胞分化很好的模式。. 2-1-4 Retinoic acid 誘使神經前趨細胞分化 NT2/D1是一種human teratocarcinoma cells，經all-trans retinoic acid（all-trans RA）幾週的誘導即可成為神經細胞。all-trans retinoic acid是Retinol經去氫酶的作用代謝而來。Retinol在進入細胞後，可被兩種binding protein所攜帶，分別是Cytoplasmic Retinol binding protein I 和 II（CRBP-I and CRBP-II），而retinoic acid可藉由Cellular retinoic acid binding proteins I and II（CRABP-I和II）進入細胞核與 retinoic acid receptor（RAR)或retinoid X receptor（RXR）結合啟動下游基因的作用。CRABP-I和CRABP-II的作用是不同的，RA如和 CARBP-I結合則會被分解[28]；如和CRABP-II結合則可被協助進入細胞核中作用[29]。在細胞核中的RA因形式不同結合的也不同，all-trans 8.

(9) retinoic acid和9-cis retinoic acid皆可結合到RAR上進而作用在DNA 序列上[30]，但RXR卻只能和9-cis RA做結合[31]。目前已經很多學者證實RA也可以誘發P19[32]、 NTERA-2 [33]、 ES cells [34]、PC12和LAN-5 [35]等細胞分化成神經細胞。RA藉由 CRABP進入細胞中和RAR或RXR結合到DNA上，啟動了與神經分化相關的蛋白作用，像是AP-1、JNK、PI3K等，2004年Richard在Mutation Research發表的一篇review，提到RA作用在不同細胞株上所誘發其他蛋白的表現，其中對neuroblastoma和teratocarcinoma這兩類細胞中，AP-1、JNK和PI3K會因RA的作用升高，而AP-1、JNK和PI3K 皆可以促使神經細胞的分化。. 第二節神經細胞的退化 2-2-1 阿茲海默症阿茲海默症（Alzheimer's disease，AD）是一種神經退化性疾病（neurodegenerative disorder），目前分為早發性（early-onset）和遲發性（late-onset），早發性是指65歲前發病，但此案例較少。遲發性是指65歲後發病。主要的症狀包括記憶力、方向感、邏輯推理能力等大腦認知功能的衰退[36]。Alois Alzheimer 醫師於1906 年時首次發現此病症，並發現部分失智病患的大腦皮質切片中，具有二種. 9.

(10) 特殊的病理特徵，分別是神經細胞內的神經纖維糾結（neurofibrillary tangles）以及神經細胞外的老化斑（senile plaques）。神經纖維糾結是由崩解的神經微管(microtubule) 形成不溶性的細胞內糾結物[37]，其形成和Tau蛋白被大量磷酸化有關[38]。Tau 蛋白的功能是可以維持微管的完整性其及功能，但當Tau蛋白大量被磷酸化後，蛋白質的構形改變使其功能喪失，神經微管因而崩解。神經細胞外的老化斑（senile plaques）是指神經細胞間的球形纏結物，其核心是由β-amyloid(Aβ）沈積所構成[39-40] 。現今對AD 的成因仍未能有定論的情況下，此二種病理特徵至今依舊被認定為診斷AD 之直接證據。此外，目前已知有四個基因和阿茲海默症有關。分別是包括有 β-amyloid precursor protein（β-APP）基因[41]， Presenilin-1（PS1）基因[42]， Presenilin-2（PS2）基因[43]，以及ApoE 基因[44]。βAPP 基因，位於第21對染色體，轉錄後產生Amyloid Precursor Protein （APP），經α、β和γ-secretase裂解後形成大小不一的類澱粉蛋白（Amyloid Protein），進而引發老年癡呆的種種病症。PS1基因，位於第14 對染色體； PS2基因，位於第1 對染色。研究指出PS1或PS2 的突變都會導致類澱粉蛋白增加。ApoE基因，位於第19 對染色體上，根據研究指出，ApoE4 與晚發型阿茲海默症有關聯，主要是. 10.

(11) ApoE4 對於類澱粉蛋白有高度的親合力，原因有可能為加速類澱粉蛋白的沉積的結果。此外類澱粉樣蛋白沉積與ApoE4含量成正相 [45]. ，且ApoE等與磷酸化作用亦有關聯[46]。除上述四個基因外最近的研究已證實peroxisome. proliferator-activated receptor-α (PPARα) 基因的多型性L162V會增加阿茲海默症的罹患率[47]。. 2-2-2 類澱粉蛋白（β-Amyloid Protein,Aβ）與阿茲海默症目前已知Aβ似乎在AD 的致病機轉上扮演重要的角色。如前所述，Aβ是senile plaque 核心中的主要物質，其組成是含40-43個胺基酸的短胜鏈。然而，Aβ本身並不是異常的蛋白，而是細胞正常代謝下的產物，無論是在培養細胞的培養基中，甚至是腦脊髓液（cerebrospinal fluid）中，都有到Aβ的存在[48]。而在正常的情況下 βAPP 進行α-secretase pathway多過於β-secretase pathway。 α-secretase pathway是APP蛋白受到α-secretase作用後裂解成α-APP 及一10 KDa小片段的蛋白，而β-secretase pathway是APP受到 β-secretase作用後裂解成此β-APP及一12 KDa小片段的蛋白；而10 KDa及12 KDa皆被γ-secretase作用後，分別會裂解為p3、p7和Aβ、 p7（圖二）。Aβ主要可分為兩種形式，分別是Aβ40和Aβ42。在AD 11.

(12) 病人腦部，可發現Aβ40及42的比列越來越高[49]，而且在神經細胞及非神經細胞的研究發現，Aβ42具有細胞毒性（cytotoxicity）[50]，故 Aβ42過量一直被認為是造成AD的原因之一。. 2-2-3 Aβ42的neurotoxity Aβ42是senile plaque 核心中的主要物質，當在細胞內大量堆積時，會對細胞造成毒性導致死亡。在神經細胞方面已知Aβ42會透過活化GSK-3 進而磷酸化Tau蛋白[51]，大量的Tau蛋白被磷酸化使其功能喪失而會造成神經微管的崩解，進而形成病理上看到的神經纖維糾結（neurofibrillary tangles）。 Aβ42所引起的神經細胞的凋亡是透過caspase 3 的路徑[52]。近年來發現調控細胞走向計畫性細胞死亡的過程其實包含 caspase-dependent和caspase-independent兩種路徑[53]。所謂 caspase-independent之細胞凋亡路徑是指細胞發生細胞凋亡的過程中不需經由caspases 調控。Endonuclease G（Endo G）是 caspase-independent之細胞凋亡調控因子之一，由細胞核內的DNA所轉錄出蛋白後再送到粒腺體中。當Endo G從粒線體釋出後轉移至細胞核內時會切斷雙股或單股DNA造成DNA裂片現象且亦會影響粒線體膜電位改變促使粒線體內的物質釋出[54]；同樣屬於. 12.

(13) caspase-independent之細胞凋亡調控因子還有granzyme B和AIF (apoptosis-inducing factor)。目前已知Aβ42與caspase 3 是有相關但與 caspase-independent之間還不是很清楚。. 2-2-4 Aβ42對hippocampal neurons和NT2N的影響 Aβ42所引起的毒性會對神經細胞的軸突造成的萎縮及對樹突的功能喪失[55]。目前也已經確定Aβ42會造成hippocampal neurons和 NT2N這兩株神經細胞的死亡，主要的原因是大量Tau蛋白被GSK3-β 所磷酸化[56-57]。也有研究證實用鋰（Lithium）抑制GSK3-β的活性，確實可以減少Tau蛋白因Aβ42所引起的大量磷酸化現象，進而增加 Tau蛋白和神經微管(microtubular)結合維持神經正常功能[58-60]。 Aβ42除了活化GSK3 使神經細胞凋亡外，p35 亦會因為Aβ42而裂解成為p25[61]，p35 和p25 皆可和CDK5 結合。CDK5/p35 結合可以促使細胞分化，但如是p35 裂解成CDK5/p25 則會大量磷酸化Tau蛋白 [62]. ，進而造成神經細胞的死亡。由於Aβ42所引起的訊息會造成神經細胞的凋亡，因此細胞內有. 一個重要的路徑會被活化，即是Wnt signal pathway。Wnt的訊息傳遞在精神分裂[63-64]和阿茲海默症[65-66]方面扮演重要角色。Wnt會和細胞膜上的受器Frizzled（Fzd）結合並活化dishevelled（Dvl）進而抑. 13.

(14) 制GSK-3β的活性，當GSK-3β被抑制時，則β-catenin可結合到DNA 啟動下由基因的表現，像是cyclin-D1,c-myc, engrailed-1, connexin 30 and 43, ephrin-B, fibronectin, MusK and E-cadherin等等[13]。藉此一方面可抑制GSK-3，亦使β-catenin啟動其下由基因幫助細胞增生、增加黏附及抗細胞凋亡等等。. 2-2-5 PPARα在Aβ42-induced neurotoxity的角色最近的研究證實GSK-3β是PPARα的目標基因，PPARα可抑制 GSK-3β的活性[16]。而Aβ42在神經細胞方面會造成GSK-3β的活性大幅增加，因此，如果在此時給於PPARα的促進劑，像是Wy14643，或許能藉由抑制GSK-3β的活性來減少神經細胞的凋亡。. 14.

(15) 第三章研究架構與研究設計第一節研究架構本實驗分為兩階段，第一階段為探討以retinoic acid（RA）誘導 NT2/D1 細胞分化成神經細胞NT2N細胞的過程中，同時給予 Wy14643 活化PPARα基因表現對於神經細胞分化有何影響。第二階段探討活化PPARα在以Aβ42誘導成熟的神經細胞NT2N凋亡的過程中所扮演的角色。. 第二節研究設計 3-2-1 神經分化方面以 RA 處理 NT2/D1 細胞四週使其分化成 NT2N 細胞，在過程中額外給予 Wy14643 來活化 PPARα的基因表現藉以探討 PPAR 與神經分化過程的相關性。實驗分為四組，分別為對照組、RA、 RA+Wy14643 及 Wy14643，觀察不同天數細胞型態的變化及和分化相關的蛋白變化。 3-2-2 神經退化方面分化後的神經細胞NT2N給予Aβ42使其凋亡，並在這同時給予 Wy14643 活化PPARα藉以探討其在NT2N退化所扮演的角色為何。. 15.

(16) 實驗分為四組，分別為control、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643，處理的時間為 0 到 48 小時。加藥過程中觀察其型態上的變化，並以流式細胞儀來偵測Sub-G1 的細胞族群，最後再以西方點墨法來分析 Apoptosis相關的蛋白表現。. 16.

(17) 第四章研究材料及研究方法第一節研究材料 4-1-1 細胞株 NTERA-2 cl.D1（NT2/D1）細胞株購買於食品工業研究所。 4-1-2 藥品 Merck公司：KCl、NaCl、NaF、 KH2PO4、Na2HPO4 Sigma 公司：Arachidonic acid 、Bovine serum albumin（BSA）、 Wy14643、all-trans retinoic acid、DMSO、 N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylene-diamine（TEMED）、 Propidium iodide、EDTA、Triton X-100、NP-40、SDS、 Sodium deoxycholate、PMSF、Leupeptin、Aprotinin、 2-Mercaptoethanol、Ammonium persulfate、glycerol、 Sodium bicarbonate、PEG、Sodium orthovanadate Bio-Rad 公司：40% acrylamide/bis-acrylamide solution(37.5:1) Amresco 公司：10X TG-SDS buffer、10X TG buffer GIBCO 公司：Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)、 Penicillin/Streptomycin、L-glutamine、0.25% Trypsin Fermentas Life Science 公司：PageRuler Prestained Protein Ladder Pierce 公司：SuperSignal® West Pico Chemiluminescence Substrate. 17.

(18) USB 公司：Tris、Trisodium dicitrate PerkinElmer 公司：PVDF Transfer Membrane Cell Signaling 公司：Prestained Protein Marker,Broad Range Fluka 公司：Methanol Panreac 公司：Tween-20 Worthington Biochemical corporation：Ribonuclease A 4-1-3 抗體 Santa Cruz Biotechnology 公司： anti-connexin 43、anti-p35 antibody、 anti-p-Gsk3-β antiboby、anti-p53 antibody、anti-β-catenin antibody、anti-CDK 2 antiboby、anti-ERK 2 antiboby、anti-Bax antiboby、anti-Bcl-2 antiboby、anti-caspase 3 antibody、 anti-α-tubulin antibody、anti-β-actin antiboby、antibody、 anti-mouse IgG-HRP、anti-rabbit IgG-HRP、anti-goat IgG-HRP antibody Cayman Chemical 公司：anti-PPARα antibody BD Transduction Laboratories 公司：anti-Cdk 1 antibody Cell signal 公司：anti-JNK antibody Upstate 公司：anti-Cyclin D1/2 antibody Stressgene 公司：anti-CDK5 antibody、anti-Gsk3-β antibody、. 18.

(19) Sigma 公司：anti-microtubule-associated protein 2 antibody、anti-Endo G antibody 4-1-4 儀器流式細胞儀 (FACS CaliburTM, Becton Dickinson, NJ, USA )、垂直式無菌操作台、倒立式光學螢光顯微鏡、細胞培養箱、液態氮筒、細胞計數器、ELISA reader ( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay reader)、Hoefer 電源供應器、BioRad 蛋白質電泳槽、BioRad 濕式蛋白質轉漬槽、水浴槽、震盪器、UV 燈、秤重天秤、-80℃與-20℃ 冷凍冰箱、4℃冷藏冰箱、5 mL 與 10 mL 無菌吸管、12-well 與 6-well 細胞培養皿、25 T 細胞培養瓶、離心管(1.5 mL、15 mL、50 mL)，細胞冷凍管、鐵架、0.22 μm 過濾器、PVDF 轉漬膜、、柯達 X 光底片、Fuji 洗片機、Kubota 離心機、共軛焦顯微系統、載玻片等。. 第二節實驗方法. 4-2-1 RA、Wy14643 及Aβ42之配置 RA的置備：50 mg的RA粉末加入 3.329 ml的DMSO，此濃度為 5×10-2 M，使用前用DMAO稀釋 10 倍方可使用，1 倍的濃度是 5×10-3 M，使用方式為每 1 ml的培養液加入 1 倍RA 2 μl使RA最後在培 19.

(20) 養液的濃度為 10 μM。原液及 1 倍的RA要避光存放於-20 ℃。 Wy14643 的置備：取Wy14643 的粉末 1.619 mg溶於 1 ml的DMSO 中，濃度為 5×10-3 M，使用方式為每 1 ml的培養液加入 2 μl的 Wy14643 使其最後在培養液的濃度為 10 μM。 Aβ42的置備：0.1 mg的Aβ42粉末加入 221.5 μl的無菌水，濃度為 100 μM，存放於 -80 ℃。 4-2-2 神經前趨細胞NT2/D1 的培養[67-69] NT2/D1 細胞株培養於 10% FBS、4 mM glutamine，100 μg/ml streptomycin 和 100 U/ml penicillin 的 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)中。實驗中的細胞依所分之組別分別給予不同藥物及天數的處理。細胞株放置於 37 ℃，5% CO2，溼度 95%的培養箱中培養。而分化後的細胞 NT2N 亦培養於相同條件下並依所分之組別給予不同藥物及時間的處理。 4-2-3 RA 及 Wy 對 NT2/D1 細胞的生長影響之分析培養中的細胞經過胰蛋白酶的作用一分鐘後，加入等量含 3% FBS的DMEM以中止胰蛋白酶的作用，取出細胞至 15 mL離心管，以 1000 rpm離心 5 分鐘，移除上清液後拍散細胞，再加入適量的培養液。之後將NT2/D1 細胞平均分盤至 12 孔盤中，細胞數為 1×105個 /well。經 24 小時後，實驗設計分為四組，分別為對照組、RA、. 20.

(21) RA+Wy14643 及Wy14643，其中RA和Wy14643 的最終濃度為 10 μM，分別處理了 0、12、24、48 小時並利用細胞計數器計算細胞。細胞計數時，先移去培養基，以PBS洗三次，加入 300 μL胰蛋白酶作用一分鐘，再加入 300 μL含血清的培養液終止反應，將其收集至 15 ml的離心管中，1000 rpm離心 5 分鐘，倒掉上清液後將細胞均勻拍散，加入適當的培養液，取 10 μl的細胞液與等量的trypan blue混合均勻，再從混合液中取出 10 μl至細胞計數器中計算。所得數據乘以 2，再乘以 1×104即是 1 ml中所含之細胞數。 4-2-4 NT2N 細胞存活率之分析將NT2/D1 細胞平均分盤至 6 孔盤中，細胞個數為 5×105個 /well。經 24 小時後，給予RA（最終濃度為 10 μM）處理細胞促使其分化，每三天換一次培養液並額外加入RA，持續給予RA十四天。十四天的處理使得NT2/D1 分化為NT2N。十四天後加入不含RA的培養液培養兩天，之後，加入不同劑量的Aβ42（0、0.5、1.0、2.0 μM）及處理不同時間（0、12、24、48 小時）。細胞數目計數是使用細胞計數器（Cell Coulter）。細胞計數時，先移去培養基，以PBS洗三次後，加入 500 μL胰蛋白酶作用一分鐘，再加入 500 μL含血清的培養液終止反應，將其收集至 15 ml的離心管中，1000 rpm離心 5 分鐘，倒掉上清液，用受將細胞均勻拍散，加入適當的培養液，取 10 μl. 21.

(22) 的細胞液與等量的trypan blue混合均勻，再從混合液中取出 10 μl至細胞計數器中計算。所得數據乘以 2，再乘以 1×104即是 1 ml中所含之細胞數。 4-2-5 NT2N 細胞週期分析將NT2/D1 細胞平均分盤至 6 孔盤中，細胞數為 5×105個/well。經 24 小時後，給予RA（最終濃度為 10 μM）處理細胞促使其分化，每三天換一次培養液並額外加入RA，持續給予RA十四天。十四天的處理使得NT2/D1 分化為NT2N，每隔 6 小時收一次細胞直至 48 小時。細胞必須先經過酒精固定隔夜後，才能使用流逝細胞儀進行細胞週期分析。細胞固定過程為將培養基移除，以PBS洗三次後，加入 500 μL胰蛋白酶作用一分鐘，再加入 500 μL含血清的培養基終止反應，細胞懸浮液移至 15 mL離心管，以 1200 rpm離心 4 分鐘後，倒掉上清液，細胞拍散後加入PBS，再以 1200rpm離心 4 分鐘，之後倒掉上清液，細胞拍散後，加入 1mL含有 2% FBS的PBS，使細胞均勻分布後，再加入 80%酒精固定細胞，移至-20℃冰箱凍存，隔夜後以流式細胞儀進行細胞週期分析。酒精固定的細胞先解凍後，以 1200 rpm 離心 4 分鐘，倒掉上清液，細胞拍散後加入 PBS，再以 1200 rpm 離心 4 分鐘，之後倒掉上清液，細胞拍散後，加入 0.5 mL solution A（3.4 mM sodium citrate，. 22.

(23) PEG 6000，0.1% Triton X-100，44 units/mL RNAase，0.05 mg/mL propidium iodide），置於 37 ℃半小時後，再加入 0.5 mL solution B （0.56 mM NaCl，PEG 6000，0.1 % Triton X-100，0.05 mg/mL propidium iodide），避光置於 4 ℃一個小時後，用流逝細胞儀進行細胞週期分析。以 Cell Quest 軟體進行 10000 顆細胞的收集並進行細胞週期的分析。 4-2-5 細胞免疫螢光染色法[70] 先將玻片用 0.1 mg/ml 的 poly-D-lysine 處理後，在 6 孔培養盤中放入六片處理過的玻片，再將 NT2/D1 細胞直接培養於有玻片的 6 孔培養盤中。經 RA、RA+Wy14643、Wy14643 處理 0、9、12、13、 14、16 與 18 天後，用 1×PBS 清洗細胞三次，細胞以-20 ℃甲醇固定一小時後，用 1×PBS 清洗細胞二次。細胞玻片檢體置於 0.1% Triton X-100/PBS 於室溫中反應 30 分鐘，再用 1×PBS 清洗細胞後，加入 microtubule-associated protein 2 antiboby，在 37 ℃下避光反應 1 小時後，用 1×PBS 清洗細胞 3 次，再以 anti-mouse IgG-FITC 二次抗體在 37 ℃下避光反應 1 小時，最後用 1×PBS 充份洗去殘留的抗體後，以共軛焦顯微鏡觀察不同天數 MAP2 之變化。 4-2-6 全細胞抽取液 ( Total cell extract ) 之製備細胞經不同時間及藥物處理後，將細胞刮取下來，以 3000 rpm. 23.

(24) 離心五分鐘後，去除上清液後加入適量 RIPA buffer ( pH 7.4 50 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、1 mM EGTA、0.05% 2-mercaptoethanol、150 mM NaCl、1% NP-40、0.25% sodium deoxycholate、0.2 mM PMSF、 5 μg/μL Leupeptin、5 μg/μL Aprotinin、0.1 mM NaF、2 μg/μL sodium vanadate)於冰上作用 30 分鐘，以 14000 rpm 離心 30 分鐘，收集上清液並測量蛋白質濃度。 4-2-7 蛋白質含量測定蛋白質溶液經適當稀釋後，先將 200 μL Bio-Rad protein assay 試劑（稀釋五倍）加入 96 well ELISA microplate，再取 10 μL 待定量的稀釋樣品及系列稀釋之標準溶液 BSA 中，均勻搖勻後，於室溫下反應 5 分鐘後，以 ELISA reader 測 620 nm 吸光值。根據標準曲線計算樣品之蛋白質濃度。 4-2-8 西方點墨法將蛋白質濃度稀釋為 1mg/mL，置於沸水煮 5 分鐘，待冷卻後將等量蛋白質樣品分別加入各個樣品凹形槽中，利用 10-12% SDSpolyacylamide gels 及 30mA 電流分離蛋白質。轉印（Transfer）時，PVDF 轉印膜先以甲醇活化 5 秒鐘後，以二次水浸潤二分鐘，再以 transfer buffer（25 mM Tris-HCl，pH 8.4，含 192 mM glycine 及 15% methanol）浸潤五分鐘後備用。蛋白質分. 24.

(25) 離後，將 stacking gel 去除，留下 separating gel，依序將海綿、濾紙、 separating gel、PVDF 膜、濾紙、海綿放於三明治夾板中，接著放入轉印槽中，灌滿 transfer buffer，以 70 伏特電壓進行轉印二小時，轉印期間都是於冰浴下進行。轉印完成後，取出 PVDF 膜，以 PBST （PBS + 0.1% Tween-20）清洗 2 次，每次十分鐘，之後放入 5%脫脂牛奶中進行 blocking，放於 4 ℃，隔夜後進行免疫染色。將 PVDF 轉印膜由 5%脫脂牛奶中取出，以 PBST 沖洗 3 次，每次 5 分；接著將 PVDF 轉印膜置於一級抗體中，於室溫下作用兩小時取出。各種一級抗體稀釋倍率如下：PPARα（1:500）、 CDK5(1:500)、CDK1（1：500）、CDK2（1：500）、p35（1：500）、 Gsk-3β（1：500）、pGsk-3β（1：500）、Connexin 43（1：500）JNK （1：500）、ERK2（1：1000）、β-catenin（1:1000）、Cyclin D1（1:1000）、 Actin（1:1000）、α-Tubulin（1:1000）。PVDF 以 PBST 清洗 6 次，每次 10 分鐘；接著置於接有 HRP 之 anti-rabbit IgG、anti-mouse IgG、 anti-goat IgG 的二級抗體（1:3000）中，於室溫下作用 1 小時取出。 PVDF 以 0.3% PBST 清洗 2 次，每次 10 分鐘，再以 0.1% PBST 清洗 6 次，每次 10 分鐘。最後以 ECL 試劑組呈色，Kodak X 光底片曝光呈像，並利用 Kodak EDAS 290 軟體進行分析。 4-2-9 統計分析. 25.

(26) 結果以 mean ± S.D.呈現。使用統計分析軟體 SPSS ver. 10.0.7C 進行結果的分析統計，採用的方法是單因子變異數分析法的 Post Hoc 檢定中的 tukey 進行多重比較。. 26.

(27) 第五章研究結果第一節. Wy14643 活化 PPARα對 NT2/D1 細胞分化過程之影響. 5-1-1 Wy14643 和 RA 對 NT2/D1 細胞生長的影響如圖三，實驗共分四組，分別是 RA、RA+Wy14643、Wy14643 及對照組，分別以細胞計數器計算 0、12、24 及 48 小時的細胞數。分析結果發現，Wy14643 這一組在 48 小時比起 48 小時的對照組有顯著性的意義(p<0.05)，表示 Wy14643 處理 48 小時後會增加 NT2/D1 細胞的增生，另外若同時處理 RA 及 Wy14643 比只處理 Wy14643 可顯著降低細胞生長(p<0.05)。以 0、12、24 及 48 小時 4 個時間點及其細胞數，進一步計算 NT2/D1 細胞的 doubling time（表一），對照組細胞數增生為兩倍的時間為 33.78 ± 1.27 小時，RA 處理的為 30.59 ± 2.41 小時， RA+Wy14643 這一組為 27.95 ± 0.15 小時，Wy14643 這一組為 21.98 ± 3.46 小時。分析結果發現 RA+Wy14643 及 Wy14643 這兩組和對照組比較有顯著性的意義(p<0.001)。表示此 RA+Wy14643 及 Wy14643 處理後會使 NT2/D1 細胞加快增生的速度。此外，只處理 Wy14643 比同時處理 RA 及 Wy14643 可縮短細胞的 doubling time（p<0.05）。 5-1-2 RA、RA+Wy14643 及 Wy 對 NT2/D1 細胞分化過程細胞型態影響如圖四，由細胞型態上觀察 Control、RA、RA+Wy14643、. 27.

(28) Wy14643 四組處理 NT2/D1 細胞 28 天發現 Control 及只用 Wy14643，細胞型態並無很大的變化。而由細胞型態上觀察 RA 和 RA+Wy 這兩組可發現細胞型態有很大的變化，都有看到神經軸的生長。經 RA 誘導 23 天後細胞開始死亡。 5-1-3 成熟神經細胞的 mark protein：Connexin 43 和 MAP2 分化過程中，connexin 43（Cx43）此蛋白會隨著 RA 的處理逐漸不表現（圖五），不管是 RA 或是 RA+Wy14643 這組，在處理十四天後幾乎看不見 Cx 43 的表現。換言之，在 NT2/D1 細胞時會表現 Cx 43，而在分化後的 NT2N 細胞並不會表現此蛋白。在 microtubule-associated protein 2（MAP2）的表現恰與 Cx 43 相反，MAP2 只在 NT2N 神經細胞表現。利用共軛焦顯微鏡觀察處理九至十八天的神經細胞可以看到不管是在 RA 或是 RA+Wy14643 這兩組都有 MAP2 的表現。但 Control 與只單獨 Wy14643 處理十四天的細胞並無看到 MAP2 的表現（圖六）。因此，RA 或 RA+Wy14643 的處理確實可以促使 NT2/D1 分化為神經細胞 NT2N，而單獨只處理 Wy14643 並不會使其分化。 5-1-4 RA 及 Wy14643 對 NT2/D1 細胞分化為 NT2N 細胞的過程中對 CDK5/p35 的影響 CDK5/p35 是神經分化 G1 進入 G0 的重要調控點。在 RA 及. 28.

(29) RA+Wy14643 這兩組中，隨著處理時間越來越長，其兩組的 CDK5 （圖七）和 p35（圖八）蛋白的表現量皆有增加的趨勢，且 CDK5 在 RA+Wy14643 這一組增加的較多（圖八）。 5-1-5 RA 及 Wy14643 對 NT2/D1 細胞分化為 NT2N 細胞的過程中對 CDK1/CDK2 的影響在 NT2/D1 細胞的分化成 NT2N 的過程 CDK1 和 CDK2 的表現量應是會越來越低，但在實 RA 組及 RA+Wy14643 組並無明顯差別（圖九）。 5-1-6 RA 及 Wy14643 對 NT2/D1 細胞分化為 NT2N 細胞的過程對 Cyclin D1 的影響 Cyclin D1 可促使細胞週期由 G1 進入 S 期。由圖十可發現在兩組的 Cyclin D1 表現都是隨時間而下降的。 5-1-7 RA 及 Wy14643 對 NT2/D1 細胞分化為 NT2N 細胞的過程對 ERK2/JNK 的影響 ERK2 和 JNK 都可促使 NT2/D1 分化為 NT2N，在實驗中可看到 ERK2(圖十一)和 JNK（圖十二）在 RA 及 RA+Wy14643 這兩組中都有增加的趨勢，且 ERK2 在 RA+Wy14643 這組的表現量增加較多。 5-1-8 對 β-catenin 的影響. 29.

(30) β-catenin 在 RA 及 RA+Wy14643 這兩組中都有增加的趨勢（圖十三），且在 RA+Wy14643 有較高的趨勢。 5-1-9 RA 及 Wy14643 對 NT2/D1 細胞分化為 NT2N 細胞的過程對 pGsk-3β/Gsk-3β的影響 Gsk-3β無磷酸化的狀態是具活性的，有磷酸化的狀態是失活的。因此，pGsk-3β/Gsk-3β 的比值如越高表示 pGsk-3β的量相對較多，此時是不具活性的；反之，如越低則是表示具活性的狀態是較高的。由圖十四可發現在 NT2/D1 分化越完全時 pGsk-3β/Gsk-3β的比值有越來越高的趨勢的。. 第二節活化 PPARα對 NT2N 細胞退化之影響 5-2-1 Aβ42濃度對NT2N細胞處理 72 小時的影響 Aβ42濃度分為四組，分別是對照組（Control）、0.1、0.5 及 1.0 μM。此四組處理 72 小時後，計算其細胞存活率（圖十五），由結果發現 0.1、0.5 及 1.0 μM與對照組比較皆有顯著性的意義（圖十五.A），0.1、0.5 及 1.0 μM此三組的細胞存活率分別為 66%、59%、 45%（圖十五.B）。由於三組濃度皆會對NT2N細胞存活率有顯著性影響。因此，實驗採用 0.5 μM此濃度來處理細胞。 5-2-2 Aβ42對NT2N細胞處理不同時間的影響 30.

(31) Aβ42以 0.5 μM處理五個時間點，分別是對照組（0 小時）、6、 12、18、24 小時，並以細胞計數器計算其細胞數，結果發現在 6 小時細胞數已開始下降，與Control相較下，有統計上的意義（圖十六）。除 6 小時外，其他的時間點的細胞數與對照組相較也是有統計上的意義的。 5-2-3 Aβ42與Wy14643 對NT2N細胞之細胞週期的影響以 0.5 μM Aβ42及 10 μM Wy14643 處理NT2N細胞 0 到 48 小時。實驗共分四組，分別為control、Aβ42、Aβ42+Wy、Wy14643。由流式細胞儀的結果發現Aβ42在 12 小時Sub-G1 的細胞族群開始增加且呈時間依存性，而且Aβ42+Wy14643 24 小時後明顯高於只加Aβ42 （P<0.05）。 5-2-4 Aβ42及Wy14643 對NT2N細胞處理 6 小時後Caspase 3 之影響經對照組（control）、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞 6 小時後(其中Aβ42濃度為 0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM)，如圖十八結果顯示Aβ42及Aβ42+Wy14643 分別和control 及Wy14643 比較，Caspase 3 皆有顯著的增加（p<0.05）。 5-2-5 Aβ42及Wy14643 對NT2N細胞處理 6 小時後Endo G的影響經對照組（control）、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞 6 小時後(其中Aβ42濃度為 0.5 μM，而Wy14643 濃度 31.

(32) 為 10 μM)，如圖十九結果顯示Aβ42+Wy14643 這一組相較其他三組在 Endo G的表現有明顯的增加（p<0.05）。 5-2-6 Aβ42及Wy14643 對NT2N細胞處理 6 小時後Bcl-2/Bax的影響 Bcl2/Bax的相對值是與細胞凋亡有關的，Bcl-2/Bax的比值較低表示Bax有相對較高的量，此時會促使細胞走向凋亡。經對照組（control）、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞 6 小時後(其中Aβ42濃度為 0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM)，如圖二十結果顯示Bcl2/Bax在Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 相較於 control其比值皆較低。 5-2-7 Aβ42及Wy14643 對NT2N細胞處理 6 小時後p53 的影響經對照組（control）、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞 6 小時後(其中Aβ42濃度為 0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM)，對p53 的影響在四組之間並未觀察到的明顯變化(圖二十一)。 5-2-8 Aβ42及Wy14643 對NT2N細胞處理 6 小時後β-Catenin的影響經對照組（control）、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞 6 小時後(其中Aβ42濃度為 0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM)，圖二十二結果顯示β-Catenin在Aβ42及Aβ42+Wy14643 這二組相較於其他組都有較高的表現（p<0.05）。. 32.

(33) 5-2-9 Aβ42及Wy14643 對NT2N細胞處理 6 小時後pGsk-3β/Gsk-3β之影響經對照組（control）、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞 6 小時後(其中Aβ42濃度為 0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM)，圖二十二結果顯示Aβ42這一組pGsk-3β/Gsk-3β有較低的比值，表示此組具活性的Gsk-3β較多。. 33.

(34) 第六章討論本實驗的在神經分化過程的研究設計上分為四組 control、RA、 RA+Wy14643、Wy14643。RA 是促使神經前趨細胞 NT2/D1 分化成 NT2N 所必須的，分化的時間大約需要兩週，而 Wy14643 是 PPARα 的 ligand，可用來活化 PPARα，實驗結果發現單獨以 Wy14643 來處理 NT2/D1 細胞並不會促使 NT2/D1 細胞分化，因此，我們將實驗焦點放在 RA 及 RA+Wy14643 這兩組之間，藉以探討有活化 PPARα 和無活化的情狀下對 NT2/D1 細胞分化上的影響。已知CDK5/p35 在神經分化的過程是很重要，可調控細胞由G1 進入G0 時期，因此分化過程中會大量表現[5]。在我們的實驗結果顯示RA及RA+Wy14643 這兩組在分化過程中CDK5/p35 確實隨著處理時間越長而增加。不僅在CDK5/p35 而已，在ERK2、JNK、β-catenin 以及pGsk-3β/Gsk-3β也是隨處理時間越長而增加，這些因子的增加是有助於分化的。β-catenin是Wnt signal pathway重要的中間蛋白。 Wnt signal一開始是發現和果蠅體節分化有關，目前也知道其和神經分化有關[14]。當Wnt蛋白結合到細胞膜上受器時，會使Gsk-3β磷酸化而失去活性，進而使β-catenin進入細胞核中與DNA結合而起動下游基因的表現。因此在分化過程中β-catenin會增加且pGsk-3β/Gsk-3β 的比值亦會增加，而這與實驗結果是相符合的。有趣的是，觀察RA. 34.

(35) 及RA+Wy14643 這兩組之間，可發現CDK5、ERK2 以及β-catenin在 RA+Wy14643 這組的表現量有較高於RA組，意味著活化PPARα會使這三個蛋白有較高的表現量，因此由實驗結果可知道的是PPARα會增加分化相關的蛋白的表現。除了上述蛋白外，實驗亦測定cyclin D1、CDK1 以及CDK2 的蛋白表現量，其中cyclin D1 的表現是如預期一樣，隨處理時間越久而表現量下降，cyclin D1 是調控細胞週期G1 進入S期的，其表現量下降意味著細胞週期停滯在G1 時期。而較具爭議的是CDK1 和 CDK2 的表現量，如果細胞分化成神經細胞其CDK1 及CDK2 的表現量應會大量減少，但實驗結果並無降低的趨勢，2004 年Marie的研究結果[16]亦是相同，在分化過程中CDK1 以及CDK2 的蛋白表現量並無減少，但其活性是降低，而由於本實驗並無測定其活性，因此不知道PPARα的活化對其活性有何影響。在神經退化方面， Aβ42已證實是senile plaque 核心中的主要物質，目前還不是很清楚阿茲海默症是因為Aβ42所引起的，還是其他因素造成阿茲海默症而使得Aβ42堆積腦部，雖前因後果還不是很清楚，但Aβ42已經證實會導致神經細胞的死亡。因此，本實驗以Aβ42來誘使中樞神經細胞株NT2N凋亡[52]。NT2N細胞株是由NT2/D1 細胞用RA處理兩週所得到的，實驗分為四組，Control、Aβ42、 35.

(36) Aβ42+Wy14643 及Wy14643，藉以探討PPARα的活化與否在神經細胞凋亡所扮演的角色。由流式細胞儀的結果知道 0.5 μM的Aβ42在 12 小時後會增加 Sub-G1 的細胞族群且有時間的依存性，不但如此，在 24 小時後， Aβ42+Wy14643 這一組相較於Aβ4 2組有較多的Sub-G1 細胞族群，因此PPAR的活化會增加Sub-G1 的細胞族群。在蛋白的表現方面， Caspase 3 在Aβ42這組與control相比是有顯著性的增加，研究已知 Aβ42會透過Caspase 3 的路徑使NT2N細胞凋亡[68]，因此，這和實驗結果是相符的，有趣的是在Aβ42+Wy14643 這一組caspase 3 的表現量與Control相比也是有顯著性的增加但與Aβ42相較卻是無差異，且再把Wy14643 組和組相比較，Aβ42確實會增加Caspase3 的活性，綜合上述PPARα的活化會增加Sub-G1 的細胞族群，但卻不會增加 caspase 3 的表現量，也就是說PPARα會加速細胞的凋亡但不是透過 caspase 3 的路徑。而在Endo G的蛋白表現中知道，單獨用Aβ42或 Wy14643 處理皆不增加其表現，但在Aβ42和Wy14643 共同作用下卻會使Endo G有顯著性的增加，也就是說在Aβ42作用下PPARα會加速 NT2N細胞的凋亡，且不是透過增加caspase 3 而是透過增加Endo G，這是相當有趣的結果。. 36.

(37) 第七章結論 PPARα在retinoic acid（RA）誘導NT2 分化成神經細胞NT2N過程中的影響是會增加CDK5、ERK2 以及β-catenin蛋白表現，進而影響NT2/D1 細胞的分化。而PPARα在以Aβ42誘導成熟的神經細胞 NT2N凋亡的過程中所扮演的角色是會增加NT2N的凋亡，透過Endo G的路徑。. 37.

(38) G0. Cyclin. ？ CDK. Neurons p35 CDK5. Cyclin B/A CDK1. M G1 G2. Cyclin D CDK4/6. S. 圖一. Cyclin A. Cyclin E. CDK2. CDK2. 細胞週期。CDK5/p35 調控神經細胞 G1 進入 G0 期。. 38.

(39) 圖二. Amyloid precursor protein 的代謝。α：α-secretase； β：β-secretase；γ：γ-secretase。. 39.

(40) 100000. a. 90000. RA. 80000. b. Cell number. 70000. RA+Wy14643. 60000. Wy14643. 50000. control. 40000 30000 20000 10000 0 0. 12. 24. 48. Time (hours). 圖三 Wy14643 和 RA 對 NT2/D1 細胞生長的影響。細胞分四組，分別是 RA、RA+Wy14643、Wy14643 及對照組。在經四組處理 0 到 48 小時後，分別以細胞計數器計算 0、12、24、48 小時的細胞數。三重覆的結果以 mean ± S.D.呈現。a：p<0.05，表示 RA、RA+Wy14643 及 Wy14643 這三組在不同時間點，分別與對照組比較，在統計上具有顯著性的差異。b：p<0.05，表示與 RA、RA+Wy14643 這組比較及 Wy14643，在統計上具有顯著性的差異。RA：retinoic acid。. 40.

(41) RA. RA+Wy14643. Day 1. a. b. c. d. e. f. g. h. Day 4. Day 7. Day 11. 41.

(42) RA. RA+Wy14643. Day 14. i. j. k. l. m. n. o. p. Day 18. Day 21. Day 23. 42.

(43) RA. RA+Wy14643. Day 24. q. r Control. Wy14643. Day 24. s. t. 圖四 RA、RA+Wy14643 及 Wy 對 NT2/D1 細胞分化過程細胞型態的影響。a、c、e、g、i、k、m、o、q 是 RA 處理組，b、d、f、h、j、l、 n、p、r 是 RA+Wy14643 處理組，s 是 control 組（未加任何藥），t 是 Wy14643 處理組。其中 RA 及 Wy14643 的濃度為 10 μM。RA：retinoic acid。. 43.

(44) A RA Wy. day0 －－. ＋－. day5 ＋＋. ＋－. day8. day0 －－. ＋－. day7 ＋＋. ＋－. ＋＋. day11 ＋＋－＋. ＋＋. ＋－. day14 ＋＋－＋. Cx43 β-actin B RA Wy. day14. day21 ＋＋. ＋－. day28 ＋＋. Cx43 β-actin. 圖五 NT2/D1 細胞經 RA 及 RA+Wy14643 處理不同天數的 Connexin 43 蛋白表現量。（A）0 到 14 天（B）0 到 28 天。RA：retinoic acid， Wy：Wy14643。. 44.

(45) a. b. c. d. e. f. 45.

(46) g. h. I. j. 圖六. NT2/D1 細胞經 RA 及 RA+Wy14643 處理不同天數後，以. anti-MAP2 抗體進行細胞螢光染色後用共軛焦顯微鏡觀察 MAP2 蛋白的表現。a：control，b：Wy14643 處理 14 天，c：RA 處理 9 天，d： RA+Wy14643 處理 9 天，e：RA 處理 13 天，f：RA+Wy14643 處理 13 天，g：RA 處理 14 天，h：RA+Wy14643 處理 14 天，I：RA 處理 16 天，J：RA 處理 18 天。RA：retinoic acid，Wy：Wy14643。 46.

(47) RA Wy. day0 －－. ＋－. day5 ＋＋. day8 ＋－. ＋＋. day11 ＋＋－＋. day14 ＋＋－＋. CDK5 β-actin CDK5. Relative densitometric units. 7 6 5. RA. 4. RA+Wy14643. 3 2 1 0 day 0. 圖七. day 5. day 8. day 11. day14. NT2/D1 細胞分化為 NT2N 的過程以 RA 及 RA+Wy14643 處理. 不同天數的 CDK5 蛋白的變化。RA：retinoic acid，Wy：Wy14643。. 47.

(48) RA Wy. day0 －－. ＋－. day5 ＋＋. day8 ＋－. ＋＋. day11 ＋＋－＋. day14 ＋＋－＋. p35. Relative densitometric units. β-actin p35. 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0. RA RA+Wy14643. day 0. day 5. day 8 day 11 day14. 圖八 NT2/D1 細胞分化為 NT2N 的過程以 RA 及 RA+Wy14643 處理不同天數的 p35 蛋白的變化。RA：retinoic acid，Wy：Wy14643。. 48.

(49) RA Wy. day0 －－. ＋－. day5 ＋＋. day8 ＋－. ＋＋. day11 ＋＋－＋. day14 ＋＋－＋. CDK1 CDK2. Relative densitometric units. β-actin. 3. CDK1. 2.5. RA. 2. RA+Wy14643. 1.5 1 0.5 0 day 0. day 5. day 8 day 11 day14. Relative densitometric units. 3. CDK2. 2.5. RA. 2. RA+Wy14643. 1.5 1 0.5 0 day 0. 圖九. day 5. day 8. day 11. day14. NT2/D1 細胞分化為 NT2N 的過程以 RA 及 RA+Wy14643 處理. 不同天數的 CDK1 及 CDK2 蛋白的變化。RA：retinoic acid，Wy： Wy14643。. 49.

(50) RA Wy. day0 －－. ＋－. day5 ＋＋. day8 ＋－. ＋＋. day11 ＋＋－＋. day14 ＋＋－＋. Cyclin D1 β-actin. Relative densitometric units. 6. Cyclin D. 5 4 3. RA. 2. RA+Wy14643. 1 0 day 0. 圖十. day5. day8. day11. day14. NT2/D1 細胞分化為 NT2N 的過程以 RA 及 RA+Wy14643 處理. 不同天數的 Cyclin D1 蛋白的變化。RA：retinoic acid，Wy：Wy14643。. 50.

(51) RA Wy. day0 －－. day5 ＋＋－＋. day8 ＋－. ＋＋. day11 ＋＋－＋. day14 ＋＋－＋. ERK2 β-actin ERK2. Relative densitometric units. 2.5 2 1.5. Control 1. RA RA+Wy. 0.5 0 day 0. 圖十一. day 5. day 8. day 11. day14. NT2/D1 細胞分化為 NT2N 的過程以 RA 及 RA+Wy14643 處. 理不同天數的 ERK2 蛋白的變化。二重覆的結果以 mean ± S.D.呈現。 RA：retinoic acid，Wy：Wy14643。. 51.

(52) RA Wy. day0 －－. ＋－. day5 ＋＋. day8 ＋－. ＋＋. day11 ＋＋－＋. day14 ＋＋－＋. JNK β-actin JNK. Relative densitometric units. 1.6 1.4 1.2 1 RA. 0.8 0.6 0.4 0.2 0. RA+Wy14643. day 0. 圖十二. day 5. day 8. day 11 day14. NT2/D1 細胞分化為 NT2N 的過程以 RA 及 RA+Wy14643 處. 理不同天數的 JNK 蛋白的變化。RA：retinoic acid，Wy：Wy14643。. 52.

(53) RA Wy. day0 －－. ＋－. day5 ＋＋. day8 ＋－. day11 ＋＋－＋. ＋＋. day14 ＋＋－＋. β-catenin β-actin Catenin. Relative densitometric units. 8 7 6 5. RA. 4. RA+Wy. 3 2 1 0 day 0. 圖十三. day 5. day 8. day 11. day 14. NT2/D1 細胞分化為 NT2N 的過程以 RA 及 RA+Wy14643 處. 理不同天數的β-catenin 蛋白的變化。二重覆的結果以 mean ± S.D.呈現。RA：retinoic acid，Wy：Wy14643。. 53.

(54) RA Wy. day0 －－. ＋－. day5 ＋＋. day8 ＋－. ＋＋. day11 ＋＋－＋. day14 ＋＋－＋. pGsk-3β Gsk-3β. Relative densitometric units. β-actin pGsk3/Gsk3. 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0. RA RA+Wy14643. day 0. 圖十四. day 5. day 8. day 11. day14. NT2/D1 細胞分化為 NT2N 的過程以 RA 及 RA+Wy14643 處. 理不同天數的 pGsk-3β及 Gsk-3β蛋白的變化。RA：retinoic acid，Wy： Wy14643。. 54.

(55) cell num ber. A 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0. ＊. ＊＊. Control. 0.1 μM. 0.5 μM. 1.0 μM. B Cell Viavility (% of control). 120 100 80 60 40 20 0 control. 圖十五. 0.1 uM. 0.5 uM. 1.0 uM. Aβ42濃度對NT2N處理 72 小時的影響。實驗分四組，分別是. 對照組（Control）、0.1 μM、0.5 μM及 1.0 μM。在經四組處理 72 小時後，分別以細胞計數器計算其細胞數。(A)細胞數（B）細胞的存活率。三重覆的結果以mean ± S.D.呈現。＊：p<0.05，表示 0.1 μM、0.5 μM 及 1.0 μM這三組在不同濃度，分別與對照組比較，在統計上具有顯著性的差異。 55.

(56) 25000. 0.5 uM AB-time. cell number. 20000. ＊＊. 15000. ＊＊. 10000 5000 0 0. 6. 12 hour. 18. 24. 圖十六 0.5 μM Aβ42對NT2N細胞處理不同時間的影響。實驗分五個時間點，分別是對照組（0 小時）、6、12、18、24 小時，Aβ42處理濃度為 0.5 μM。分別以細胞計數器計算其細胞數。三重覆的結果以mean ± S.D.呈現。＊：p<0.05，表示 6、12、18、24 小時這四各時間點，分別與對照組比較，在統計上具有顯著性的差異。. 56.

(57) A. B. C. D. Sub-G1. E. F. G. H. I. J. K. L. M 25. 0.5 uM_AB42-Time. a,b. Sub-G1(%). 20. a,b. a,b. Control AB. 15. a. 10. a. a. AB+Wy14643 Wy14643. 5 0 0. 6. 6. 12 hour. 24. 36. 48. 圖十七 Aβ42與Wy14643 對NT2N細胞之細胞週期的影響。NT2N細胞以control、Aβ42、Aβ42+Wy、Wy14643 四組處理 6-48 小時後PI染色及流式細胞儀分析細胞週期的變化，其中Aβ42濃度為 0.5 μM，Wy14643 為 10 μM。A：Control，B：6 hr Wy14643，C：6 hr Aβ42，D：6 hr Aβ42+Wy14643，E：12 hr Aβ42，F：12 hr Aβ42+Wy14643，G：24 hr Aβ42， H：24 hr Aβ42+Wy14643，I：36 hr Aβ42，J：36 hr Aβ42+Wy14643，K： 48 hr Aβ42，L：48 hr Aβ42+Wy14643，M：以Cell Quest進行Sub-G1 的分析，三重覆的結果以mean ± S.D.呈現。a：p<0.05，表示與對照組比較，在統計上具有顯著性的差異。b：p<0.05，表示在同時間點的 Aβ42+Wy14643 組與Aβ42組比較，在統計上具有顯著性的差異。 57.

(58) Aβ Wy. －－. ＋－. ＋＋. －＋. Caspase 3 α-tubulin. Relative densitometric units. 3. a,b. 2.5. Caspase 3/tub. a,b. control AB. 2. AB+Wy. 1.5. Wy. 1 0.5 0 control. 圖十八. AB. AB+Wy. Wy. 四組處理 6 小時後Caspase 3 蛋白的影響。分為對照組. （control）、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞，其中Aβ42濃度為 0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM。三重覆的結果以 mean ± S.D.呈現。a：p<0.05，表示與對照組比較，在統計上具有顯著性的差異。b：p<0.05，表示分別與Wy14643 這組比較，在統計上具有顯著性的差異。. 58.

(59) Aβ Wy. －－. ＋－. ＋＋. －＋. Endo G. Relative densitometric units. α-tubulin 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0. control AB AB+Wy Wy. control. 圖十九. EndoG. ＊. AB. AB+Wy. Wy. 不同處理 6 小時後Endo G的影響。分為對照組（control）、. Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞，其中Aβ42濃度為 0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM。三重覆的結果以mean ± S.D. 呈現。＊：p<0.01，表示分別與其他三組比較，有顯著性意義。. 59.

(60) Aβ Wy. －－. ＋－. ＋＋. －＋. Bcl-2 Bax α-tubulin Bcl2/Bax. Relative densitometric units. 0.8 0.7. control. 0.6 0.5. AB AB+Wy. 0.4 0.3 0.2 0.1 0. Wy. control. AB. AB+Wy. Wy. 圖二十不同處理 6 小時後Bcl-2/Bax的影響。分為對照組（control）、 Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞，其中Aβ42濃度為 0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM。二重覆的結果以mean ± S.D. 呈現。. 60.

(61) Aβ Wy. －－. ＋－. ＋＋. －＋. p53 α-tubulin p53. Relative densitometric units. 1 0.8 0.6. control. 0.4. AB AB+Wy. 0.2. Wy. 0 control. AB. AB+Wy. Wy. 圖二十一不同處理 6 小時後p53 的影響。分為對照組（control）、Aβ42、 Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞，其中Aβ42濃度為 0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM。三重覆的結果以mean ± S.D.呈現。. 61.

(62) Aβ Wy. －－. ＋－. ＋＋. －＋. β-catenin. Relative densitometric units. α-tubulin 5. catenin. a,b. 4. a,b. 3. control AB. 2. AB+Wy. 1. Wy. 0 control. AB. AB+Wy. Wy. 圖二十二不同處理 6 小時後β-Catenin的影響。分為對照組（control）、 Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞，其中Aβ42濃度為 0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM。三重覆的結果以mean ± S.D. 呈現。a：p<0.05，表示與對照組比較，在統計上具有顯著性的差異。b： p<0.05，表示與Wy14643 這組比較，在統計上具有顯著性的差異。. 62.

(63) Aβ Wy. －－. ＋－. ＋＋. －＋. pGsk-3β Gsk-3β α-tubulin. Relative densitometric units. Gsk-3-p/Gsk3 0.2 0.15. control AB AB+Wy Wy. 0.1 0.05 0 control. AB. AB+Wy. Wy. 圖二十三不同處理 6 小時後pGsk-3β/Gsk-3β的影響。分為對照組（control）、Aβ42、Aβ42+Wy14643 及Wy14643 這四組處理NT2N細胞 6 小時，其中Aβ42濃度為 0.5 μM，而Wy14643 濃度為 10 μM。二重覆的結果以mean ± S.D.呈現。. 63.

(64) 表一. RA 及 Wy14643 對 NT2/D1 細胞 doubling time 的影響 Doubling time (hours). Control. 33.78 ± 1.27. RA. 30.59 ± 2.41. RA + Wy14643. 27.95 ± 0.15a. Wy14643. 21.98 ± 3.46a,b. RA、RA+Wy14643、Wy14643 及對照組處理 0 到 48 小時後，以 0、12、 24 及 48 小時的細胞數計算細胞數增加兩倍的時間。三重覆的結果以 mean ± S.D.呈現。a：p<0.001，表示與 Control 比較在統計上具有顯著性的差異。b：表示與 RA+Wy14643 比較在統計上具有顯著性的差異。 RA：retinoic acid。. 64.

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(75) 作者簡歷作者姓名：張家豪出生日期：68年2月2日出生地：台灣雲林學. 歷：中國醫藥大學營養系中國醫藥大學醫學所. 75.

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