（1）藥物之配置
1. Benzyloxybenzaldehyde 衍生物溶於無水乙醇中，配製成濃度為 5-50 mM，
避光儲存於-20 ℃冷凍庫中。實驗過程中，乙醇所佔的比例，不超過 0.2%。
2. 抑制劑：H89（PKA 專一性抑制劑）、RO32-0432（PKC 專一性抑制劑）、
U0126（MEK1/2 專一性抑制劑）、PD098059（ERK 的專一性抑制劑）、
SB203580（JNK/p38 的抑制劑）、Z-IETD-FMK（caspase-8 專一性抑制劑）、
Z-DEVD-FMK（caspase-3 專一性抑制劑）、Z-LEHD-FMK（caspase-9 專一性 抑制劑）與 DiOC
6
(3) 均溶於 DMSO 中，配製成說明書上建議之濃度，避光儲存於-20 ℃冷凍庫中。
（2）細胞株的培養
88
細胞株培養在含 10% FBS、1% L-glutamine、100 µg/mL streptomycin 與 100 units/mL penicillin 培養基中。細胞依實驗需要培養於細胞培養皿或細胞培 養瓶中，並置於 37 ℃、5% CO
2
、溼度95%的無菌培養箱中培養。細胞以 trypan blue 染色，用血球計數盤計算活細胞數目及存活率，並控制繼代的細胞數在 2 ~ 5 Χ 10
5
cells/mL。（3）正常人週邊單核細胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）之處理
89
取正常人靜脈血液並置入裝有heparin（1unit/mL）之離心管中，離心（470 X g、10 分鐘、4 ℃）。取白血球層加入等體積 RPMI-1640 培養基，並緩 慢滴入裝有等體積Ficoll-Hypaque（sp gr 1.077）管中，離心（650 X g、20 分鐘、4 ℃）。取中間白血球層並加入 RPMI-1640 培養基，離心（235 X g、
5 分鐘、4 ℃）清洗細胞兩次。
（4）細胞存活率之分析
90,91
懸浮細胞株（2.5 Χ 10
5
cells/mL）培養於 24 孔盤中，實驗組分別加入不 同濃度的化合物處理，並以含等量溶劑當作對照組，細胞置於37 ℃、5% CO
2
、溼度 95% 之細胞培養箱中培養。人類週邊白血球細胞（2.5 Χ 105
cells/mL）以不同濃度之化合物處理。收集細胞加入含 PI（5 µg/mL）的 PBS，利用流式細胞分析儀分析之。樣品之死細胞與活細胞的數量及比 率，以CELL Quest 軟體分析計算。細胞存活率 =（實驗組活細胞數目/對照組活細胞數目）Χ 100%
（5）細胞增殖率之分析（MTT 之試驗）
WEHI-3 及貼附細胞株（1 Χ 10
4
cells/mL）置於 96 孔盤中，以不同濃度之 化合物處理後，將培養基去除並於每一小槽加入100 µL 含有 MTT（500 µg/mL）的培養基，再於 37 ℃下反應 4 小時後，每小槽加入 100 µL 之 0.04 N HCl /isopropanol，使細胞內藍紫色沉澱顆粒完全溶解後，再用 ELISA reader 於波長 570/620 nm 下測定其吸光值。細胞增殖率 = (實驗組之 OD
570/620
/對照組之 OD570/620
) Χ 100%（6）細胞週期分析
92
將經藥物處理不同時間點的細胞收集後以1Χ PBS 清洗細胞二次後，加 入低張PI 溶液（hypotonic PI solution：0.1% sodium citrate、0.1% Triton X-100、
20 µg/mL PI），以流式細胞分析儀收集細胞核 DNA 含量資料，再以 ModFit 軟體分析細胞週期的變化。
（7）DAPI 螢光染色法
93
細胞株經化合物處理後，收集細胞並用 1Χ PBS 清洗細胞一次，加入 4 % paraformaldehyde 固定細胞，再用 1Χ PBS 清洗細胞兩次後將細胞附著於 載玻片上。細胞玻片檢體置於0.1% Triton X-100/PBS 中室溫下反應 15 分 鐘，再用1Χ PBS 清洗細胞後加入 DAPI（1 µg/mL）螢光染劑，在 37 ℃下
避光反應30 分鐘，最後用 1Χ PBS 清洗細胞後，以倒立螢光顯微鏡觀察 細胞核與DNA 斷裂之變化。
（8）DNA 瓊膠電泳測定
94
1 Χ 10
7
細胞經化合物處理不同時間點後收集，以1Χ PBS 清洗 1 次，加 入1 mL 4 ℃（lysis buffer 20 mM Tris-Cl、10 mM EDTA、0.2% Triton X-100）於 冰上靜置10 分鐘離心（15000 X g、10 分鐘、4 ℃）取上清液，加入 0.1 mg/mL proteinase K 於 50 ℃水浴反應 8 小時，後再加入 50 µg/mL RNase A 於 37 ℃ 水浴中反應30 分鐘。將反應之檢體以 phenol/chloroform/isopropanol（24︰25︰1）萃取 DNA 後，用 50% isopropanol 及 20 µg/mL glycogen 沉澱 DNA。
沉澱的 DNA 以 70%酒精清洗後，乾燥再溶於 TE buffer 中，用 1%瓊膠電 泳分析並以ethidium bromide（1 µg/mL）染色後，於 UV 燈下觀察 DNA 斷 裂的現象。
（9）粒線體膜電位之檢測
95
細胞經不同濃度的化合物處理不同時間點後，加入DiOC
6
(3)（40 nM）螢 光染劑，於 37 ℃避光培養 30 分鐘，用 1Χ PBS 清洗細胞，利用流式細 胞分析儀及 CELL Quest 軟體分析。（10）Caspases-3、-8、-9 之活性分析
96
根據caspases-3、-8、-9 colorimetric assay Kit 之使用說明操作。1Χ10
6
之 HL-60 細胞經CCY1a-E2（5 µM）處理不同時間點後收集細胞，用 1Χ PBS 清洗 細胞，加入50 µL lysis buffer 於冰上靜置 10 分鐘。離心（15000 X g、1 分 鐘），將上清液移至 96 孔培養盤，加入 50 µL 2Χ reaction buffer 及 5 µL caspases-3（DEVD-pNA）、-8（IETD-pNA）、-9（LEHD-pNA）之專一性受質，於37 ℃中避光反應 3 小時，用 ELISA reader 於波長 405 nm 下測定各樣品 吸光值。
（11）蛋白質抽取液之製備
1. 全細胞抽取液（total cell extract）之製備
97
HL-60 細胞經 CCY1a-E2 處理不同時間後收集細胞，加入 100 µL RIPA 緩 衝液（1% NP-40、0.1% SDS、0.1% sodium deoxycholate、1 mM PMSF、2 µg/µL leupeptin、2 µg/µL aprotinin/PBS）。細胞混合液經超音波震碎兩次，每次 約5 秒，接著放入 100 ℃沸水中 5-10 分鐘，離心（15000 X g、10 分鐘），
收集上清液並測量蛋白質濃度。
2. 細胞質抽取液（cytosolic extract）之製備
98
HL-60 細胞經 CCY1a-E2 處理不同時間後收集細胞，加入 150 µL lysis buffer
（pH7.4 Tris-HCl 50 mM、EDTA 0.5 mM、EGTA 0.5 mM、0.2 mM PMSF、5 µg/µL leupeptin、5 µg/µL aprotinin、0.3﹪2-mercaptoethanol），於冰上靜置 10 分鐘。
離心（15000 X g、10 分鐘）收集上清液，接著放入 100 ℃沸水中 5-10 分 鐘，離心（15000 X g、1 分鐘）後收集上清液並測量蛋白質濃度。
（12）蛋白質轉漬法（Western Blot）
蛋白質抽取液樣品（30 µg）與 SDS 樣本緩衝溶液混合，利用 SDS-PAGE 展開後，轉移蛋白質到 PVDF 膜上。設定電流（mA = 濾紙面積 cm
2
X 0.65），轉漬1 小時。PVDF 膜以 5% 脫脂奶粉/PBST（0.05% Tween 20/1 X PBS）作背景覆蓋（blotting），室溫下 1 小時。加入各個具抗原專 一性的一級 抗體（primary antibody），再以 PBST 清洗 10 分鐘 3 次。加入 HRP-conjugated anti-mouse 或 anti-rabbit IgG 二級抗體（secondary antibody）室溫下作用 1 小時，再經PBST 清洗。以 ECL 試劑組（enhanced chemiluminescence kit）
呈色，再以Kodak X 光底片曝光呈像，並利用 Gel-pro 軟體分析各蛋白質 的表現量。
（13）RNA 的抽取
99,100
HL-60 細胞分別以 CCY1a-E2 處理 0、1、3、4、8 與 12 小時後，收集細 胞，以TRI Reagent 抽取細胞內的 RNA 後以異丙醇沉澱之，並將沉澱的
RNA 乾燥，於-80 ℃儲存。乾燥之 RNA 以 DEPC（diethyl pyrocarbonate）
處理過的H
2
O 溶解後，以分光光度計檢測其濃度與純度。各樣品之 RNA 抽取量均需大於100 µg 且其 OD260
/OD280
的比值均需大於1.5。此外亦以 RNA 瓊脂凝膠電泳確認 RNA 的純度及 18S 及 28S rRNA 是否完整。（14）DNA 基因晶片與 RNA 之雜交反應、結果判讀與分析
委託百恩諾生物科技股份有限公司代為進行 RNA 之雜交反應及結果判 讀與分析。簡述步驟如下：將 mRNA 逆轉錄為更穩定的互補 DNA
（cDNA），並加上螢光標幟：綠色螢光（Cy3）標記於 0 小時處理（即 未處理）HL-60 細胞所製備的 cDNA；紅色螢光（Cy5）則加在經 CCY1a-E2 處理HL-60 細胞所製備的 cDNA。再將螢光標幟的樣本加至含人類 8,000 種基因片段之ABC 人類通用基因晶片（ABC Human Chip 8K-1, HSUN8K-1）
上進行雜交反應，螢光標幟cDNA 會和晶片上能夠與之互補的鹼基序列 結合。
將完成雜交反應之DNA 晶片放入掃瞄器（Gene Pix 4000B [82719]，Image emission wavelength 為 635 nm 及 532 nm）偵測 Cy5 與 Cy3 螢光，再用電 腦軟體（Gene Pix Pro3.0.5.56 software）計算每一點上 Cy5 與 Cy3 螢光之 比值，以判讀CCY1a-E2 處理前後，明顯提升與降低表現的基因，所得 結果以顏色表示之。將各晶片結果整合，經由統計軟體進行 data sets
之adjustment（log transfomed）及 filtering（以選擇進行 clustering 之 dataset，
這些基因於各實驗中乃是具有最明顯之 expression ratio 差異性），再以 Hierachical clustering 及 K-means clustering 分析其相關性（gene clustering analysis）。由以上分析可得知CCY1a-E2 影響 HL-60 細胞基因表現是如何 隨著時間改變；有何趨勢或相關性。
（15）統計分析
實驗所得之實驗數據，採用 SPSS 電腦統計套裝軟體中之變異數分析
（one-way-ANOVA）進行統計分析，各處理組間差異之顯著性，當 P 值 小於0.05 以下時，則認為具統計上意義。