CCY1a-E2 對 HL-60 細胞生長影響的結果

貳、 BALB/c 小鼠活體實驗方法

第三節 CCY1a-E2 對 HL-60 細胞生長影響的結果

（1）CCY1a-E2 對血癌細胞株存活率的影響

為了進一步探討 CCY1a-E2 對血癌細胞生長抑制作用的機制，我們利用 CCY1a-E2 進行各項實驗。HL-60 細胞經 CCY1a-E2（1、2.5、5、10 µM）

處理24 及 48 小時後，以 PI 螢光染色，經流式細胞儀偵測並分析活細胞數目，發現CCY1a-E2 抑制 HL-60 細胞存活的作用呈濃度與時間依存性的關係（concentration- and time-dependent），其處理48 小時之 IC

50

約為 2.5 µM

（圖二十三）。CCY1a-E2（2.5、5、10 µM）處理 24 小時後也有明顯抑制 U937、K562、KG-1 及 KG-1a 等血癌細胞的生長，其作用亦呈濃度依存性的關係（圖二十四）。

（2）CCY1a-E2 對 U937 癌細胞形態之影響

HL-60、U937 細胞以 CCY1a-E2（5 µM）處理 12 小時後，用位相差倒立顯

微鏡直接觀察細胞形態，發現給藥處理後細胞形狀有皺縮的現象，同時伴隨有凋亡小體的產生。以 DAPI 染劑進行細胞核螢光染色，於螢光倒立顯微鏡下觀察，發現給藥處理後細胞核內染色質凝聚，核呈斷裂的情形（圖二十五），初步推測 CCY1a-E2 抑制 U937 細胞生長可能也是經由細胞凋亡途徑。

（3）CCY1a-E2 對血癌細胞的細胞核及核內 DNA 之影響

為了再證實 CCY1a-E2 抑制 U937、K562、KG-1 及 KG-1a 等血癌細胞株生長是經由細胞凋亡途徑，我們用 DNA 電泳檢測分析 CCY1a-E2 於 15 µM 濃度處理這些細胞12 小時後之染色體 DNA，發現經 CCY1a-E2 處理後的各血癌細胞DNA 斷裂成小片段（圖二十六）。

（4）CCY1a-E2 對粒線體膜電位的影響

根據先前的實驗結果得知，2-(benzyloxy)benzaldehyde 衍生物誘導 HL-60 細胞凋亡可能與粒線體途徑有關。基於此特性，我們給予 HL-60 細胞 CCY1a-E2（5 µM）處理 6、12、18、24 小時等不同時間點後，用 DiOC

6

(3)

螢光染色，再以流式細胞儀分析粒線體膜電位的改變情形。我們發現膜電位下降的細胞數比例分別是20.27﹪（0 小時）、24.96﹪（6 小時）、56.67

﹪（12 小時）、63.02﹪（18 小時）、87.06﹪（24 小時）；從 12 小時粒線體的膜電位有下降的趨勢，且隨時間越長，粒線體的膜電位下降的越明顯（圖二十七）。

（5）CCY1a-E2 對 caspase 活性的影響

為了探討CCY1a-E2 對 HL-60 細胞中 caspases 活性變化的影響，我們給予 HL60 細胞 CCY1a-E2（5 µM），並於 2、4、8、12 小時等不同時間點檢測

caspase-9、caspase-8 與 caspase-3 的活性變化情形。結果顯示：細胞經處理後OD

450

吸光值的大小依次為 caspase-9 > caspase-3 > caspase-8（圖二十八）。Caspase-9、-8、-3 的活性在 2 小時開始出現增加的趨勢，且隨時間越長，增加地越明顯。caspase-9 的活性在 2 小時開始增加，在 8 小時達最高峰。因此推論CCY1a-E2 誘導 HL-60 細胞凋亡主要可能是經由 caspase 依賴型之粒線體傳遞路徑所調控。

（6）Caspase-3、-8、-9 專一性抑制劑對 CCY1a-E2 誘導細胞凋亡之影響

為了釐清 CCY1a-E2 誘導 HL-60 細胞凋亡與 caspase 活性變化之間的關聯，我們將 HL-60 細胞分別以不同濃度之 caspase-3（Z-DEVD-FMK）、

caspase-8（Z-IETD-FMK）、caspase-9（Z-LEHD-FMK）專一性抑制劑處理一小時後，再給予 CCY1a-E2（5 µM）經 24 小時後分析細胞存活率。

Caspase-3、-8、-9 專一性抑制劑於 25 µM 和 50 µM 的濃度時，能顯著地降低CCY1a-E2 所誘導的生長抑制作用（圖二十九）。比較對照組（只給予CCY1a-E2），25 µM 抑制劑前處理的細胞其存活率分別為 69.33±0.97﹪

（caspase-3）、64.61±3.43﹪（caspase-8）、64.42±2.83﹪（caspase-9）；給予 50 µM 抑制劑前處理的細胞其存活率分別為 73.32±2.02﹪（caspase-3）、

70.71±1.53﹪（caspase-8）、72.38±2.96﹪（caspase-9）。因此推論caspase-3、

-8、-9 可能都有參與 CCY1a-E2 誘導癌細胞凋亡路徑。

（7）CCY1a-E2 誘導 caspase 之活化並分解 PARP 蛋白質

我們利用西方墨點法觀察 CCY1a-E2（5 µM）處理後的 HL-60 細胞中 caspase-3 的受質 PARP 蛋白質變化的情形。結果顯示 CCY1a-E2 處理後的細胞隨著caspase-3 活性的增加，PARP 於 6-8 小時開始被分解出現 85 KDa 的片段，此結果與caspase-3 活性出現時間相吻合（圖三十）。

（8）CCY1a-E2 對 Bcl-2 家族蛋白質及 cytochrome c 的影響

我們也用西方墨點法分析調節細胞凋亡相關蛋白質在CCY1a-E2（5 µM）

處理之 HL-60 細胞中量的變化。結果顯示 CCY1a-E2 會促使細胞質中 cytochrome c 蛋白質量於 6-8 小時開始增加，且呈現時間依存性。此外，

促進細胞凋亡的 Bax 蛋白質逐漸增加，而抑制細胞凋亡的 Bcl-2 與未活化態的Bid 蛋白質量逐漸降低（圖三十）。

（9）CCY1a-E2 對細胞週期的影響

以低張 DNA PI 染色法配合流式細胞儀分析，觀察在 0-24 小時之間 CCY1a-E2（5 µM）對 HL-60 細胞細胞週期的影響。實驗結果發現：經處理的細胞其細胞週期在6 小時呈現 G2/M 期停滯的現象，且處理時間越久G2/M 期族群越明顯。在 12 小時就有明顯的 sub-G1 細胞核出現，且處理時間越久，sub-G1 的細胞核族群越明顯（圖三十一、圖三十二）。

（10）CCY1a-E2 對細胞週期調控蛋白質之影響

CCY1a-E2 能導致 HL-60 細胞之 G2/M 期停滯，因而可能對調控 G2/M 期相關蛋白質之功能有影響。我們將HL-60 細胞經 CCY1a-E2（5 µM）處理 0-16 小時，利用利用西方墨點法分析cyclin B、CDK1、Cdc25C 及 p21、p27 蛋白質的量。實驗結果顯示：cyclin B、CDK1 和 Cdc25C 蛋白質量於 2 小時後逐漸上升；6 小時後又下降。p21 蛋白質的量也在 CCY1a-E2 處理 4 小時後逐漸增加（圖三十三）；p27 蛋白質的量則無明顯變化。上述結果顯示 CCY1a-E2 使細胞停滯在 G2/M 期是與 CDK1、cyclin B、Cdc25C 及 p21 的表現量有關。

（11）PKA、PKC、ERK、p38/JNK 專一性抑制劑對 CCY1a-E2 誘導 G2/M 期停滯及細胞凋亡之影響

為了釐清 CCY1a-E2 誘導 HL-60 細胞凋亡與 protein Kinases 之間的關係，

我們將細胞各別以不同濃度之 PKA、PKC、ERK、p38/JNK 專一抑制劑處理一小時後，再給予CCY1a-E2（5 µM），經6 及 12 小時後分析細胞週期，

亦於24 小時後分析細胞存活率。結果發現：150 nM 的 H89（PKA 專一抑制劑）、100 nM 的 RO32-0432（PKC 專一抑制劑）及 50 µM 的 SB203580

（p38/JNK 專一抑制劑）並不抑制或促進 CCY1a-E2 所誘導 HL-60 的細胞凋亡現象。50 µM 的 PD98059（ERK 專一抑制劑）及 50 µM 的 U0126（MEK1/2

專一抑制劑）單獨處理或並用CCY1a-E2 處理時，HL-60 細胞之存活率也沒有顯著的差異（圖三十四）。因此推論 PKA、PKC、p38/JNK 及 ERK 等蛋白激酶在實驗的濃度下，可能不是 CCY1a-E2 誘導癌細胞凋亡路徑之參與者。

（12）以 DNA 基因晶片分析 CCY1a-E2 影響 HL-60 細胞基因表現之綜觀

將 HL-60 細胞分別以 CCY1a-E2（5 µM）處理 1、4、8 與 12 小時後，純化細胞內的total RNA，以分光光度計定量。我們得到各處理樣品之 total RNA 量均大於 100 µg，且純度 OD

260

/OD

280

的比值均大於 1.5。此外，以瓊脂凝膠電泳分析 RNA 的純度與穩定性，結果如圖三十五所示，18S 及 28S rRNA 均為完整。

（13）晶片與 RNA 之雜交反應與結果判讀分析

將各 RNA 樣品經逆轉錄並加上螢光標幟後與 ABC 人類通用基因晶片

（HSUN8K-1）進行雜交反應；以掃瞄器讀取結果，並計算晶片上每一點的Cy5/Cy3 螢光比值。並且用軟體分析 HL-60 細胞經 CCY1a-E2 處理不同時間後，被明顯誘發或抑制表現之基因。CCY1a-E2（5 µM）處理 1 至 8 小時後，明顯被誘發表現之基因（up-regulated gene）包括 HLA-G、FASTK、

PROML1、SACS 等；明顯被抑制表現之基因（down-regulated gene）包括

而CCY1a-E2（5 µM）處理 12 小時後，明顯被誘發表現之基因包括 CLC、

ALOX5AP、LYZ、XRCC1、HLA-C、UBE2M、TMSB4X、HLA-A、MEF2D、ENG、

MYL1、S100B、ITM2A、IFNGR2、S100P、RPS5 等；而明顯被抑制表現之基因包括CCND2、XPO1、PIMA、MPP-6、CHEK1、TOK1（調節細胞週期）、

TNF（調節細胞凋亡）及參與 DNA、RNA 及蛋白質合成的基因共 53 個（表十一）。

將各晶片結果整合，進一步分析CCY1a-E2 影響 HL-60 細胞基因表現是如何隨著時間改變；有何趨勢或相關性。分析HL-60 細胞經 CCY1a-E2 處理 1 至 8 小時之晶片結果，其基因表現趨勢的相關性（圖三十六）共呈現 3 種趨勢：（1）隨時間增加而基因表現降低者，包括 CLDN1、LY64、SRP68、

CXCL9、SERPINB2（Group 1）與 CCL7、HLA-C、CCL13、S100A8、S100A9

（Group 4）。（2）隨時間增加而基因表現增加者，包括 ACADL、N33（Group 2）與 SACS、EPHB3、TXK、CTSG（Group 3）。（3）於 4 小時處理時基因表現量上升達最高而後下降者，包括MLLT2、PTPN1、PRPF4B、SCN8A、

LDB1、LASP1（Group 5）與 PKD2L1、CYP4F3、PROML1、TOMM40、FASTK、

KCNJ8、CLCA2、KEL、SERPINA4、GALE、SERPINB8。

第四章討論

為了開發抗癌新藥，我們以 HL-60 細胞篩檢 2-(benzyloxy)benzaldehyde 衍生物之細胞毒殺活性，由表二結果得知，CCY1a（17）具顯著的細胞生長抑制作用，但是將其構造上之–OCH

2

Ph 基團改置於 meta-position（CCY1a-A1, 18）

或para-position（CCY1a-A2, 19）則造成生長抑制作用顯著下降。此外將 CCY1a 之 CHO 置換成 COCH

3

（CCY1a-A3, 20）、COOCH

3

（CCY1a-A6, 23）、CONH

2

（CCY1a-A7, 24）或 CH=NOH（CCY1a-A15, 32；CCY1a-A16, 33；CCY1a-A17, 34）

也會顯著造成生長抑制作用喪失。因此CHO 基團對 CCY1a 之活性是非常重要的。將OCH

3

置於CCY1a 之 meta-position（CCY1a-D1, 25）也降低其活性。

以上結果顯示，似乎2-(benzyloxy)benzaldehyde 類衍生物（26－31）中具明顯 活性者均與 CCY1a 之構造非常相似。其中 CCY1a-E2（29）之活性最佳。根 據抑制癌細胞生長作用的結果，未來我們需要將2-(benzyloxy)benzaldehyde 衍生物的結構再做修飾，例如將CHO 基團改成 COOH、CH

2

OH 或=NCH

2

CHNR

2

，或合成 glycosylated prodrug，期能合成出作用最強的化合物；也需要透過藥品動力學的實驗分析來評估化合物的代謝及半衰期，作為進一步活體試驗的依據。

除了HL-60 外，CCY1a-E2 也對人類血癌細胞（U937、K562、KG-1、KG-1a）

及小鼠幼髓細胞性白血細胞（WEHI-3）具顯著的生長抑制作用。CCY1a-E2

對 HL-60 及 WEHI-3 之 IC

50

均約為 5.0 µM，但是它對正常人週邊單核細胞

（PBMC, peripheral blood mononuclear cell）生長抑制作用甚小。此外在 CCY1a-E2 100 mg/kg/day 劑量下、連續七天尾部靜脈注射，對 BALB/c 小鼠所進行的七天及二十八天毒性試驗之結果顯示：與正常老鼠相比較，CCY1a-E2 處理小鼠之體重改變、活動力、毛色光澤無顯著差異，淋巴結、脾臟及肝臟的外觀和單位體重之脾臟及肝臟重量亦與正常老鼠相當。血清之生化檢查值顯示，八項數值中大多無差異。但是七天毒性試驗中，所有給藥或給賦型劑小鼠之血清glucose 濃度均顯著提高（表五）。是否有可能和細胞內 cAMP 的提昇有關

⁸¹

，或是其它可能因素，則需進一步探討。而二十八天毒性試驗 CCY1a-E2 處理小鼠之 LDH 顯著下降，其原因也待確認（表七）。

源於 BALB/c 之血癌細胞株 WEHI-3 為一種未分化完全的單核球血癌細胞，其特性和人類人類骨髓性白血細胞株HL-60、U937、K562 細胞相似。誘導劑如ATAR、IL-6、G-CSF 及 1,25–Vitamin D3 能使 WEHI-3 細胞進行分化

³

，可藉用NBT、α-naphthyl acetate esterase 染色方法檢測證實。WEHI-3 細胞表面抗原包括CD11b、CD14、Mac-3，因此以 WEHI-3 細胞建立的血癌動物模式，

可以用免疫螢光染色法分析血液及骨髓內各細胞族群及癌細胞之分佈，以確認是否誘發成功血癌，並可簡便地篩選藥物是否具抗癌作用。此外，能取代以抹片觀察並統計未成熟的白血球所佔百分比之耗時、耗眼力的方

法。本研究亦重複了Glass 等

⁷⁹

及He 等

⁸⁰

利用相同WEHI-3 癌細胞株及 BALB/c 小鼠，以靜脈注射的方式成功地於 14 天後誘發 BALB/c 產生血癌。以此