3. 材料與方法
3.1. 細胞實驗（In vitro）
3.1.1. 材料
3.1.1.1. PC12 細胞株
PC12 細胞的來源為食品工業研究所菌種保存與發展中心
（CCRC cell no : 60048），它的組織來源為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，
生長的特性為懸浮性，一聚集成小串狀。培養液為 Ham’s F12K with 2 mM L-glutamine adjusted to contain 1.5 g/L sodium bicarbonate, 82.5%
+ 15% horse serum + 2.5% FBS 的混合液。PC12 細胞最主要的特色為
3.1.1.4. 膠原蛋白
膠原蛋白VITROGEN，購自 COHESION（USA），提取自以Pepsin 溶解的牛表皮，膠原蛋白溶解於 0.012 N HCl。其內容物 95-98%為 Type І 膠原蛋白及少許 Type Ш 膠原蛋白。其特色乃於 37℃時會產 生凝膠作用（gelation）。此種膠原蛋白濃度在 1.0~1.5 mg/ml 之間形成 的膠狀物是透明的，但是性質上稍微容易碎掉，而在其瓶裝濃度為 3.0 mg/ml。
3.1.2. PC12 細胞株繼代培養與觀察
3.1.2.1. 配製 PC12 細胞株的培養液
PC12 細胞株的培養液（culture medium）為 Ham’s F12K with 2 mM L-glutamine adjusted to contain 1.5 g/L sodium bicarbonate, 82.5%
+ 15% horse serum + 2.5% FBS 的混合液。
配製 Ham’s F12K with 2 mM L-glutamine adjusted to contain 1.5 g/L sodium bicarbonate 以 0.2 μm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無 菌容器中，標示之儲存於4 ℃。
馬血清（Horse serum, HS）及胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）
必須儲存於-70~-20 ℃間。新購瓶裝血清先以逐步解凍法溶解，完全
解凍 於無菌操作台內，在 50 c.c.的離心管中放置約 10 c.c.的培
使最後溶度為10%（90% culture medium + 10% DMSO），混合均勻 後，放置於冰上待用，因DMSO 溶入溶液中為放熱反應。
依細胞繼代培養之操作，收集細胞，取少量之細胞懸浮液（約 0.1 ml）計數細胞濃度及冷凍前存活率。取適量細胞液以 1200~1500 rpm，離心 5 分鐘。抽去上清液，再加入新鮮培養液使沉澱物再懸浮，
再以同樣轉數，離心5 分鐘，最後將離心後之沉澱物以 2-3 ml 之冷凍 保存溶液使之懸浮。在均勻分裝於標示完整之冷凍保存管中
（1 ml/vial，共 2-3 vial）（冷凍保存管先標明存放人姓名、存放 時間、細胞種類、繼代代數），並取少量細胞懸浮液作污染檢測。
冷凍保存方法 冷凍管置於 4 ℃冰箱、10 分鐘後，再轉放於-20
℃冰箱、30 分鐘，最後放於-80 ℃冰箱、16~18 小時（或隔夜），取出 後放於液氮槽（vapor phase）長期儲存。
3.1.3. 製造膠原蛋白覆蓋的 24 格培養盤
國atcc.org 之配方：Ham’s F12K with 2 mM L-glutamine adjusted to contain 1.5 g/L sodium bicarbonate, 82.5% + 15% horse serum + 2.5%FBS 的混合液。
3.1.4.2. PC12 細胞株神經軸突突觸生長實驗之操作
若已貼附完全則以數位相機（Nikon Coolpix 950，Japan）進行攝影存 檔紀錄。
於換藥完成後 24 小時觀察，並攝影存檔，每格攝影 9 個定點。 medium：Ham’s F12K with 2 mM L-glutamine adjusted to contain 1.5 g/L sodium bicarbonate, 82.5% + 15% horse serum + 2.5% FBS
3.1.5. PC12 神經軸突生長情況之測量
使用彩色影像分析系統（Image-Pro Lite Version 3.0, Media Cybernetics, USA）以隨機之方式，每格內選出 4 張相片計算細胞數 目（cell count, CC）、細胞體直徑大小（cell body diameter, CBD）、突 觸長度—計數軸突長度為 0~1 倍細胞體直徑（0~1 CBD）、1~2 倍細 胞體直徑（1~2 CBD）、2~3 倍細胞體直徑（2~3 CBD）、及大於 3 倍 細胞體直徑（>3 CBD）之細胞數。之後再以試算軟體（EXCEL 2000, Microsoft）作分析。
3.1.6. 統計方法
利用 SAS 6.12 版統計軟體，由於樣本數少，故採取無母數分析 Kruskal-Wallis test 作統計檢定。以探討細胞數目（cell count, CC）、
細胞體直徑大小（cell body diameter, CBD）、突觸長度—軸突長度為 0~1 倍細胞體直徑（0~1 CBD）、1~2 倍細胞體直徑（1~2 CBD）、2~3 倍細胞體直徑（2~3 CBD）、及大於 3 倍細胞體直徑（>3 CBD）之細
實驗用之矽膠管為 Helix Medical Silicone Tube，內徑為 15 mm，外徑 1.96 mm，購自 Helix Medical, Inc（USA）。
3.2.1.2. 膠原蛋白
膠原蛋白VITROGEN，購自 COHESION（USA），提取自以Pepsin 溶解的牛表皮膠原蛋白溶解於 0.012 N HCl。其內容物 95-98%為 Type І 膠原蛋白及少許 Type Ш 膠原蛋白。其特色乃於 37 ℃時會產 生凝膠作用（gelation）。此種膠原蛋白濃度 1.0~1.5 mg/ml 之間形成 的膠狀物是透明的，但是性質上稍微容易碎掉。在其瓶裝濃度為 3.0