【
Panet al., 2008】
一、蛋白質定量原理
蛋白質定量分析是根據 Bradford 原理所設計，其蛋白質染 劑可與蛋白質結合形成藍色複合物，並可於595 nm 測得此複合 物之吸光值。藉由比對 BSA 標準品所形成的定量標準曲線，即 可換算出待測樣品的蛋白質濃度。
二、蛋白質定量實驗步驟
以二次水將牛血清白蛋白 (bovine serum albumin；BSA，
0.1 mg/ml)分別配製成 0、2、4、6、8、10 μg /ml 之標準溶液。
再加入200 μl protein assay dye (BIO-RAD)，振盪均勻靜置 5 分
鐘。放入分光光度計讀取波長595 nm 的吸光值，由在 595 nm
Western Blot 採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，
被檢測物是蛋白質，「探針」是一級抗體(Primary antibody)，「顯 色」用標記的二級抗體(Secondary antibody)。SDS 是界面活性 劑，可使蛋白質變性，並在分子表面均勻佈上一層負電荷。因
薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電
(5) 2 mM dithiothreitol (DTT)
(6) 1 mM phenylmethyl sulfony fluoride 2、步驟：
(1) 秤取 0.121 g tris-HCl、10.95 g sucrose 溶於 60 ml 後，之後調整 pH 值為 12，加入 0.15 g EDTA，於全 部溶解之後調回 pH 值為 8。
(2) 秤取 0.0308 g DTT、0.0174 g phenylmethyl sulfony fluoride 加入。
(3) 最後加入 10 ml triton X-100 混合，分裝後放置-20℃
(五) Ammonium persulfate
取 0.1 g (NH4)S2O8溶於1 ml 二次水。
(六) 6× Protein loading dye 1、材料：
(1) 350 mM tris-HCl (pH=6.8) (2) 12% SDS
(3) 35% glycerol
(4) 0.02% bromophenol blue
(5) 30% β-meanptoethanol 2、步驟：
(1) 秤取 1.379 g tris-HCl 並加入 5 ml 二次水混合，調整 pH 值為 6.8。
(2) 加入 3 g SDS、8.75 ml glycerol(原液)、0.005 g bromophenol blue、7.5 ml β-meanptoethanol 混合，
最後定量到25 ml。
(七) 5× electrode buffer (pH=8.4)
取 54.5 g tris base、24.8 g boric acid、4.7 g Na2EDTA、 5 g SDS，最後用二次水定量至 1000 ml。使用前再用二次水
稀釋成1×。
(八) Transfer buffer
取 18.2 g tris base、86.5 g glycine、1200 ml methanol 最 後用二次水定量至3 L。
取 5% 脫脂奶粉溶於 PBST。
(十三) SuperSignal substrate solution
將 SuperSignal I：SuperSignal II＝1：1 混合 (每次使用 皆現配) 。
將樣品放在冰上反應20 分鐘或放入冰箱 overnight，
然後以離心機，使用12,000 rpm 離心 30 分鐘，收集上清液 即為細胞萃取物(cell lysis extracts；total protein)。最後以 Bio-rad 定量其蛋白濃度，保存在-80℃冰箱備用。
(二) 蛋白質膠體電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)
1、鑄膠
膠體的配製依蛋白質分子量的大小而決定配製成 8、10、12、15%的 SDS-PAGE。
2、分離膠體溶液(Running gel；總體積 10 ml) (1) 8% SDS-PAGE
加 4.6 ml H2O，2.5 ml 1.5M Tris (pH=8.8)，2.7 ml 30% acrylamide mix，0.1 ml 10% SDS，0.1 ml 10%
ammonium persulfate 及 0.005 ml TEMED。
(2) 10% SDS-PAGE
加4 ml H2O，2.5 ml 1.5 M tris base(pH=8.8)，
3.3 ml 30% acrylamide mix，0.1 ml 10% SDS，0.1 ml 10% ammonium persulfate 及 0.005 ml TEMED。
(3) 12% SDS-PAGE
加3.3 ml H2O，2.5 ml 1.5M tris base (pH=8.8)，
4.0 ml 之 30% acrylamide mix，0.1 ml 之 10%
SDS，0.1 ml 之 10% ammonium persulfate 及 0.005 ml TEMED。
(4) 15% SDS-PAGE
加2.3 ml H2O，2.5 ml 1.5M tris base (pH=8.8)，
5 ml 30% acrylamide mix，0.1 ml 10% SDS，0.1 ml 10% ammonium persulfate 及 0.005 ml TEMED。
3、集離膠體溶液(5% Stacking gel；總體積 6 ml)
加入 4.2 ml H2O，0.78 ml 之 1.5 M tris base (pH=6.8)，1 ml 之 30% acrylamide mix，0.06 ml 之 10%
SDS，0.06 ml 之 10% ammonium persulfate 及 0.006 ml
之TEMED。 質樣本變性(denature)後，立即放回冰靜置 5 分鐘，speed down 後，再用含有 SDS 之 8%、10%、12%或 15%
acrylamide gel (視蛋白質分子量大小而定)，以電泳方
6、蛋白質轉移(Transfer protein to PVDF membrane)
先將 PVDF membrane 及 3M paper 裁剪與膠片大 小相同。於 PVDF membrane 標記上膠片之蛋白質 marker 的位置，方便偵測蛋白質訊號時比對分子量大 小位置。將轉漬夾打開後黑色面朝下放，取出一片海 綿墊片浸泡transfer buffer 後放於其上面，並依序在海 綿 片 上 放 上 3 mm paper 、 SDS-PAGE gel 、 PVDF membrane (先用 100%甲醇濕潤 5 秒、再放於 transfer buffer 中浸潤)、3 MM paper，最後再放上一片海棉墊
片後夾上轉漬夾，並使用玻棒壓一壓以去除氣泡(夾層 中間切勿有氣泡)，放入濕式 transfer machine 中並將 transfer buffer 倒入電泳槽中，以 20 伏特的電流轉印 15 小時(由負極到正極)，使蛋白質轉印到 PVDF 上。
7、免疫點墨法 (Immunoblotting)
轉印好蛋白質之 PVDF memberane 用 blocking solution 振盪 30 min，以 blocking solution 作為溶劑分
別將欲測之一次抗體稀釋至適的濃度，加入 PVDF membrane 使其均勻的覆蓋於 membrane 上，並置於水 平式旋轉器上室溫振盪3 小時，用 washer buffer 洗三 次，轉速為100 rpm 每次 10 分鐘。依不同的一次抗體，
加入特異作用的二次抗體，置於水平式旋轉器上室溫 振盪3 小時，用 washer buffer 洗三次，轉速為 100 rpm 每次10 分鐘，藉此清洗未接合二次抗體，同時也可以 降低背景值。將 PVDF membrane 加入 superSignal WestPico chemiluminesent substrate 溶液，振盪 1 分鐘，
將轉印膜用保鮮膜完整包裹，使用Amersham BioMax light film 壓片(依訊息的強弱調整壓片時間的長短)，將 底片依序放入顯影劑、水、定影劑，最後再至入水中
清洗並停止顯色。以此方法檢視細胞內各個預測蛋白 的變化量。