3.1 不同菌種間 ampR-
β -lactamase 組裝之分子演化分析
S. maltophilia KH 分離菌株之 L2 蛋白具有 Amber class A
β-lactamase 的 特 徵 ， 所 以 ampR-L2 組 裝 是 屬 於 ampR-class A β-lactamase 型。將其與其他九株不同種細菌的 ampR-ampC 組裝與七 株 不 同 種 菌 株 之 ampR-class A β-lactamase 組 裝 做 比 較 ， 依 其 β-lactamase 蛋白與 AmpR 蛋白分別比較分析所得之演化樹狀圖呈現 於圖二十三。
β-lactamase 蛋 白 演 化 樹 狀 圖 明 顯 將 ampR-ampC 組 裝 與 ampR-class A β-lactamase 組裝中的 β-lactamase 蛋白分成兩群演化分 枝。S. maltophilia KH 分離菌株之 L2 蛋白與 ampR-class A β-lactamase 的 β-lactamase 蛋白有 39~50﹪的相同度（圖二十三之 A）。但 S.
maltophilia 之 L2 蛋白則與 ampR-ampC 組裝之 AmpC 蛋白沒有明顯
有意義的相同度。
而S. maltophilia KH 分離菌株之 AmpR 蛋白與其他所分析菌株之 AmpR 蛋白則有 46~67﹪的相同度（圖二十三之 B），經由序列比對，
發現其保留區域隨意分佈，並無明顯聚集區域，然而在所有 AmpR 蛋白的N 端皆發現有一 helix-turn-helix 的構造。
在所分析的菌株中，S. maltophilia KH 的 AmpR 和 L2 蛋白與 X. campestris 之 AmpR 與 L2 蛋白相同度最高，分別為 67% 和
50% 。而且有一值得注意的現象，在這些菌株中，其 AmpR 蛋白的 演化分型並不都與其 β-lactamase 蛋白演化分型趨勢相同。例如 S.
maltophilia KH 的 L2 是屬於 class A β-lactamase ，但是其 AmpR 蛋白卻和 ampR- ampC 系統的 AmpR 蛋白（如 P. aeruginosa，O.
anthropi）相似程度更甚於 ampR-classA β-lactamase 組裝之 AmpR
蛋白（如 P. vulgaris B317 和 E. cloacae NOR-1）（圖二十三之B）。
圖 二 十 四 顯 示 S. maltophilia KH 和 15 株 具 有 ampR-β-lactamase 系統的菌株其 ampR-
β
-lactamse IG片段之比對分析。 ampR-
β
-lactamase IG片段的長度範圍從第86到212個核苷酸不 等，觀察 ampR-β-lactamase IG 片段的結構特徵發現 ampR-ampC 組 裝的 IG 片段較 ampR-classA β-lactamase 組裝的 IG 片段更具有高 度保留性。通常在大部份 ampR- β-lactamase 系統，ampR 基因的啟 動子和其相鄰 β-lactamase 基因的啟動子走向相反且有重疊之現象（Maningo E. et al., 1995; Krueger TS. et al., 2001; Zhang L. et al., 2001;
Denton M. et al., 1998; Alonso A. et al., 1997; Avison MB. et al., 2001;
Hanson N. et al., 1999; Seoane A. et al., 1992; Normark S. et al., 1995;
Wiedemann B. et al., 1998; Gaillot O. et al., 1997; Nadjar DM. et al.,
2000; Philippon AG. et al., 2002 ）(5.8.15.20.21.25.26.29.38.39.45.46.48)。 而 S.
marcescens S6 除外，其兩啟動子是面對面走向，且無重疊現象（Naas
T. et al., 1995）(57)。然而， S. maltophilia KH 的174-bp IG片段與這些 被 報 導 過 的 序 列 有 些 許 差 異 ， 將 其 序 列 用 軟 體 分 析
（http://www.fruitfly.org），預測 ampR 和 L2 基因可能的 -10 和 -35 啟動子區域並標記於圖二十四，發現其 ampR 及 L2 兩基因啟 動子相離50個核苷酸，走向相反且呈現背對背的構型。而 AmpR 可 能結合的區域 T-N11-A 以底線標記於圖二十四，此區域與 L2 基因 所預測的啟動子 -35 區域重疊。
3.2 S. maltophilia KH 的 ampR -L2 組裝在 E. coli 系統之表現情形 過去的參考文獻通常使用 E. coli 當宿主來觀察 ampR-ampC 或ampR-classA β-lactamase 組裝之表現。因此本實驗之初，亦先將包 含 ampR -L2 組裝的質體 pKHR174L2 經轉殖作用送入 E. coli 中 評估其誘發情形。很不幸地 pKHR174L2 質體在 E. coli 系統無法測 到 β-lactamase 活性表現，為了更進一步證實此現象，將另一用 xy1E 基因取代 L2 基因的 pKHR174L2xylE 質體送入 E. coli DH5α 與 S.
maltophilia KH 中，結果發現不管有無添加誘發物，其質體在 E. coli 系統中測不到 C23O 活性，不過將此質體送入 S. maltophilia KH 中
則可測到受誘發的 C23O 活性（表二）。
3.3 AmpR 蛋白對 L1 基因表現所扮演的角色
既然 E. coli 系統不適用於分析 ampR -L2 組裝，只好考慮使用 原 S. maltophilia 菌來擔任宿主。因此，需構築 KHΔR、KHΔRL2 突 變株，再加上實驗室已有之 KHΔL1 、 KHΔL2 突變株。為了釐清 AmpR 對 L1 基因表現所扮演的角色，可利用KHΔL2（ampR+，L1+， L2－）和 KHΔRL2（ampR－，L1+，L2－）突變株之 β-lactamase 活性 表現來評估。結果在不管有無誘發物的情況下，其 KHΔL2 的細胞 萃 取 物 測 得 的 β-lactamase 活性皆高於 KHΔRL2 細胞萃取物的 β-lactamase 活性 ，顯示 AmpR 對於 L1 的表現不管有無誘發物，
都扮演著一活化者（activator）的角色。此外，KHΔL2 的細胞萃取 物在無誘發物的情況下表現了低 β-lactamase 活性（2 Un/mg），在 同條件下KHΔRL2 則測不到活性，其顯示 L1 β-lactamase 的基本表 現（basal expression）需要 AmpR 幫忙（AmpR-dependent）。而在 有誘發物的情況下，KHΔL2 的誘發能力明顯的上升，相反的，
KHΔRL2 失去誘發能力，所以， AmpR 在 L1 基因的誘發上是必需 的（表三）。
3.4 AmpR 蛋白對 L2 基因表現所扮演的角色
為了更進一步說明 AmpR 對 L2 基因表現的作用，就以 KHΔR
（ampR－，L1+，L2+）和KHΔL1（ampR+，L1－，L2+）突變株在有無 添加 10 ug/ml cefuroxime 的條件下，測量其 β-lactamase 活性表現
（表四）。從表四可明顯看到，KHΔRL2 在有添加誘發物的情形下，
沒有測到 β-lactamase 活性，其結果顯示 ampR 基因之突變將會完全 失去 L1 基因之表現，所以在 KHΔR 菌株中所測得的 β-lactamase 活性是 L2 β-lactamase 之活性。而沒有誘發的 KHΔR 菌株之活性稍 高於沒有誘發的 KHΔL1（12 vs 4 Un/mg），顯示在沒有誘發物的情 況下，AmpR 對於 L2 表現是為一微弱的抑制者。而在有誘發物的 情況下，KHΔL1 的 β-lactamase 活性明顯高於 KHΔR，其表示在有 誘發物的情況下，AmpR 對於 L2 基因的表現扮演一活化者的角 色 。 然 而 不 管 有 無 誘 發 物 ，KHΔR 細胞萃取物可測得一基本的 β-lactamase 活性。所以在沒有 AmpR 蛋白之情況下，L2 基因有一 持續但微弱之表現（basal constitutive but week expression）。而S.
maltophilia KHΔL1 表現一可誘發之表現型，相反的， KHΔR 失去 ampR 基因，也失去其誘發的能力 （表四），這顯示出 L2 酵素的 誘發必須要靠 AmpR 蛋白的幫助。
3.5 評估 ampR 的自我調控
一般認為 Lys R 型的調控因子擁有自我調控的特性，因此，值 得探討 S. maltophilia 的 ampR 是否具有自我調控的能力。將構築好 的 pKHRxy1E174L2質體送入 KH 和 KHΔRL2 突變株去檢測 AmpR 蛋 白 對 ampR 基 因 轉 錄 的 影 響 。 在 有 無 誘 發 物 下 測 量 KH( pKHRxy1E174L2 ) 和 KHΔRL2( pKHRxy1E174L2 ) 的 C23O 活 性。其中 KH( pKHRxy1E174L2 ) 測得的 C23O 活性當作其 AmpR 蛋白對 ampR 基因轉錄的影響。然而，KHΔRL2( pKHRxy1E174L2 ) 的 C23O 活性可用以模擬 ampR-L2 IG 區域在沒有 AmpR 蛋白結 合的情況下，ampR 基因啟動的情形。表五顯示 KH( pKHRxy1E174L2 ) 和 KHΔRL2( pKHRxy1E174L2 ) 的 C23O 活性不論在有無添加誘發 物的情況下，皆無明顯差異。顯示不管有無誘發物，ampR 基因會持 續其微弱地表現轉錄作用。此外， KH( pKHRxy1E174L2 )和 KHΔRL2 ( pKHRxy1E174L2 ) 的 C23O 活性表現量相當，說明了 AmpR 蛋白 的存在幾乎不影響 ampR 基因的表現，所以 ampR 沒有自我調控的 現象。
3.6 序列分析 16 株 S. maltophilia 分離菌株之 ampR-L2 組裝
針對16 株 ampR-L2 組裝的 S. maltophilia 分離菌株之 L2 蛋白、
IG 區域和 AmpR 蛋白相互比較。首先利用 PCR 將 16 株 S. maltophilia 分離菌株的 ampR-L2 之 DNA 片段放大，並將其 PCR 產物定序。結 果發現L2 基因有三種不同的長度，分別為 906、912 和 915 bp，扣除 預測的 27 個胺基酸之訊號胜肽（signal peptide）後，利用 Phylip 演 化樹建構系統（Phylip program）將成熟的 L2 蛋白分型。如圖二十五 之A 所示，將 16 株 S. maltophilia 分離菌株的 L2 蛋白分成 L2-1、L2-2、
L2-3 和 L2-4 四群演化分枝，其中 L2-1 和 L2-2 的長度同為 912 個核 苷酸，而L2-3 和 L2-4 分別為 906 和 915 個核苷酸（表六、圖二十五）。 值得注意的是，在這些 S. maltophilia 分離菌株中，其 L2 蛋白的變異 度為 5-31%。為了瞭解這些不同分群的 L2 蛋白之特性，在本實驗中 分別挑選S. maltophilia 分離菌株 KJ、KH、YW 和 KS 代表 L2-1、L2-2、
L2-3 和 L2-4 四群演化分枝。
而16 株 S. maltophilia 分離菌株依其 ampR-L2 IG 之 DNA 序列也 分成四群演化分枝，分別為IG-1、IG-2、IG2-3 和 IG-4，而其基因演 化樹狀圖（圖二十五之 B）與 L2 蛋白演化樹狀圖（圖二十五之 A）
大致相似。在IG 分型上，IG-2 和 IG-4 其 IG 區域之長度為 174 bp，
另外兩型IG-1 及 IG-3 則為 175 bp。而屬於同一群演化分枝的菌株，
其ampR-L2 IG 之 DNA 相同度為 96-100%，不同群菌株的 ampR-L2 IG 之 DNA 相同度則為 68-91% ，這趨勢亦與 L2 蛋白相似，而不同的
是在於 G+C content。S. maltophilia 整個基因體的 G+C content 高達 70%，而其 ampR-L2 IG 的 G+C content 特別低，大概只有 52%。
然而AmpR 蛋白序列在這 16 株 S. maltophilia 分離菌株中被高度 保留，這點明顯與L2 蛋白和 ampR-L2 IG 區域不同。在這 16 個 AmpR 蛋白的N 端，都有發現一 helix-turn-helix 的結構。把這 16 株菌的 AmpR 蛋白做 protein alignment（圖二十六），所得結果以三處明顯不同的 胺基酸作為鑑別的準則，將其分為兩型，分別以 AmpR1 和 AmpR2 表示之（表六）。用以區別 AmpR1 和 AmpR2 兩型的主要胺基酸分 別為 Gly184/Ser254/Arg277 和 Ala184/Gly254/Lys277。雖然亦有觀察到在 AmpR 蛋白上有一些較少數的胺基酸變異，如 S. maltophilia KJ 的 Ala-5 和 S. maltophilia KH 的 Asn-83，但這幾乎不會影響 AmpR 蛋白 的分類。
3.7 AmpR 蛋白對四種分型的 ampR-L2 IG 之誘導分析
S. maltophilia 能製造出兩個可被共同誘發的 β-lactamases 蛋白，
分別為L1 和 L2 蛋白。如將 16 株 S. maltophilia 分離菌株以 cefuroxime
（50 μg/ml）處理，可測得其誘發 β-lactamases 之活性範圍從 826-3472 Un/mg 不等。由此發現 S. maltophilia 的 β-lactamases 誘發能力有很高 的差異性。而 S. maltophilia 之 ampR-L2 組裝不僅與腸桿菌科的 ampR-ampC 組裝在結構上相似，其誘發機制亦很雷同。所以，AmpR
蛋白和ampR-L2 IG 區域必定對 L2 基因的誘發能力扮演著極關鍵的角 色。
將本實驗所用之16 株 S. maltophilia 分離菌株分析後，分類成兩 種之 AmpR 蛋白，AmpR1 和 AmpR2；四型的 ampR-L2 IG，分別為 IG-1、IG-2、IG2-3 和 IG-4（表六、圖二十五）。所以，挑選S. maltophilia 分離菌株 KJ 和 KH 為 AmpR1 和 AmpR2 的代表，而 S. maltophilia 分離菌株 KJ、KH、YW 和 KS 分別為 IG-1、IG-2、IG2-3 和 IG-4 四 群演化分枝的代表。首先，將重組質體pKJ175L2xylE、pKH174L2xylE、 pYW175L2xylE和 pKS174L2xylE經接合作用，分別送入 S. maltophilia 分離菌株 KJ 和 KH 中。所得之轉殖菌株（transconjugant）在有與無 誘發物的情況下，測量其 C23O 活性。同時也將 pKJ175L2xylE質體以 同樣方式送入S. maltophilia KJΔR 突變株中，將其視為沒有 AmpR 蛋 白的對照組（表七）。這些含有上述不同外來質體之 S. maltophilia KJ
和 KH 轉殖菌株，在沒有誘發物的情況下，只有測量到基本值
（basal-level）的 C23O 活性。相反的，在有誘發物的情況下，測得 之C23O 活性明顯上升。另外，轉殖菌株 KJΔR ( pKJ175L2xylE )連在 有誘發物的情況下，都只有測量到微弱的C23O 活性。所以在重組質 體上之 xylE 基因的誘發表現和誘發能力需要 AmpR 蛋白的幫助
（AmpR-dependent），且其誘發表現之模式與染色體上之 L2 基因相
仿。因此，在此系統中測得之C23O 活性可視為宿主之 AmpR 蛋白對 重組質體上ampR-L2 IG 區域的誘發能力的表現（表七）。
AmpR 蛋白對於 L1 與 L2 基因的表現扮演著一關鍵轉錄調控因子 的角色，而重組質體 pKJ175L2xylE、pKH174L2xylE、pYW175L2xylE和 pKS174L2xylE的存在是否會影響 L1 和 L2 β-lactamases 的表現，就值 得深入探討。所以，將上述之轉殖菌株分別以 cefoxitin（L1 蛋白酵 素的專一受質）和 aztreonam（L2 蛋白酵素的專一受質）抗生素進行 感受性試驗。結果顯示，將ampR-L2 IG 片段送入 S. maltophilia 菌株 中，只降低其對 aztreonam 抗生素的最低抑制濃度（MICs），代表
AmpR 蛋白對於 L1 與 L2 基因的表現扮演著一關鍵轉錄調控因子 的角色，而重組質體 pKJ175L2xylE、pKH174L2xylE、pYW175L2xylE和 pKS174L2xylE的存在是否會影響 L1 和 L2 β-lactamases 的表現，就值 得深入探討。所以，將上述之轉殖菌株分別以 cefoxitin（L1 蛋白酵 素的專一受質）和 aztreonam（L2 蛋白酵素的專一受質）抗生素進行 感受性試驗。結果顯示，將ampR-L2 IG 片段送入 S. maltophilia 菌株 中，只降低其對 aztreonam 抗生素的最低抑制濃度（MICs），代表