討論 - Stenotrophomonas maltophilia的ampR-L2組裝之特性分析; Characterization of ampR-L2 module of Stenotr

以染色體形式存在的 ampR-ampC 系統在許多不同種的菌株中 被廣泛注意，如 Citrobacter freundii（Lindbery F. et al., 1985）⁽²⁷⁾、 Enterobacter cloacae （ Honore N. et al., 1986 ） ⁽²⁸⁾、 Yersinia enterocolitica（Seoane A. et al., 1992）⁽²⁹⁾和Pseudomonas aeruginosa

（Lodge JM. et al., 1990）⁽³⁵⁾

。

而早期文獻大都利用E. coli 菌株為 heterologous experimental system 來研究 ampR-ampC 系統的調控。結 果顯示，在有 ampR 基因存在的情況下，E. coli 的 AmpG 和 AmpD 蛋白可以協助其質體上之 ampC 基因的誘發表現。而相似的策略在 某些 ampR-class A β-lactamase 組裝中亦可運作（Datz M. et al., 1994；Naas T. et al., 1994；Naas T. et al., 1995；Nordmann P. et al., 1993；Rasmussen BA. et al., 1996；Trepanier S. et al., 1997）⁽⁵⁵⁾⁽⁵⁶⁾⁽⁵⁷⁾

(58) (62) (63)，除了X. campestris（Weng SF. et al., 2004）⁽⁵⁹⁾之外。在本

論文中，質體 pKHR174L2 和 pKHR174L2xy1E在 E. coli 系統中無法 測得β-lactamase 和 C23O 活性，這與 X. campestris 菌株的 ampR1 和 blaXCC-1基因亦無法在E. coli 系統測得活性之結果一致（Weng SF. et al., 2004）⁽⁵⁹⁾。演化樹狀圖顯示，在所有受分析的菌株中，S. maltophilia 與 X. campestris 菌株的 β-lactamase 和 AmpR 蛋白有最接近的演化

分型（圖二十三），意味著 S. maltophilia 與 X. campestris 可能有較 相近的調控方式，兩者皆無法在 E. coli 系統中表現。而 E.

coli( pKHR174L2 ) 測不到β-lactamase 活性，暗示著可誘發 β-lactamase 表現的調控因子可能無法在 E. coli 與 S. maltophilia 中兼 用。

在不同的微生物中，AmpR 蛋白之功能普遍被認定為一調控因子，可調控其相鄰的

β

-lactamase 基因之表現。不過，在不同種的細 菌中，AmpR 蛋白亦扮演著不同的角色。在已報導之 ampR-ampC 系統，AmpR 蛋白在沒有誘發物的情況下當作一微弱的抑制者；而當有誘發物時，則扮演著活化者的角色（Honore N. et al., 1986；Kong KF.

et al., 2005；Lindbery F. et al., 1985；Poirel L. et al., 1999）⁽²⁷⁾⁽²⁸⁾⁽³⁰⁾⁽⁴³⁾。相較之下，在某些ampR-class A β-lactamase 系統，如 E. cloacae NOR-1

（Naas T. et al., 1994）⁽⁵⁵⁾

、

S. marcescens S6（Naas T. et al., 1995）⁽⁵⁷⁾ 和X. campestris（Weng SF. et al., 2004）⁽⁵⁹⁾，其 AmpR 蛋白不管在有無誘發物的情況下，都當作一正向調控者。而Burkholgeria cepacia 249

（Trepanier S. et al., 1997）⁽⁵⁸⁾ 則表現一特別的模式，其 AmpR 蛋白不論有無誘發物，都扮演著一抑制者的角色。在本論文中，AmpR 蛋白對L2 基因的調控模式比較像 ampR-ampC 系統中 AmpR 對 ampC 基因的調控方式，比較不像ampR-class A β-lactamase 組裝中 AmpR

對 class A β-lactamase 基因的調控方式。

同一微生物中有兩個以上的染色體形式之

β

-lactamase 基因共 存，是很常見之現象（Hu RM. et al., 2008；Kong KF. et al., 2005；Naas T. et al., 1994；Naas T. et al., 1995；Nordmann P. et al., 1993；Rasmussen BA. et al., 1996）⁽⁴¹⁾ ^{(43) (55)} ⁽⁵⁷⁾ ^{(62) (63)}。在這些菌中，有些

β

^-lactamase 基因擁有獨立的ampR-

β

-lactamase 組裝，像是 E. cloacae NOR-1（Naas T. et al., 1994；Nordmann P. et al., 1993）^{(59) (62)}的 ampR-ampC 和 nmcR-nmcA 組裝、E. cloacae 1413B（Rasmussen BA. et al., 1996）⁽⁶³⁾

的ampR-ampC 和 imiR1-imiA1 組裝和 S. marcescens S6（Naas T. et al., 1995)⁽⁵⁷⁾的 ampR-ampC 和 smeR-smeA 組裝。此類之系統，其個別

β

-lactamase 基因之表現主要受到與其相鄰之 ampR 基因的調控。不

過，P. aeruginosa 顯示了另一種的調控模式；其發現 P. aeruginosa 的 ampR 基因不只調控與其相鄰的 ampC 基因，也調控了與其不相連的

poxB 基因（Kong KF. et al., 2005）⁽⁴³⁾。而本論文所研究的 S. maltophilia 與 P. aeruginosa 有其相似之處，S. maltophilia 的 AmpR 可同時調控相鄰的L2 基因及不相鄰的 L1 基因（Okazaki A. et al., 2008）⁽⁶¹⁾。然而，以P. aeruginosa 而言，其 AmpR 蛋白對兩

β

-lactamase 基因的調 控方式不同: 對於 ampC 基因的表現是為一活化者，對於 poxB 基因的表現是為一抑制者（Kong KF. et al., 2005 ）⁽⁴³⁾。不同於 P.

aeruginosa，S. maltophilia 菌株在有誘發物的情況下，其 AmpR 蛋白

對L1 和 L2 基因的表現皆為正向之調控作用。

評估 AmpR 蛋白之自我調控，在 C. freundii（Lindquist S. et al., 1989）⁽⁴⁰⁾和 S. marcescens S6（Naas T. et al., 1995）⁽⁵⁷⁾中發現，當有 AmpR 蛋白存在的情況下，會使其 ampR 基因的表現量減少三倍，顯 示 C. freundii 及 S. marcescens 的 AmpR 蛋白有負向自我調控

（negative autoregulation）的特性。在 Kong et al.文獻中，P. aeruginosa 不管在有無誘發物的情況下，其 AmpR 蛋白都沒有自我調控現象

（Kong KF. et al., 2005）⁽⁴³⁾。而本論文顯示，S. maltophilia 的 AmpR 蛋白對其 ampR 基因的表現並無自我調控現象，這結果與 P.

aeruginosa 之 ampR 基因的特性一致。

Lindquist et al.（Lindquist. et al., 1989）⁽⁴⁰⁾文獻指出，C. freundii 菌株的AmpR 蛋白之結合區域（AmpR-binding site）與 ampR 基因之 啟動子有重疊的現象，此為C. freundii 菌株之 ampR 基因具有負向自 我調控特性之主要原因。相較之下，S. maltophilia 菌株的 AmpR 蛋白 對其 ampR 基因並無自我調控現象。由圖十二和表八顯示，靠近 L2 基因之102-bp 的 ampR-L2 IG 片段即足以誘發 L2 基因表現，意指此 102-bp 的 ampR-L2 IG 片段包含 AmpR 蛋白之結合區域

（AmpR-binding site）。此外，ampR 基因的啟動子位於靠近 ampR

基因之79-bp 的 ampR-L2 IG 片段（表十和圖十八）。顯然的，ampR 基因的啟動子與AmpR 蛋白的結合區域並無重疊；因此，AmpR 蛋白對其 ampR 基因並無自我調控。此結果與我們先前利用生物資訊預 測：ampR 和 L2 基因之啟動子在 ampR-L2 IG 區域上為一背對背（back to back）的走向相吻合。就我們所知，此一特殊的 ampR- β-lactamase IG 之組裝構造是首次被發現。

AmpR 蛋白為一可同時誘發 L1 和 L2 基因的調控者（Okazaki A. et al., 2008）⁽⁶⁰⁾，不過其誘發方式可能不同。(1) L1 β-lactamase 的基本表現（basal expression）需要 AmpR 蛋白存在，而 L2 β-lactamase 的基本表現（ basal expression ）則不需要 AmpR 幫忙

（AmpR-independent）（表三、表四）。(2) 在沒有誘發物的情況下，

AmpR 蛋白對 L1 和 L2 基因有不同的調控作用；其對 L1 基因的表現 為一活化者，對L2 基因的表現則為抑制者。(3) 在 L2 基因的上游有 發現一高度保留的LysR binding motif（Schell MA. et al., 1993）⁽⁴²⁾，而L1 基因之上游並無此區域。經由 ampR-ampC 系統推斷（Jacobe C.

et al., 1997；Normark S. et al., 1995；Wiedemann B. et al., 1998）^{(36) (38)}

(39)，AmpR 蛋白對 L2 基因的調控方式，可能是直接結合在 L2 基因之 上游區域。而對於 L1 基因的誘發，AmpR 蛋白可能是先藉由活化其 他的調控物，再經由其他的調控物活化 L1 基因。所以，AmpR 蛋白

調控 L2 基因的誘發作用似乎與腸桿菌科的 ampR-ampC 系統較為相 似。同時，L1 基因的誘發可能是藉由另一個與 AmpR 相關的調控機制，但目前對此機制所知較為有限。

S. maltophilia 屬於一基因高度變異之菌種（Hauben L. et al.,

1999）⁽⁶¹⁾，本實驗所分析的16 株分離菌株中，其 L2 蛋白和 ampR-L2 IG 區域之變異度高達 32%，然而 AmpR 蛋白序列在這 16 株 S.

maltophilia 分離菌株中卻被高度保留，這點明顯與 L2 蛋白和 ampR-L2

IG 區域不同。AmpR 蛋白為一 LysR 型之轉錄調控因子（LysR transcriptional regulator），有報導指出此型之調控因子可同時調控數個不同功能的基因（Henikoff S. et al., 1988；Jacobs C. et al., 1997；

Kong KF. et al., 2005）(37) (43) (65)。因為 AmpR 蛋白在微生物中可執行許多不同之功能，所以推測其胺基酸序列需要被高度保留，不可有太大之變動。而 ampR-L2 組裝之構成要素：ampR 基因、IG 區域和 L2 基因的G+C content 分別約為 70%、52% 和 69%。由於其 G+C % 有所差異，暗示著此三要素可能來自不同的演化起源。先前已有許多研究探討細菌的調控因子與結構基因可能來自不同的演化來源（Cases I.

et al., 2001；de LV. et al., 1996；Grkovic S. et al., 2001）(66) (67) (68)，本論文所研究之 ampR-L2 組裝具有相似的特徵。在本論文中發現 KH、

YW 和 KS 菌株的 AmpR 蛋白有著一樣的演化分群，但是 KH 菌株的

L2 蛋白和 ampR-L2 IG 區域之演化分群卻與 KJ 菌株較為相近，這意 味著ampR-L2 組裝之構成組件並非同時演化：ampR 基因的演化最不 明顯，而ampR-L2 IG 區域和 L2 基因有著相當的演化速度。所以，當 S. maltophilia 菌株遭受β-lactam 抗生素威脅時，其為了生存而較容易在ampR-L2 IG 區域及 L2 基因發生突變，較不易以 ampR 基因的突 變來對抗環境中的壓力。

經由 ampR-L2 組裝之序列分析與先前所釐清之 AmpR 蛋白的調 控作用發現，L2 β-lactamase 的調控方式與 ampR-ampC 系統較為相 像。所以，染色體上 ampR-L2 組裝所產生的 AmpR 蛋白可對重組質 體上的 ampR-L2xylE IG 區域作用，進而誘發 xylE 基因表現（表七）。

利用測量C23O 活性來評估 AmpR 蛋白對不同的 ampR-L2xylE IG 區域之誘發能力（表七）。經由這誘發實驗觀察到許多有趣的資料。(1) 即使 IG 序列的變異度高達 32%，AmpR 蛋白依然可對不同菌株的 ampR-L2xylE IG 區域作用，因此可將不同之 ampR-L2 IG DNA 片段與 不同的 AmpR 相互作用，定量 C23O 活性來評估其誘發程度。不過，此誘發實驗需要考慮到染色體上亦有 ampR-L2 IG 區域，所以此誘發表現分析是 AmpR 蛋白對染色體上 ampR-L2 IG 區域和質體上 ampR-L2xylE IG 區域誘發能力動態平衡下的呈現結果。以上述之方式所獲得的誘發能力表現為: KJ 菌株的 AmpR 蛋白（AmpR1 型）對四

型ampR-L2xylE IG 區域的誘發能力為 IG-3＞IG-1＞IG-4＞IG-2；而 KH 菌株的 AmpR 蛋白（AmpR2 型）則為 IG-4＞IG-3＞IG-2＞IG-1。結果發現，最理想的誘發能力似乎不存在於原始菌株之 AmpR-IG 配對中，例如KH 菌株的 AmpR 蛋白對其本身的 ampR-L2xylE IG 區域（IG-2）

的誘發能力並非最佳。(2) 在某些例子上，將外來的 ampR-L2IG 片段轉殖到原始菌株中，會影響其染色體上 L2 基因之誘發表現，此反映 在aztreonam 抗生素的 MIC 上（表七）。經由表四可以發現一趨勢：

將ampR-L2IG 片段轉殖到 S. maltophilia 菌株中，其 xylE 基因的誘發 與aztreonam 抗生素的 MIC 值下降程度成正比。也就是說，染色體所產生的 AmpR 蛋白對轉殖之 ampR-L2xylE IG 片段展現較高的誘發能力，而染色體上 L2 基因的誘發表現就會明顯減少。此結果意味著可 藉由轉殖一段外來的DNA 片段之策略，減弱 S. maltophilia 菌株對某 些 β-lactam 抗生素的抗藥性（如 aztreonam），其可作為一治療的新概念（oligo-nucleotides attenuator）。(3) 包含 ampR-L2 IG 片段之重組質體的存在，看似不會影響 L1 β-lactamase 的活性，其顯示在 cefoxitin 抗生素的 MIC 上（表七）。

AmpR 蛋白為一 LysR 型轉錄調控因子，一般認定其會結合在欲調控基因之上游的T-N11-A motif 上（Schell MA. et al., 1993）⁽⁴²⁾。而 ampR-L2 IG 區域中發現有四個類似 T-N11-A motif（在圖二十七以

I-IV 表示之），欲確認哪一 motif 與 AmpR 蛋白誘發 L2 基因相關，

其結果清楚呈現於表八。在有AmpR 蛋白的存在下，質體 pKJ102L2 xylE

所包含的102-bp 的 IG 片段即足以誘發 xylE 基因表現，顯示此 102-bp 的IG 片段已包含 AmpR 蛋白的結合區域。Schell 指出 LysR 型調控因子會結合在兩個明顯的區域，一為recognition binding site（RBS）和 activation binding site（ABS）（Schell MA. et al., 1993）⁽⁴²⁾。在抑制的情況下，調控物主要結合在 RBS 上，同時發現當有誘發物

（inducer-dependent）活化轉錄作用時，調控物與 ABS 會形成另一微弱的結合（Porrua OM. et al., 2007；Schell MA. et al., 1993）^{(42) (69)}。如果此現象適用於 ampR-L2 組裝上，那麼 motif III 和 IV 就分別像是 RBS 和 ABS 的角色。Motif III 為一 15-bp 之區域，具有局部對稱的特徵（partially dyad symmetry），其內包含 LysR 型轉錄調控因子欲結合的T-N11-A motif（圖二十七）。而 Motif IV 卻是一 AT 居多（AT rich）的 T-N11-T 區域，且與預測之 L2 基因啟動子的-35 box 重疊，

此兩特徵是為ABS 之特性（Schell MA. et al., 1993）⁽⁴²⁾。在不包含完

在文檔中 Stenotrophomonas maltophilia的ampR-L2組裝之特性分析; Characterization of ampR-L2 module of Stenotrophomonas maltophilia (頁 66-128)