一、細胞凋亡(Apoptosis)
細胞死亡(cell death)的方式可分為兩種：
(一) 細胞壞死(Necrosis)
主要是細胞通透性發生改變而膨脹或破裂，並造成溶 體(lysosome)釋放出各種分解酵素和細胞激素(cytokines) 等物質，而使週遭組織受傷引起發炎反應。
(二) 細胞凋亡(Apotosis)
藉由遺傳基因的控制來移除多餘或功能不全的細 胞，故又稱程式性死亡(programmed cell death)。目的是保 護生物個體，避免細胞脫離控制，造成突長。細胞凋亡發 生時，將會造成細胞核消失、DNA片段化、細胞膜上的 phosphatidylserine (PS)外翻，最後細胞分解成許多凋亡小 體(cell bodies)，但是這些凋亡小體很快會被週遭的吞噬細 胞(phagocytes)吸收。
圖五、細胞凋亡與細胞壞死的型態區別(Bredensen 1996 a, b )
二、參與細胞凋亡相關因素
(一) Reactive oxygen species(ROS；活性氧化物)
ROS 主 要 包 含 超 氧 陰 離 子 (O2‧ －) 、 過 氧 化 氫 (H2O2)、和氫氧基(OH‧)等一或多個不成對電子。有研究 指出 ROS 會將細胞質、蛋白質與核酸進行氧化破壞，並降 低粒線體上電子傳遞鏈的複合體活性，造成粒線體膜電位 去極化，釋放大量的 ROS，最後造成細胞內脂質過氧化、
酵素活性改變等【Xia et al., 1999】。活性氧化物在高濃度 時直接造成細胞損傷；低濃度時會間接促進蛋白質激酶和
磷 酸 酶 、 轉 錄 因 子 和 分 子 中 基 因 表 現 而 走 向 細 胞 凋 亡
【Curtin et al.,2002；Chevrollier et al., 2005】。
(二) p53 基因調節
p53 基因是一種腫瘤抑制基因，其所轉錄的蛋白 p53
具有 393 胺基酸，分成四個功能區域，包含轉錄活化區域 (1-42 胺基酸)、專一 DNA 序列結合區(102-292 胺基酸)、
四聚合化區域(323-356 胺基酸)及調控區域(360-393 胺基 酸)，是一種能夠調控細胞反應的蛋白。其調控的範圍包括
了 DNA 修補、細胞週期調控【Schwartz and Rotter, 1998】、
細胞凋亡【Yokozaki and Tahara, 1997】、細胞分化、基因重
組 和 中 心 體 複 製 【Schwartzman and Cidlowski, 1993;
Thompson, 1995】。當細胞受到外來的壓力時，p53 會被誘 發表達參與 G1 phase 監控關卡系統，p53 藉由活化下游基 因 p21 而抑制 cyclins-cdks 複合體，造成細胞在 G1 時期停 滯【Kerr et al., 1994; Salvesen and Dixit, 1999】。同時 p53
也會進行參與 G2/M 細胞週期監控關卡系統，而使 G2 期延 滯(Knudsen et al., 1998)。p53 蛋白質主要藉由磷酸化及乙 醯化等轉譯後修飾作用來增加 p53 蛋白質的穩定性【Susin et al., 1998】。許多逆境因子會誘發 p53 蛋白質活化，包括
核酸缺失、微小管瓦解、缺氧、一氧化氮、紫外光及化學
括Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bak、Bcl-Xs 等，前面兩個具有抑 制細胞凋亡能力【Reed, 1995】；後三者則具有促進細胞凋 亡的功能【Reed, 1997】。在一般的情況下，此兩類的蛋白
會維持一定的比率來調節細胞狀態，當 Bax 表現量高於 Bcl-2 時，細胞就會走入凋亡；換言之，Bcl-2 表現量大於 Bax 時，則會抑制細胞凋亡的情況發生。
(五) IAP 家族(Inhibitors of apoptosis protein；抗細胞凋亡蛋白) IAP 家族會經由 caspase 家族成員的交互作用而抑 制細胞凋亡【Birnbaum et al., 1994】，其內包含了 survivin、
cIAPs(cIAP1 及 cIAP2)和 XIAP 等成員【Deveraux and Reed, 1999】。而這些蛋白質幾乎在不同的癌細胞如肺癌【Ekedahl
et al., 2002; Hirokawa, 1994】、骨髓性白血病細胞【Zhang et al., 2002】和前列腺癌【McEleny et al., 2002】中過度表達。
(六) Cytochrome c
Cytochrome 是粒線體呼吸鏈的必要成分，目前可分 成四類：cytochrome a、b、c、d，其中 cytochrome c 是粒
線 體 周 圍 膜 上 水 溶 性 的 蛋 白 。 在 細 胞 凋 亡 過 程 中 ， 被 proapoptotic factors 而 開 啟 滲 透 性 轉 移 孔 洞 (permeabilization transition pore；PTP)，造成粒線體內膜滲 透性(mitochondrial membrane permeabilization)不穩定而導 致粒線體膜電位下降，過程中會釋放出cytochrome c 到細 胞質中，而活化caspase 3(CPP32)【Zou et al., 1997】。
(七) Caspases 家族(蛋白水解酶)
原本為單一無活性的precursor proenzyme，活化後 被切割形成大、小次單位，而形成四聚體模式，具有自身 催化或相互激活的能力。在細胞發生凋亡情形時，caspases
會被上游基因調控活化，之後造成細胞形態之改變。目前 caspases 家族至少有 14 種，大致分為三類：
1、The ICE subfamily of cytokine processors：
其主要是細胞激素的前驅物質，因此與發炎反應
很大的相關。成員有 caspase-1、-4、-5、-11、-12、
-13 與-14【Hisahara et al., 2000】。
2、The ICH-1/Nedd-2 subfamily of apoptotic initiators：
主要負責活化apoptotic executioners 以執行細胞 凋亡【Ho and Hawkins, 2005】。成員有caspase-2、-8、
-9 與-10。其中 caspase-8、caspase-10 具有兩個 death effector domain(DED)，若進行 death receptor pathway 的death signals 傳遞時，會和下游的 DD domain 聯結 而 促 使 凋 亡 ； caspase-9 上 的 CARD(caspase recruitment domain) prodomain，會在有 mitochondria pathway 的 death signals 傳遞時，和 Apaf-1 上 N 端的 CARD 結合，引發細胞凋亡【Cain, 2003】。
3、Ced-3/CPP32 家族（the Ced-3/CPP32 subfamily of apoptotic executioners）：
成員有caspase-3、-6、-7。主要負責執行細胞凋 亡 ， 裂 解 其 下 游 的 蛋 白 質 ， 如 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) 、 DNA-dependent protein kinase (DNA-PK)等。PARP 的功能是修復受損的 DNA、調 控細胞增殖與死亡的平衡，和維持基因體的穩定性。
當 PARP 受 caspase-3 裂解時會失去原本的功能
【Bellosillo et al., 1997】。
圖六、細胞凋亡調控因子【Wright and Duckett, 2005】
三、細胞凋亡訊息調控路徑
細胞凋亡調控路徑可大致分為三類：
(一) 粒線體傳遞路徑(Mitochondrial pathway)
粒線體接收到細胞凋亡的訊息傳遞，會開始進行活化 Bcl-2 家族蛋白，並同時造成粒線體膜電位下降的狀況發
生 。 之 後 便 開 始 釋 放 凋 亡 因 子 ， 如 Apaf-1(apoptosis protease-activating factor-1)、cytochrome c、procaspase-9 等
蛋白。當 Apaf-1、cytochrome c 及 procaspase-9 結合形成 凋亡複合體(apoptosome)後，便促使 procaspase-9 形成活化
態的caspase-9，接著開始活化下游的 caspase-3，最後造成 poly (ADP-ribose) polymerase【Li et al., 1997】分解斷裂，
使細胞走向細胞凋亡。
(二) 死亡受器傳遞路徑(Death receptor pathway)
當 Fas ligand(Fas-L)與細胞膜表面蛋白質 Fas(CD95) 結合後，促使下游的受體傳導蛋白質FADD(Fas-associated death domain protein) 與 procaspase-8 結 合 進 而 活 化 procaspase-8 ， 活 化 的 caspase-8 也 同 時 活 化 下 游 的 caspase-3，最後走向細胞凋亡【Kluck et al., 1997】。此外，
死亡受器傳遞路徑同時也會藉由活化 Bcl-2 家族蛋白，進 一步促使cytochrome c 的釋放【Eskes et al., 2000】。
(三) 內質網路徑(Endoplasmic reticulum pathway)
在內質網路徑中發現caspase-12 專一性地存在於內質 網中。當內質網受到壓力刺激會造成鈣離子釋出，進而活 化caspase-12，最後形成細胞凋亡【Nakagawa et al., 2000】。
圖七、細胞凋亡路徑圖【Primeau et al., 2002】
第五節、癌症轉移(Metastasis)與侵襲(Invasion)
2001】。目前主要影響癌細胞侵襲轉移的因素有【Thomas et al., 1996】：一、基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase)
MMPs 是一組鋅離子依賴性內肽酶，也就是需要鋅的存 在才能執行功能。一開始皆是以未活化的狀態分泌到細胞 外，但是當與其他蛋白酶進行作用時，則會打斷原本與鋅離 子鍵結的cystiene，使其成為活化狀態，目前可分成四型：
(一) 膠原蛋白酶(Collagenases)
間質性膠原酶、嗜中性膠原蛋白酶、膠原酶均 屬於本類，他們會將纖維狀膠原質(fibrillar collagens)
進 行 降 解 成 片 段 ， 其 成 員 有 MMP-1、MMP-8、
MMP-14、MMP-18。
(二) 明膠酶(Gelatinases)
本類包含了72kDa 的 gelatinase A (MMP-2)以及 92 kDa 的 gelatinase B (MMP-9)，主要可以分解 gelatin、fibronectin、elastin 等，因此在 MMPs 中被
認為最與 cancer 相關性的一型。
(三) 基質溶素(Stromelysin)
基質溶素在此扮演著分解細胞外基質的蛋白 質，但是它並不能分解具有 triple-helical 結構的 fibrillar collagens ， 成 員 有 MMP-3 、 MMP-10 、 MMP-11。
(四) 膜型基質金屬蛋白酶(Membrane-type metalloproteinases)
被發現結合於細胞膜上，可與 tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP)結合，維持 MMPs 與 TIMP 之
間的平衡，目前被認為的有 MMP-14 (MT1-MMP)、
MMP-15 (MT2-MMP)、MMP-16(MT3-MMP)、MMP-17 (MT4-MMP)、MMP-24(MT5-MMP)、MMP-25 (MT6- MMP)。
二 、 基 質 金 屬 蛋 白 質 酶 組 織 抑 制 因 子(Tissue inhibitor of metalloproteinase；TIMP)
TIMP 本身具有環狀結構及雙硫鍵結，可與 MMPs 形 成非共價鍵結，藉此達到抑制或活化 MMPs、細胞凋亡、
免疫反應等作用產生，目前主要有 TIMP-1、TIMP-2、
TIMP-3、TIMP-4 共四型，其結構如圖八。
圖八、TIMP 結構圖【Verstappen et al, 2006】
三 、 尿 激 酶 型 纖 溶 酶 原 激 活 物(Urokinase-type plasminogen activator；uPA)
uPA 首先在人的尿液中被發現，是負責將不具有活性
的 plasminogen 轉變成 plasmin，促使血栓溶解、細胞基質 降解情形發生，因此常被認為與血管疾病、癌症有關【Baker et al., 2007】。
四、血漿纖溶酶原激活物抑制物 (Plasminogen activator inhibitor)
主要分成 PAI-1 以及 PAI-2 兩型。PAI-1 是一種 serine protease inhibitor protein (SERPINE1)；PAI-2 則存在於懷孕 期間胎盤所分泌出的物質，均可以抑制 urokinase (uPA)，但 是主要是以PAI-1 作為 plasminogen activators 抑制劑【Baker et al., 2007】。
一般在正常的情況下 TIMPs 的表現是大於 MMPs，但是在惡 性腫瘤當中發現，腫瘤為了擷取更多的養分而促使血管新生，而造成 轉移生長的現象。當血管內生長因子受到活化時，便會分泌gelatinase 等分解血管基底膜的物質，此時的MMPs 的表現便大過於 TIMPs。
圖九、腫瘤轉移侵襲機制圖【Thomas et al.,1999】
第六節、裸鼠異種移植腫瘤(nude mice xenograft tumor)模式
無胸腺裸鼠自 1937 年被發現是一種獨特的純系動物。其基因型 帶有等位基因的 nu/nu；其表現型則為全身無毛，先天性無胸腺，僅 只有胸腺上皮，但這並不能促使 T 細胞分化成熟，因為表現在脾臟細 胞表面的θ抗原失去反應能力。θ抗原是 T 細胞活化前的一種分化抗 原。
也由於裸鼠T 淋巴細胞受損，同時造成許多免疫反應無法進行：
(1) 抗體生成反應(CD4+ helper T cells)
(2) 細胞引起的免疫反應(CD4+ or CD8+ T cells) (3) 延遲性過敏反應(require CD4+ T cells)
(4) 殺死受到病毒感染或毒性物質傷害的細胞
(5) 移植物排斥(require both CD4+ and CD8+ T cells)
其中在實驗腫瘤研究(如前列腺癌【van Weerden and Romijn, 2000】、
肺癌【Melnikova and Bar-Eli, 2007】、乳癌【Monteiro et al., 2008】、
口腔癌【Wang et al., 2007】)中已被廣為應用的原因來自對於外來移植 物不會產生排斥。因此可以進行中草藥萃取物或主成分在本模式下探 討是否可以抑制腫瘤大小，進而研究其動物實驗之抗癌療效。
第七節、實驗動機
近年來有研究發現隨著嚼食檳榔、香菸、酒精等因子會增加口腔 癌罹患機率，且罹患人數有逐漸上升與罹患年齡層下降之趨勢。目前 醫界對於原位性腫瘤已逐漸能用外科手術及化學治療等方法去除，但 對於腫瘤轉移侵襲仍是無法預防，大部分的病人均死於轉移其他部位 的癌症而死亡。普來氏月桃(A. pricei)是台灣全島低海拔山區特有常見 的薑科月桃屬植物，在民間廣被使用。本實驗室已從國立中興大學森 林 學 系 王 升 陽 教 授 實 驗 室 分 離 出 月 桃 萃 取 物 與 月 桃 主 成 分 (Flavokawain B)，但是對於月桃萃取物及其主成分是否對於正常口腔 細胞有細胞毒性、誘導人類口腔鱗狀癌細胞(KB cells)之細胞凋亡的可 能機制及路徑仍不太清楚。
因此，本研究分為兩個部分進行：
第一部分：探討月桃萃取物在人類口腔鱗狀癌細胞(KB cells)中體內與 體外試驗的抑癌影響。
第二部分：探討月桃主成分對人類口腔鱗狀癌細胞(KB cells)中體內與 體外試驗的抑癌影響。
貳、研究材料
第一節、實驗儀器
一、天秤：Sartorius
二、迷你離心機：KUBOTA 2010 三、桌上型微量離心機：Sigma 1K15 四、超高速離心機：Beckman
五、高壓殺菌釜：TOMIN TM32
六、純水製造機：Millipore milli-Q Plus 七、pH meter：Denver Basic
八、ELISA Reader：Dynatech MR7000＆Dynex MRX
九、流式細胞計數儀(low cytometry：FACS)：Becton Dickinson 十、數位影像分析儀：Alphar Imager 2000
十一、無菌操作台：NUAIRETM class II TYPE A/B3 十二、細胞培養箱：NUAIRETM US AUTO flow 十三、倒立式顯微鏡：Nikon Diaphot 300
十四、幫浦：HETO SUE 30Q
十五、加熱攪拌器：Barustead thermolyne SP18425 十六、震盪器：KS ORBITAL Shaker
十七、超音波震盪器：Bransonic PC 620 十八、水平式搖晃器：Oribital shaker OS 701
十九、水浴槽：FIRSTERTM SIENTIFIC 二十、直立式電泳槽：Hoefer
二十一、電泳轉印槽：BIO-RAD
二十二、電源供應器：BIO-RAD computer power supply model 3000Xi 二十三、感光夾：HypercassetteTM rpn111649
第二節、實驗材料
一、 本實驗所使用之人類口腔癌細胞株(KB)及人類正常牙齦纖維母
一、 本實驗所使用之人類口腔癌細胞株(KB)及人類正常牙齦纖維母