研究設計及步驟

ㄧ、全身麻醉與肉毒桿菌素注射

利用腹腔注射(intraperitoneal, IP)方式，以 Zoletil (50mg/kg) 麻醉 劑和 Rompun (10mg/kg)肌肉鬆弛劑兩種藥劑將大鼠麻醉，而後將 25U/ml (9U/kg body mass,by Ulgen M.(Ulgen et al., 1997))之肉毒桿菌素 A 型，

依部位隨機分成四組，其中三組為實驗組、另外一組為控制組，依部位注射

1. 顳肌(temporalis muscle)注射肉毒桿菌素之步驟:

2. 咬肌(masseter muscle)注射肉毒桿菌素之步驟:

1 大鼠兩側臉頰剃除毛髮。

2 在眼框與外耳道連線之中點處、垂直於口裂與下顎骨角連線處，作上記 號，此為 superficial masseter muscle 之進針點。

3 在眼眶與外耳道連線之眼眶後緣、垂直於口裂與下顎骨角連線處，作上 記號，此為 deep masseter muscle 之進針點。

4 於針頭上裝置 plastic stopper，針頭露出 3.5 mm，使進針量固定。

進針時，斜面朝下，碰到骨頭後停止，接著施打藥劑，每注射點施打 0.5U 之藥劑。（圖二）

二、大鼠的飼養

麻醉清醒後，大鼠將飼養於台北醫學大學動物實驗中心， 飼養環境維持 室溫 23℃，溼度 55%，自由飲水飲食。 食物成分為… 飼養天數為 45 天。

三、大鼠的犧牲與灌流手術

45 天後，將 75 天年齡大的大鼠用 Zoletil 麻醉劑和 Rompun 肌肉鬆弛劑 兩種藥劑利用腹腔注射將大鼠麻醉犧牲，進行灌流手術。

四、肌肉重量之量取

手術取下大鼠咬肌與顳肌，用電子天秤(Denver, USA)量取雙側咬肌與顳 肌的重量，比較四組之間咬肌和顳肌重量之差異。

五、肌肉組織切片觀察 1. 切片位置

取大鼠右側之咬肌，將之區分為淺層咬肌(superficial masseter muscle) 及深層咬肌(deep masseter mucsle)。切片位置為淺層咬肌的中心點，垂直 肌纖維走向。（圖三）

2. 切片製作：Immunohistochemistry

1 大鼠犧牲後，手術取下大鼠咬肌，以 4%福馬林液固定 7 天。接著將標 本放置 20% sucrose 溶液中保存。

2 切片位置為淺層咬肌的中心點，切片方向垂直肌纖維走向。

3 以單株抗體染MyHC-IIA、MyHC-IIX。

以Monoclonal Antibody to Myosin（A4.74）（ALX-805-503,Alexis^®, North America）染type IIa muscle fibers

以 Monoclonal Antibody to Myosin（MyH1）（LS-C11612,Alexis^®, North America）染 type IIa muscle fibers

因為大鼠咬肌只含 type II muscle fibers(Sano et al., 2007)，

所以本實驗先染出

type IIa fibers 及 type IIx fibers 之後再算出 type IIb fibers 的比例。

4 切片製作過程

將標本包埋於蠟塊中，以切片機切出 15μm 的厚度，置於載玻片上。

以 Xylene 及酒精脫蠟後，置於 citric buffer(PH=6.0)溶液中，

在 121℃、20 psi 條件下煮 15 分鐘。此步驟之目的在加熱破壞 protein 使 antigen protein 片段顯露出來。

切片浸潤於 3% H2O2 溶液，去除織細胞內 peroxidase 酵素活力。

0.05% saponin 溶液，將組織蛋白抗原顯露出來，將組織蛋白抗原 顯露出來。

1% bovine serum albumin 阻斷非特異性抗原(non-specific antigen)，降低背景染色。

加 2 滴 Biotinylated goat ant-rat IgG 為第 2 抗體，與第 1 抗 體結合。

加 2 滴鏈黴菌卵白素-過氧化氫複合(streptavidin-peroxidase conjugate)，與生物素第 2 抗體結合。

加入 DAB（染色劑）呈色。

3. 切片觀測

以影像軟體（Image-Pro Plus^®,Media Cyvermetics,Inc.,USA）計算四 組標本中肌纖維大小、及肌纖維亞型（Type IIa, IIb, IIx）分布比例。