陳東煌教授 國立成功大學化工系 黃世宏 國立成功大學化工系 一、前言
近年來無論是奈米技術或是生物與生醫技術的發展，均極受全球 科技及產業界的重視。尤其是奈米技術與生物或生醫技術結合時，更 產生了許多有趣與神奇的特性、產品、與技術，創造出奈米生技與奈 米生醫的新領域。其中，由奈米粒子與生物分子所形成的複合體，可 廣泛用於生物標識、生物偵測、基因治療、藥物傳輸、藥物標的、免 疫分析、酵素固定化及生物選擇性分離等方面，極具發展與應用價 值。例如，接上DNA生物試劑的金奈米粒子，可用於偵測炭疽病毒；
接上氧化鐵磁性奈米粒子的藥物、酵素、或其它生物分子，可應用於 藥物標的、藥物傳輸、酵素固定化、及生物分離上。[1]
就結合目的而言，奈米粒子可藉由生物功能化來提升其生物相容 性與生物選擇性，或藉由生物辨識性自組織具規律性之結構材料；而 生物分子或藥物則可能利用奈米粒子作為其載體，或者提供生物分子 及藥物本身所缺乏的其它功能。
奈米粒子之尺寸與生物巨分子接近，因此由奈米粒子與生物分子 所形成的複合體應用於生物體內時，較不易受到生物體的排斥。不 過，要將奈米粒子與生物分子或藥物結合，其間存有異質界面相容性 的問題，通常必需透過適當的表面化學技術才能達成。本文的目的即 在簡介奈米材料如何透過表面化學技術，達到生物功能化的目的。
適用於生物或生醫用途的奈米材料種類不少，限於篇幅，本文僅 針對較新穎之金奈米粒子、磁性奈米粒子、螢光量子點、及碳奈米管 等的生物功能化進行介紹，其餘已較為人所熟知 (如微脂體)或較不新 穎常見的生醫奈米材料則不作敘述。
二、金奈米粒子
金奈米粒子由於在可見光範圍具有特定的光學吸收性質，且生物 相容性佳，故常應用於免疫分析、生物晶片、生物標識、及光學元件 上。由於金易與硫產生鍵結，因此本身具有硫醇基或經過硫醇化的生 物分子通常可直接與金奈米粒子連結產生複合體。例如Shenton等人[2]
將具有HS-Cys官能基的抗體直接接在金奈米粒子上，可藉由抗體與抗 原之間作用的專一性形成二維或三維的網狀結構，如圖一所示。
圖一 藉由抗體-抗原間的作用將金奈米粒子交聯成形網狀結構之示意 圖[2] (經作者同意轉載)
如果生物分子缺乏可與金奈米粒子鍵結之官能基，則通常必需使 用適當的連結劑，將兩者連結在一起，如圖二所示。[3]連結劑可能是 金奈米粒子產生時即存於表面，例如以檸檬酸法製得的金奈米粒子，
表面即吸附一層檸檬酸分子，可作為連結劑，藉由靜電作用力，將金 奈米粒子與具有H2N-Lys官能基的蛋白質連結。[4]為提高辨識性，也 可生物分子作為連結劑，例如以鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)為聯 結劑鍵結於金奈米粒子表面，可與具有生物素(biotin)官能基的去氧核 糖核酸(DNA)或免疫球蛋白複合。[5]又如以HS-(CH2)6- 修飾之寡核苷 酸為連結劑，與金奈米粒子鍵結後，即可與具有互補序列之DNA結 合。[6]
奈米粒子 連結劑 官能基 生物分子
Au — HS-Cys immunoglobulins,serum albumins
Au — HS-(CH2)6- DNA Au — (HS-PO3R2)5- DNA
Au streptavidin biotin-(CH2)6- immunoglobulins,serum albumins
Au streptavidin biotin-(CH2)6- DNA
Au 1 DNA
Au 2 immunoglobulin, streptavidin Au 3 HOOC-Glu Proteins
Au 4 HS-Cys Proteins
圖二 生物分子與奈米粒子結合之示意圖[3]
表面修飾DNA之金奈米粒子，藉由DNA序列的專一選擇性與適 當設計，在自組裝奈米結構材料及生物與生醫上有許多的應用。例 如 ，Mirkin 等 人[7]首 先 將 兩 股 經 硫 醇 修 飾 但 不 互 補 的DNA 序 列 (3'-thiol- TACCGTTG-5')與(5'-AGTCGTTT-3'-thiol)分別鍵結至金奈米 粒子表面，然後將兩混合。由於兩股DNA序列並不互補，因此金奈米 粒子不會因DNA的雜交反應而產生凝集。但當加入具有可分別與 上 述 兩 股 DNA 序 列 互 補 的 雙 股 DNA(5'-ATGGCAAIIIIITCGGCAA-5') ， 則 DNA 序 列 會 進 行 雜 交 反 應，使金奈米粒子溶液由紅色轉成紫色，並且有沉澱產生，顯示兩組 金奈米粒子已藉互補之DNA序列的作用而連結在一起。進一步研究發 現，如果在0℃到80℃間反覆循環，當加熱超過金奈米粒子表面之DNA 與雙股DNA的解離溫度(Tm＝42℃)時，相互連接的DNA序列會分離重 新溶回溶液中，使溶液又變回原本的紅色，可見此自組裝過程為可逆 反應。整個過程得示意圖如圖三[7]所示
圖三 金奈米粒子藉由DNA序列之修飾進行可逆之自組裝[7]
(IIIII代表duplex雜交後的DNA序列，△代表加熱超過duplex解離的 溫度) (經作者同意轉載)
DNA生物晶片為金奈米粒子另一重要的應用，如圖四所示，Taton 等 人 [8] 將 兩 條 不 同 的 單 股 DNA(-CCTAXTAACAAT 與 TTATAACTATTCCTA-)分別修飾在載玻片與金奈米粒子上，當與標的 DNA(炭疽病毒的DNA序列)相遇時，即可將金奈米粒子連接在載玻片 上。以緩衝溶液將未配對或多餘的DNA序列清除後，若標的DNA序 列的濃度夠高，則會顯出淡淡的粉紅色；如果標的DNA序列的濃度很 低，便不易用肉眼看出。為了增強其訊號，通常可加入銀離子溶液，
並使用對苯二酚作為還原劑，將銀沈積在金粒子的表面上，使其呈現 黑色，提升靈敏度。
圖四DNA生物晶片的偵測原理[8] (經作者同意轉載)
此外，金奈米粒子在基因治療上也有很大的應用潛力。Wu等人[9]
首先利用兩階段酵素策略製備增強綠色螢光蛋白 (enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因與金奈米粒子之複合物(conjugate)Au：
EGFP，然後與聚乙醯亞胺(polyethyleneimine, PEI)水溶液混合形成 Au/EGFP/PEI複合物，進行基因傳遞研究。結果發現，Au/EGFP/PEI 複合物確實能有效地進入猴子腎臟Cos-7細胞，此乃因Au/EGFP帶負 電，PEI的加入可使Au/EGFP/PEI複合物的淨電荷由負轉正，有助於 增加轉殖(transfection)的效果。圖五係在螢光顯微鏡下觀察到EGFP在 轉殖之Cos-7細胞中所發出的螢光，顯示連接到金奈米粒子表面之 EGFP，在哺乳類動物的細胞中，依然可以展現出DNA片段的生物活 性。
圖五 利用(A)螢光顯微鏡與(B)亮場(bright field)顯微鏡觀察轉殖之 Au/ EGFP複合物在Cos-7細胞中展現岀EGFP之螢光特性[9]
(經作者同意轉載)
三、磁性奈米粒子
磁性粒子可廣泛應用於細胞/蛋白質的生化分離、藥物分子的化 學/生化合成、生物體內磁性藥物標的、核磁共振(magnetic resonance imaging, MRI)、及磁性溫熱腫瘤治療(magnetic hyperthermia tumor therapy)等方面。近年來由於奈米科技的快速進步，對磁性粒子微結 構，如被覆性、結晶性、及尺寸均一性等，皆有了更好的控制[10-23]， 透過適當的表面功能化，更加擴展其在生物與生醫領域的應用。
磁性奈米粒子與蛋白質的尺寸範圍相近，能與生物分子更緊密的 結合。因此，磁性奈米粒子不僅可作為生物分子的載體，且因這些奈 米載體對於表面負載之生物分子有較小的立體障礙，故也可以應用於
生物分離和生物標識。此外，磁性奈米粒子由於尺寸較小，在生物體 內的應用遠比微米粒子更具優勢。例如，當磁性奈米粒子的尺寸小於 20nm時，具有較高的組織穿透率。[24]且小尺寸有助於磁性奈米粒子 躲過生物體內之單核細胞吞噬系統(mononuclear phagocyte system (MPS))的偵測，避免被肝臟代謝掉，可增加磁性奈米粒子在血液中的 半生期，提高其到達體內目的地的機率。[25]
磁性奈米粒子在生醫領域上的應用，通常必須具有核/殼型結 構。內部的核是無機物(如氧化鐵)，環繞在外面的殼層則為長鏈的有 機配位基或是有機/無機高分子。在許多生醫應用方面，核需要具有 超順磁性，此乃因超順磁的核會回應外在的磁場，當外在磁場被移除 時，其磁性也會消失，缺少殘留磁化量將可使磁性物質重複地在水溶 液中分散與集中，而不會形成磁性團簇。核/殼型磁性奈米粒子的殼 層對於生物應用或是奈米複合物的穩定性和磁性相當重要，而殼層的 性質也能決定奈米複合粒子在水溶液中的分散性，並提供一個奈米團 簇官能化的平台。具有生物活性的分子，如抗體和蛋白質，可固定化 在殼層表面，並且能與水溶液中的生物體產生作用。[25]
最常用於生物與生醫應用之磁性奈米粒子為氧化鐵，其表面具有 -OH基可供鍵結。也可藉表面交換反應或於共沉澱製造過程中加入表 面修飾劑以產生-SH或-NH2等官能基。近年來FePt奈米粒子也頗受重 視，因屬金屬，一般可與具硫基的分子鍵結。以下分別針對幾項不同 的應用，舉例簡述磁性奈米粒子的生物功能化。
(一)體外生物分離用磁性奈米粒子的功能化[25]
以磁性奈米粒子作為吸附劑分離生物分子或生物體，因無孔內質 傳阻力且比表面積大，通常具有吸附容量高且吸附速率快的優點。關 於磁性奈米粒子的生物功能化，一般可將長鏈型有機配位體鍵結於粒 子表面，藉由疏水性交互作用力防止臨近粒子間的凝聚。不過，為了 生物與生醫的應用，粒子必須在水溶液中有很好的分散性。為解決此 一問題，Fan等人[26]將bipyridinium carboxylic acid與biotin一起鍵結在 氧化鐵粒子表面，如圖六所示，可改善因biotin鍵結所導致的疏水性，
應用於螢光素標識蛋白之avidin的親和性分離。
圖六 氧化鐵磁性奈米粒子同時被覆bipyridinium carboxylic acid與 biotin之結構圖[26] (經作者同意轉載)
尾端接有組氨酸之蛋白質(histidine-tagged protein)的分離一直頗 受重視，Xu等人[27-28]分別以dopamine及硫將nitrilotriacetic acid接於氧 化鐵與FePt奈米粒子表面，如圖七所示[25]，藉由與Ni2+離子的錯合，
可有效的將histidine-tagged protein自細胞溶解液中選擇性分離出來。
圖七 利用dopamine及硫將nitrilotriacetic acid分別接於氧化鐵(A)與 FePt(B)奈米粒子表面以分離histidine-tagged protein之磁性複合 奈米粒子的結構圖[25] (經作者同意轉載)
(二)病原體偵測用磁性奈米粒子的功能化
Xu等人[29-30]將含有bio(vancomycin) cystamine之水溶液與含有
FePt奈米粒子之正己烷溶液強力攪拌，藉由Pt-S和Fe-S鍵的形成，將
FePt奈米粒子之正己烷溶液強力攪拌，藉由Pt-S和Fe-S鍵的形成，將