細胞培養(Cell culture)

一、人類口腔鱗狀上皮細胞癌細胞株(KB)培養

【Ko et al., 2008】

(一) 試劑配製 1、DMEM

Dulbecco’s modified eagle media(DMEM) 取 一 包 DMEM 粉末溶於 800 ml 的二次水中，加入 3.7 g NaHCO3、5.9 g HEPES、110 mg sodium pyruvate。溶解

後調 pH 值至 7.4，再加入 1％青黴素(penicillin)/鏈黴菌 (streptomycin)，混合後並將體積定量至 1000 ml。以 0.22 μm 血清瓶專用無菌過濾膜(bottle top filter)過濾，保存於 4℃。

2、1X 磷酸緩衝液(Phosphate-buffer saline；PBS)

8 g NaCl、0.2 g KH2PO4、0.2 g KCl、1.15 g Na2HPO4

溶在 800 ml 二次水中，以 1 N NaOH 調整到 pH=7.2-7.4，

並將體積定量至 1000 ml，再經由 121℃、30 分鐘高壓滅 菌後使用並存放於室溫備用。

3、0.4％ Trypan blue

0.45 μM 的濾膜，濾除雜質，室溫保存。

(二) 細胞培養條件

將人類口腔癌細胞株(KB)培養於 DMEM 培養液，其

中加入含 10％在 57℃加熱 30 分鐘而去補體之胎牛血清 (heat-inactivated foetal bovineserum ； FBS) 、 2 mM L-glutamine 、 1 ％ penicillin/streptomycin ， 最 後 置 於 37℃、5％ CO2 培養箱中培養。 blue 溶液混合均勻，用細胞計數器( hemocytometer )計數細

胞數，依實驗需要之細胞密度均勻的分至培養盤(culture plates )。剩餘細胞再加入新鮮 DMEM，重新種回 75T flask

中。當代數已超過20 代時，則重新再解凍細胞使用。

(四) 冷凍細胞：

將生長狀態良好的細胞用Trypsin-EDTA打下後，收集離

心(1500 rpm，5分鐘)，吸掉上清液，加入1 ml 新鮮medium 並打散底部細胞，另外配製freezing medium(內含7% DMSO 和10％FBS的DMEM)充分混合後，置入於2 ml冷凍小管

內 ， 此 時 每 個 冷 凍 小 管 的 細 胞 密 度 必 須 至 少 含 有5×10⁶ cells/ml 以上。先將內含有細胞freezing medium的冷凍小管 放在4℃冰箱中15分鐘，再移至-20℃冰箱中15分鐘，之後移 到- 80 ℃冰箱中overnight，最後放入液態氮中保存。

(五) 解凍細胞：

自液態氮桶將KB細胞取出後，立即移置於37 ℃水浴槽 中，使內部呈現部份融解的狀態，再用無菌dropper將細胞 冷凍保存液(cell culture freezing medium-DMSO)吸到已有20 ml新鮮DMEM的無菌離心管內，之後移到75T Flask中，於 含5% CO2的37℃培養箱中生長。隔天更換新鮮培養液以去 除DMSO，之後每隔2~3天更換培養液。

二、人類正常牙齦纖維母細胞(HGF)培養【

Hwang

et al., 2008】

(一) 試劑配製 1、DMEM

DMEM 粉末溶於 800 ml 的二次水中，加入 3.7 g NaHCO3、 5.9 g HEPES、110 mg sodium pyruvate。溶解後調 pH 值至 7.4，再加入 1％青黴素(penicillin)/鏈黴菌(streptomycin)，

混合後並將體積定量至1000 ml。以 0.22 μm 血清瓶專用 無菌過濾膜( bottle top filter)過濾，保存於 4℃。

2、1X 磷酸緩衝液(Phosphate-buffer saline；PBS)

8 g NaCl、0.2 g KH2PO4、0.2 g KCl、1.15 g Na2HPO4 溶 在800 ml 二次水中，以 1 N NaOH 調整到 pH=7.2-7.4，並 將體積定量至1000 ml，再經由 121℃、30 分鐘高壓滅菌後 使用並存放於室溫備用。

3、0.4％ Trypan blue：

取0.4 g trypan blue 溶於 100 ml 1X PBS 中，通過孔徑 0.45 μM 的濾膜，濾除雜質，室溫保存。

(二) 細胞培養條件：

將人類正常口腔纖維母細胞株(HGF)培養於 DMEM 培 養液，其中加入含10％在 57℃加熱 30 分鐘而去補體之胎牛 血 清(heat-inactivated foetal bovineserum ； FBS) 、 2 mM L-glutamine、1％ penicillin/streptomycin，最後置於 37℃、

5％CO2 培養箱中培養。

(三) 繼代培養(Subculture)：

trypan blue 溶液混合均勻，用細胞計數器(hemocytometer)計 數細胞數，依實驗需要之細胞密度均勻的分至培養盤(culture plates) 。剩餘細胞再加入新鮮 DMEM，重新種回 10 cm dish

中。當代數已超過10 代時，需重新再解凍細胞使用。

(四) 冷凍細胞：

將生長狀態良好的細胞用trypsin-EDTA打下後，收集離 心(1500 rpm，5分鐘)，吸掉上清液，加入1 ml 新鮮medium 並打散底部細胞，另外配製freezing medium(內含7% DMSO 和10％FBS的DMEM)充分混合後，置入於2 ml冷凍小管內 (原則上1個10 cm dish冷凍1管)。先將內含有細胞freezing medium的冷凍小管放在4℃冰箱中15分鐘，再移至-20℃冰箱 中15分鐘，之後移到-80℃冰箱中overnight，最後放入液態氮 中保存。

(五) 解凍細胞：

自液態氮桶將HGF細胞取出後，立即移置於37℃水浴槽 中，使內部呈現部份融解的狀態，再用無菌dropper將細胞冷 凍保存液(cell culture freezing medium-DMSO)吸到已有10 ml 新鮮DMEM的無菌離心管內，之後移到10 cm dish中，於含 5% CO2的37℃培養箱中生長。隔天更換新鮮培養液以去除 長率(cell growth)亦稱之為 subconflent，也就是將細胞種到未全

滿的階段，加入藥物試劑反應，確認是否會抑制細胞成長；細 胞存活率(cell viability)亦稱之為 conflent，也就是將細胞種到全 滿的階段，加入藥物試劑反應，確認藥物是否對於細胞具有毒 性的分析方法。

二、細胞型態(Morphology)觀察

在12 well中種3×10⁵ cells/ml (共1 ml)的HGF cells及KB cells，等至細胞貼附後，加入不同濃度的月桃萃取物及月桃主 成分後培養24、48、72小時。以倒立式顯微鏡(phase microscope) 觀察細胞型態並照相。

三、生長率測定步驟

【Xiao et al., 2005】

在 6 well 中種 1×10⁵ cells/ml (共 3 ml )的 KB cells，等至細 胞貼附後，加入不同濃度的月桃萃取物及月桃主成分後培養 24、48、72 小時。等反應時間到了之後，從中取出 100 μl 再加 上100 μl 的 0.4% trypan blue，混合均勻後，以血球計數器來計 算KB cells 的數目。

四、存活率測定步驟

【Lee et al., 2005】

在 12 well 中種 3×10⁵ cells/ml (共 1 ml)的 HGF cells 及 KB cells，等至細胞貼附後，加入不同濃度的月桃萃取物及月桃主

成分後培養24、48、72 小時。等反應時間到了之後，從中取出 100 μl 再加上 100 μl 的 0.4% trypan blue，混合均勻後，以血球 計數器來計算HGF cells 及 KB cells 的數目。

五、 細胞計數

將細胞懸浮液與 trypan blue 等體積混合，取出 100 μl 混合 液注入血球計數盤凹槽中，於倒立式顯微鏡下觀察計數。計算 盤中上下共八大方格中細胞總數後除以八，乘以稀釋倍數，最 後再乘以10⁴(血球計數盤每一方格的體積為 10^-1 mm³)，即為每 ml 中細胞懸浮液之細胞數。

第六節、細胞週期(Cell cycle)分析測定 【

Chang

et al., 2007】

一、原理

細胞週期大致可分為四個不同時期，G1 phase、G2 phase 、 S phase、M phase。每一個時期的 DNA 含量會因為功能作用不 同而有所差異，原則上 G2 期 DNA 含量為 G1 期的兩倍，而 S 期的DNA 含量則居於兩者之間。因此可以利用細胞中 DNA 的 含量來決定週期，利用螢光物質來標示 DNA，之後再利用 FACS (fluorescence-activator cell sorter) 進行 DNA 含量分析。

二、試劑配製

(一) Propidium iodide (PI)染劑

表六、PI stain 染劑配製表

(三) 1X 磷酸緩衝液(Phosphate-buffer saline；PBS)

8 g NaCl、0.2 g KH₂PO₄、0.2 g KCl、1.15 g Na₂HPO₄ 溶 在800 ml 二次水中，以 1 N NaOH 調整到 pH=7.2-7.4，並 將體積定量至1000 ml，再以 0.22 μm 血清瓶專用無菌過濾 膜(bottle top filter)過濾，最後再經由 121℃、30 分鐘高壓 滅菌後使用並存放於室溫備用。

三、固定細胞步驟

在 6 cm dish 中種 1×10⁶ cells/ml (共 5 ml )的 KB cells，等至

隔日細胞貼附後用PBS 洗一次，加入不同濃度的月桃萃取物及 cytometry; FACS)進行樣品分析，每一秒細胞數不超過 300 顆細 胞，每個數據收集10000 顆細胞，數據以 Modfit LT^®軟體進行 處理分析，每個實驗組皆三重複。

第七節、細胞膜電位

(△Ψ)

測定分析 【

Ding

et al., 2005】

一、原理

當細胞呈現 apoptosis 時會造成粒線體內容物的釋放，這與 粒線體膜上一種稱為 mitochondrial permeability transition pore (PT pore)的通道有關，主要包含了兩大部分︰一是在粒線體內 膜與 adenine nucleotide translocator (ANT) 相關之蛋白質；另一 是 在 外 膜 的 蛋 白 質( 包 括 了 porin, voltage-dependent anion channel, VDAC)，打開此一通道會造成粒線體內膜兩側 H⁺ gradient 消失，此時原本以電化學位能儲存於粒線體內膜 (約 250 mV/5~10 nm)，稱之為 mitochondrial membrane potential (Dym) 開始下降，最後 matrix 滲透壓增高，造成粒線體漲大，

外膜漲破之後使caspase-inducing factors (cytochrome c 和 AIF) 釋放到細胞質中。許多親脂性的陽離子化合物(如 DiOC6 (3,3,- Dihexyloxacarbocyanine iodide))會結合到粒線體內膜，在雷射激 發光下放出螢光，可以非常方便地使用螢光顯微鏡或流式細胞 儀來觀察粒線體的形態和移動的變化情形。

二、試劑配製

(一) 3,3,- Dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6)染劑

分子量為572.53，將其配成 stock solution 為 10 mM，

實驗前用已滅菌磷酸緩衝溶液稀釋成20 μM。

三、實驗步驟

將 3×10⁵ KB 細胞種於 12 well，以濃度 150 μg/ml 的月桃萃 取物及10 μg/ml 的 flavokawain B，分別培養 0、2、4、8 小時 後，將不同組別各自收集上清液，加入2 ml 的 PBS 清洗後再經 trypsin-EDTA 處理，使細胞分離並收集至 15 ml 離心管中離心 (1500 rpm、5 分鐘)。倒掉上清液，再將細胞完全打散後加入 10 ml 的 PBS 清洗離心 (1500 rpm、5 分鐘)。最後在每個試管中加 入500 μL 的 20 μM DiOC6 於試管中，用 1 ml pipette 在 15 ml 離心管中抽吸數次後，將細胞移於絹布製的篩子過濾到 FACS 專用管，全程避光並置於室溫下 30 分鐘，最後以流式細胞儀 (Flow cytometry; FACS)進行樣品分析。

第八節、活性氧化物(Reactive oxygen species)測定分析

【

Ding

et al., 2005】

一、原理

2,7- dichlorofluorescein diacetate(H₂DCF-DA)是一種脂溶性

染劑，本身具有螢光且可以通透細胞膜，進入細胞可與細胞內 的乙醯脂酶(esterases)結合形成非螢光性的 DCFH，之後被 H₂O₂

氧化成具螢光性的 DCF。藉此使用流式細胞儀來評估細胞內 H₂O₂的濃度變化，以分析細胞內ROS 的生成量。

二、試劑配製

(一) 2,7- dichlorofluorescein diacetate(H₂DCF-DA)染劑

分子量為487.3，將其配成 stock solution 為 10 mM，

實驗前用已滅菌磷酸緩衝溶液稀釋成 10 μM。

三、實驗步驟

將 5×10⁵ KB 細胞種於 6 well，以濃度 150 μg/ml 的月桃萃 取物及10 μg/ml 的 flavokawain B，分別培養 0、60、120、180、

240 分鐘後，將不同組別各自收集上清液，加入 2 ml 的 PBS 清 洗後再經 trypsin-EDTA 處理，使細胞分離並收集至 15ml 離心

管中離心 (1500 rpm、5 分鐘)。倒掉上清液，再將細胞完全打 散後加入10 ml 的 PBS 清洗離心 (1500 rpm、5 分鐘)。最後在 每個試管中加入500 μL 的 10 μM H2DCF-DA 於試管中，用 1 ml pipette 在 15 ml 離心管中抽吸數次後，將細胞移於絹布製的篩

子過濾到FACS 專用管，全程避光並置於室溫下 30 分鐘，最後 以流式細胞儀(flow cytometry; FACS)進行樣品分析。

第九節、蛋白質定量分析與西方墨點法(Western blotting)

【

Pan

et al., 2008】

一、蛋白質定量原理

蛋白質定量分析是根據 Bradford 原理所設計，其蛋白質染 劑可與蛋白質結合形成藍色複合物，並可於595 nm 測得此複合 物之吸光值。藉由比對 BSA 標準品所形成的定量標準曲線，即 可換算出待測樣品的蛋白質濃度。

二、蛋白質定量實驗步驟

以二次水將牛血清白蛋白 (bovine serum albumin；BSA，

0.1 mg/ml)分別配製成 0、2、4、6、8、10 μg /ml 之標準溶液。

再加入200 μl protein assay dye (BIO-RAD)，振盪均勻靜置 5 分

鐘。放入分光光度計讀取波長595 nm 的吸光值，由在 595 nm

Western Blot 採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，

被檢測物是蛋白質，「探針」是一級抗體(Primary antibody)，「顯 色」用標記的二級抗體(Secondary antibody)。SDS 是界面活性 劑，可使蛋白質變性，並在分子表面均勻佈上一層負電荷。因

薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電

(5) 2 mM dithiothreitol (DTT)

(6) 1 mM phenylmethyl sulfony fluoride 2、步驟：

(1) 秤取 0.121 g tris-HCl、10.95 g sucrose 溶於 60 ml 後，之後調整 pH 值為 12，加入 0.15 g EDTA，於全 部溶解之後調回 pH 值為 8。

(2) 秤取 0.0308 g DTT、0.0174 g phenylmethyl sulfony fluoride 加入。

(3) 最後加入 10 ml triton X-100 混合，分裝後放置-20℃

(五) Ammonium persulfate

取 0.1 g (NH4)S2O8溶於1 ml 二次水。

(六) 6× Protein loading dye 1、材料：

(1) 350 mM tris-HCl (pH=6.8) (2) 12% SDS

(3) 35% glycerol

(4) 0.02% bromophenol blue

(5) 30% β-meanptoethanol 2、步驟：

(1) 秤取 1.379 g tris-HCl 並加入 5 ml 二次水混合，調整 pH 值為 6.8。

(2) 加入 3 g SDS、8.75 ml glycerol(原液)、0.005 g bromophenol blue、7.5 ml β-meanptoethanol 混合，

最後定量到25 ml。

(七) 5× electrode buffer (pH=8.4)

取 54.5 g tris base、24.8 g boric acid、4.7 g Na₂EDTA、 5 g SDS，最後用二次水定量至 1000 ml。使用前再用二次水

稀釋成1×。

(八) Transfer buffer

取 18.2 g tris base、86.5 g glycine、1200 ml methanol 最 後用二次水定量至3 L。

取 5% 脫脂奶粉溶於 PBST。

(十三) SuperSignal substrate solution

將 SuperSignal I：SuperSignal II＝1：1 混合 (每次使用 皆現配) 。

將樣品放在冰上反應20 分鐘或放入冰箱 overnight，

然後以離心機，使用12,000 rpm 離心 30 分鐘，收集上清液 即為細胞萃取物(cell lysis extracts；total protein)。最後以 Bio-rad 定量其蛋白濃度，保存在-80℃冰箱備用。

(二) 蛋白質膠體電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)

1、鑄膠

膠體的配製依蛋白質分子量的大小而決定配製成 8、10、12、15%的 SDS-PAGE。

2、分離膠體溶液(Running gel；總體積 10 ml) (1) 8% SDS-PAGE

加 4.6 ml H₂O，2.5 ml 1.5M Tris (pH=8.8)，2.7 ml 30% acrylamide mix，0.1 ml 10% SDS，0.1 ml 10%

ammonium persulfate 及 0.005 ml TEMED。

(2) 10% SDS-PAGE

加4 ml H2O，2.5 ml 1.5 M tris base(pH=8.8)，

3.3 ml 30% acrylamide mix，0.1 ml 10% SDS，0.1 ml 10% ammonium persulfate 及 0.005 ml TEMED。

(3) 12% SDS-PAGE

加3.3 ml H₂O，2.5 ml 1.5M tris base (pH=8.8)，

4.0 ml 之 30% acrylamide mix，0.1 ml 之 10%

SDS，0.1 ml 之 10% ammonium persulfate 及 0.005 ml TEMED。

(4) 15% SDS-PAGE

加2.3 ml H₂O，2.5 ml 1.5M tris base (pH=8.8)，

5 ml 30% acrylamide mix，0.1 ml 10% SDS，0.1 ml 10% ammonium persulfate 及 0.005 ml TEMED。

3、集離膠體溶液(5% Stacking gel；總體積 6 ml)

加入 4.2 ml H₂O，0.78 ml 之 1.5 M tris base (pH=6.8)，1 ml 之 30% acrylamide mix，0.06 ml 之 10%

加入 4.2 ml H₂O，0.78 ml 之 1.5 M tris base (pH=6.8)，1 ml 之 30% acrylamide mix，0.06 ml 之 10%

在文檔中 中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/556 (頁 72-0)