第二章 文獻查證
第六節 肉毒桿菌神經毒素作用於肌肉後肌肉組織的變化
量(muscle wet mass)顯著低於未施打側肌肉之濕量。 施打肉毒桿菌神 經毒素之肌肉有明顯萎縮情形，且平均肌肉纖維橫斷面積(mean fiber cross-sectional area)較小(Chen et al., 2002)。
在施打肉毒桿菌神經毒素於猴子眼外肌肉 42 至 56 天後的觀察則發現肌
纖維的形態趨於正常(Spencer and McNeer, 1987)。 施打肉毒桿菌神經毒素 於猴子眼瞼肌肉後 63 天的觀察中則發現，肌纖維的大小有顯著的恢復，但仍 比未施打肉毒桿菌神經毒素的肌纖維小(Porter et al., 1991) 。
第三章
研究材料與方法
第一節 研究對象
本實驗是選取 60 隻發育中 Long-evans 品種雄性大鼠，30 天年齡大，體 重約為 120 公克重。 隨機分成四組(Groups I~IV)、每組 15 隻，其中三組為 實驗組、另外一組為控制組。
第二節 研究材料
本實驗是使用肉毒桿菌素 A 型(BOTOX®, Allergan Pharmaceuticals, Ireland)，每一小瓶 100 U，添加無菌 0.9%生理食鹽水 4.0ml 作為稀釋劑，
調配成 25U/ml 濃度的製劑。
第三節 研究設計及步驟
ㄧ、全身麻醉與肉毒桿菌素注射
利用腹腔注射(intraperitoneal, IP)方式，以 Zoletil (50mg/kg) 麻醉 劑和 Rompun (10mg/kg)肌肉鬆弛劑兩種藥劑將大鼠麻醉，而後將 25U/ml (9U/kg body mass,by Ulgen M.(Ulgen et al., 1997))之肉毒桿菌素 A 型，
依部位隨機分成四組，其中三組為實驗組、另外一組為控制組，依部位注射
1. 顳肌(temporalis muscle)注射肉毒桿菌素之步驟:
2. 咬肌(masseter muscle)注射肉毒桿菌素之步驟:
1 大鼠兩側臉頰剃除毛髮。
2 在眼框與外耳道連線之中點處、垂直於口裂與下顎骨角連線處，作上記 號，此為 superficial masseter muscle 之進針點。
3 在眼眶與外耳道連線之眼眶後緣、垂直於口裂與下顎骨角連線處，作上 記號，此為 deep masseter muscle 之進針點。
4 於針頭上裝置 plastic stopper，針頭露出 3.5 mm，使進針量固定。
進針時，斜面朝下，碰到骨頭後停止，接著施打藥劑，每注射點施打 0.5U 之藥劑。（圖二）
二、大鼠的飼養
麻醉清醒後，大鼠將飼養於台北醫學大學動物實驗中心， 飼養環境維持 室溫 23℃，溼度 55%，自由飲水飲食。 食物成分為… 飼養天數為 45 天。
三、大鼠的犧牲與灌流手術
45 天後，將 75 天年齡大的大鼠用 Zoletil 麻醉劑和 Rompun 肌肉鬆弛劑 兩種藥劑利用腹腔注射將大鼠麻醉犧牲，進行灌流手術。
四、肌肉重量之量取
手術取下大鼠咬肌與顳肌，用電子天秤(Denver, USA)量取雙側咬肌與顳 肌的重量，比較四組之間咬肌和顳肌重量之差異。
五、肌肉組織切片觀察 1. 切片位置
取大鼠右側之咬肌，將之區分為淺層咬肌(superficial masseter muscle) 及深層咬肌(deep masseter mucsle)。切片位置為淺層咬肌的中心點，垂直 肌纖維走向。（圖三）
2. 切片製作：Immunohistochemistry
1 大鼠犧牲後，手術取下大鼠咬肌，以 4%福馬林液固定 7 天。接著將標 本放置 20% sucrose 溶液中保存。
2 切片位置為淺層咬肌的中心點，切片方向垂直肌纖維走向。
3 以單株抗體染MyHC-IIA、MyHC-IIX。
以Monoclonal Antibody to Myosin（A4.74）（ALX-805-503,Alexis®, North America）染type IIa muscle fibers
以 Monoclonal Antibody to Myosin（MyH1）（LS-C11612,Alexis®, North America）染 type IIa muscle fibers
因為大鼠咬肌只含 type II muscle fibers(Sano et al., 2007)，
所以本實驗先染出
type IIa fibers 及 type IIx fibers 之後再算出 type IIb fibers 的比例。
4 切片製作過程
將標本包埋於蠟塊中，以切片機切出 15μm 的厚度，置於載玻片上。
以 Xylene 及酒精脫蠟後，置於 citric buffer(PH=6.0)溶液中，
在 121℃、20 psi 條件下煮 15 分鐘。此步驟之目的在加熱破壞 protein 使 antigen protein 片段顯露出來。
切片浸潤於 3% H2O2 溶液，去除織細胞內 peroxidase 酵素活力。
0.05% saponin 溶液，將組織蛋白抗原顯露出來，將組織蛋白抗原 顯露出來。
1% bovine serum albumin 阻斷非特異性抗原(non-specific antigen)，降低背景染色。
加 2 滴 Biotinylated goat ant-rat IgG 為第 2 抗體，與第 1 抗 體結合。
加 2 滴鏈黴菌卵白素-過氧化氫複合(streptavidin-peroxidase conjugate)，與生物素第 2 抗體結合。
加入 DAB（染色劑）呈色。
3. 切片觀測
以影像軟體（Image-Pro Plus®,Media Cyvermetics,Inc.,USA）計算四 組標本中肌纖維大小、及肌纖維亞型（Type IIa, IIb, IIx）分布比例。
第四節
統計方式
利用 ANOVA 及 Post-Hoc 方法中的 Tukey Test 比較實驗組與控制組之間 咬肌及顳肌重量、淺層咬肌肌纖維大小、肌纖維亞型（Type IIa, IIb, IIx）
分布比例的差異。
第四章
分析與結果
第一節 Long-Evan 大鼠的體重變化
實驗期間，飼養之大鼠隨年齡增加而其體重(overall body weight)也隨 之增加。整個飼養期間，每週固定測量體重觀察其生長情況，至飼養終止。
最終各組大鼠之平均體重增加各組間無統計差異(表三)，如表。大鼠之生長 發育(overall growth)並未因施打肉毒桿菌神經毒素而產生影響。
第二節 咬肌與顳肌重量之比較 1. 咬肌
各組咬肌的重量如（表四、圖四）所示。Group I 之咬肌重量為 1.384 g；
Group II 之咬肌重量為 1.367 g；Group III 之咬肌重量為 1.029 g；Group IV 之咬肌重量為 1.497 g。
以 ANOVA 及事後比較方法中的 Tukey test 得知，具統計意義的是 Group I
＞Group III（P＜0.001）、II＞Group III（P＜0.001）、IV＞Group III（P
＜0.001）、Group IV＞Group II（P=0.042）。
2.顳肌
各組顳肌的重量如（表五、圖五）所示。Group I 之顳肌重量為 0.633 g；
Group II 之顳肌重量為 0.381 g；Group III 之顳肌重量為 0.332 g；Group IV 之顳肌重量為 0.625 g。
以 ANOVA 統計得知，以 ANOVA 及事後比較方法中的 Tukey test 得知，具 統計意義的是 Group I＞Group II（P＜0.001）、Group I＞Group III（P＜
0.001）、Group IV＞Group II（P＜0.001）、IV＞Group III（P＜0.001）。
若就其平均值來觀測，則表現出 Group I≒Group IV＞Group II＞Group III 的結果。
第三節 淺層咬肌肌纖維大小之比較
各組淺層咬肌肌纖維的大小如（表六、圖六）所示。Group I 之肌纖維大 小平均為 965μm2; Group II 之肌纖維大小平均為 958μm2; Group III 之肌 纖維大小平均為 686μm2; Group II 之肌纖維大小平均為 1122μm2。
以 ANOVA 之事後檢定（Tukey test）得知：Group I 之肌纖維大小顯著大 於 Group III（p=0.039）；group II 之肌纖維大小顯著大於 Group III
（p=0.046）；Group IV 之肌纖維大小顯著大於 Group III（p=0.001）。Group I、Group II、Group IV 之間則並無統計上的差異。但若就其值來觀測，仍表 現出 Group IV＞Group I≒Group II 的結果。
第四節 淺層咬肌肌纖維亞型分布比例之比較
各組所含肌纖維的比例如（表七、圖七）所示。以 ANOVA 及事後檢定之 Tukey test 來看，具統計意義的只有 type IIa muscle fibers 的比例 Group II＞Group III。
1. Type IIa muscle fibers（表八、圖八）
Group I 之 type IIa muscle fibers 所佔全部 muscle fibers 的比例為 19.0 %; Group II 之 type IIa muscle fibers 所佔比例為 35.8 %; Group III 之 type IIa muscle fibers 所佔比例為 12.9 %; Group II 之 type IIa muscle fibers 所佔比例為 31.5 %。
以 ANOVA 之事後檢定（Tukey test）得知 type IIa fibers 在 Group II 中所佔的比例，顯著的高於 Group III（p=0.014）。（表八、圖九）
Group I 中 type IIa fibers 佔了 19 % 和 Group IV 的 31.5 % 雖未達到 統計上的差距，但 Group IV 中的 type IIa fibers 明顯高於 Group I。
若就其平均值來觀測，仍表現出 Group II≒Group IV＞Group I＞Group III 的結果。
2. Type IIx muscle fibers（表九、圖十、圖十一）
Group I 之 type IIx muscle fibers 所佔全部 muscle fibers 的比例為 22.4 %; Group II 之 type IIx muscle fibers 所佔比例為 21.2 %; Group III 之 type IIx muscle fibers 所佔比例為 23.3 %; Group II 之 type IIx muscle fibers 所佔比例為 26.9 %。
以 ANOVA 檢定得知，type IIx fibers 所佔的比例在四組中並無統計上的 顯著差異。（表九、圖十一）
3.Type IIb muscle fibers（表十、圖十二）
Group I 之 type IIb muscle fibers 所佔全部 muscle fibers 的比例為 58.6 %; Group II 之 type IIb muscle fibers 所佔比例為 43.0 %; Group III 之 type IIb muscle fibers 所佔比例為 63.9 %; Group IV 之 type IIb muscle fibers 所佔比例為 41.6 %。
以 ANOVA 檢定得知， type IIb fibers 佔的比例在四組中並無統計上的 顯著差異。（圖十二）
第五章
討論
在矯正的臨床工作中，下顎骨的生長預測一直是一重要但難解的課題，
許多學者不斷致力於找出下顎骨發育的規律性及影響因子。對於下顎骨的發 育來說，咬肌扮演了重要的角色。因此本實驗主要觀察咬肌的變化，在實驗 設計中以咬肌施打 BTXA 為主要的實驗組別（Group I）。但顳肌對咬肌的影 響也不容忽視，因為顳肌也是一重要且強力的閉口肌。所以在實驗的分組中，
為了探討顳肌對咬肌造成的影響，也設計了在顳肌施打 BTXA（Group II）及 咬肌、顳肌皆施打 BTXA 的組別（Group III）。希望這樣的實驗分組設計能 使我們對咬肌的功能及影響有更深入的了解。
第一節 Long-Evan 大鼠的體重變化
Kiliaridis et al., 1992; Ulgen et al., 1997)、肌切開術(Maxwell et al., 1981)、肌切除術(Navarro et al., 1995)或去運動神經(Behrents and
Johnston, 1984; Phillips et al., 1982)等方法，皆有造成組織傷害而影 響實驗結果的疑慮(Gardner et al., 1980)。但由本實驗所記錄之大鼠階段 性生長可知，施打肉毒桿菌毒素之大鼠，其生長發育並未受到實驗之干擾。
2005年及2007年蔡吉陽等研究中亦顯示肉毒桿菌神經毒素A型施打於生 長中大鼠的咬肌及顳肌，並不會影響全身性的生長發育。
第二節 咬肌與顳肌重量之比較
在咬肌的重量方面，Group I、II、IV＞Group III；Group IV＞Group II。
但 Group I（平均值為 1.384 g）與 Group II（平均值為 1.367 g）的差距不 具統計上的意義。
在顳肌的重量方面，Group I≒Group IV＞Group II＞Group III。但 Group I 與 Group IV 的差距不具統計上的意義。
由本實驗的結果得知，不管是顳肌或咬肌其重量的比較皆出現一致的結 論，即表現出 Group I≒Group IV＞Group II＞Group III 的結果。
由以上結果也可看出，若 BTXA 只施打在咬肌（Group I），則咬肌與顳 肌與未施打組（Group IV）皆沒有統計上的意義。因此我們推論：咬肌與顳 肌之間可能存在有相互的代償作用，以補咬合力的不足。若 BTXA 只施打在顳 肌（Group I），則咬肌與顳肌與未施打組（Group IV）之間的統計數值的相
對關係並不一致。我們的推論是：顳肌的體積較小，等量的 BTXA 對其影響較 為明顯。
所以將來的實驗中若欲降低咬合力，建議同時施打 BTXA 於咬肌與顳肌以 消除代償作用造成的不準確性。
第三節 淺層咬肌肌纖維大小之比較
由以往的實驗結果得知，在降低咀嚼力後，肌纖維大小的變化不ㄧ。在 S. Kiliaridis 的實驗中，以軟食餵養的老鼠，其 deep masseter muscle 的 肌纖維大小較餵食正常硬度飼料之老鼠為小(Kiliaridis et al., 1988)。但 Y. Kitagawa 以兔子為研究對象，研究結果顯示：軟食組其 deep masseter muscle 的肌纖維大小和餵食正常硬度飼料之控制組相同(Kitagawa et al., 2004)。但由於其實驗方式不能確知咀嚼肌活性是否真正降低，所以以上實驗 之結論皆失去其可信度。
而以施打肉毒桿菌毒素降低肌肉收縮力的實驗中，有許多觀測肌纖維大 小的變化，但觀測標的多為腓腸肌或眼輪匝肌(Borodic, 1994; Porter et al., 1991)……等，缺乏對咀嚼肌肌纖維大小之探討。
由本實驗結果得知，Group I、Group II、Group IV 之肌纖維大小顯著大 於 Group III。而 Group I、Group II、Group IV 之間則並無統計上的差異。
但若就其值來觀測，仍表現出 Group IV＞Group I≒Group II 的結果。可能 表示出，咬肌及顳肌在咀嚼功能上扮演相當的重要性，當只有其中一者有萎
但若就其值來觀測，仍表現出 Group IV＞Group I≒Group II 的結果。可能 表示出，咬肌及顳肌在咀嚼功能上扮演相當的重要性，當只有其中一者有萎