將細胞種植於12 well plate 中，細胞依照 2×105/well 種植於培養皿中，經過 24 小時靜置培養後，待細胞貼附後加入不同濃度的 EFR（50 μg/ml、75μg/ml、
100 μg/ml、125 μg/ml、150 μg/ml），分別培養 24、48 及 72 小時後，收細胞，將 上層液移至離心管中，加入PBS 清洗細胞一次後，再將細胞以 trypsin 處理，置 於37 ºC 培養箱中處理 2 min 後，將細胞打下來，加入 1 ml PBS 以中和 trypsin 之作用，再將所有液體裝到離心管中，1500 rpm 5 min 的離心（重複此步驟一次）， 去除上清液，置於震盪器輕輕震盪再加入4℃的 70% EtOH/PBS，一滴一滴滴入 離心管中以固定細胞，使細胞完全均勻分散於70% EtOH/PBS 中，靜置-20 ºC 隔 夜保存。隔天，取出細胞後離心（1500 rpm 5 min）以去除乙醇，倒掉上清液加 入PBS 3ml 清洗細胞，離心去除上清液，加入 cycle PI 染劑 350 µl（其量視數目 增減），將細胞團打散，避光30 min，以流式細胞儀進行樣品分析，所得之結果 以Modfit LT 軟體分析(159)。
(三) 粒腺體膜電位（Mitochondria membrane potential; ΔΨ
m）之檢測
1. 原理細胞膜電位探針，DioC6（3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide）是一種可穿 透細胞膜，可專一性的結合並累積在細胞粒腺體中，DioC6在細胞內外的分布可
電位。粒腺體膜功能不良（mitochondrial dysfuction）通常伴隨早期細胞凋亡發生，
而細胞粒腺體膜電位的改變也因此當作早期凋亡偵測上的指標(160)。 2. 實驗步驟
將細胞種植於12 well plate中，細胞依照2×105/well種植於培養皿中，經過24 小時靜置培養後，待細胞貼附後加入不同濃度的EFR（50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml、125 μg/ml、150 μg/ml），經24小時時間培養後，收細胞，將上層液移至 離心管中，加入PBS清洗細胞一次後，再將細胞以trypsin處理，置於37℃培養箱 中處理2 min後，將細胞打下來，加入1 ml PBS以中和trypsin之作用，再將所有 液體裝到離心管中，1500 rpm離心5 min，去除上清液，再加入1 ml PBS清洗細 胞，1500 rpm離心5 min，去除上清液，取粒腺體膜電位（ΔΨm）染劑DioC6
（3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide），其配方為10 μl DioC6/500 µl PBS，每管 加入500 µl，其中一管blank不加藥也不加染劑，於37 ºC培養箱避光培養30 min 後，transfer至FACS管中，以流式細胞儀進行樣品分析，每樣品收集10000顆細 胞以CellQuest軟體分析。將blank（格線的peak）的peak調在100~101之間，control
（斜線的peak）調在101~102之間，M1 gated約75％，待條件設定好之後，sample 接續上機後，分析MMP（peak往右不產生apoptosis，往左產生apoptosis）。
圖十一、MMP 軟體的分析圖
M1 M2
100 101 102 103 104
(四) 活性氧化物釋出之檢測
1. 原理免疫細胞進行需氧性滅菌過程中，會在細胞內啟動一連串的氧化還原反 應，因而產生一些Oxidative Metabolites，如 H2O2 ，O2-等free radical。如欲以流 式 細 胞 儀 測 量 這 些 代 謝 物 的 產 量 ， 可 用 Dihydrorodamine 123 、 2’7’-dichlorofluorescein（for H2O2）或hydroethidine（for O2- free radical）等螢光 染劑，對細胞進行染色，藉由2’,7’-dichlorofluorescein diacetate（H2DCF-DA）產 生螢光來測量ROS 的產生，H2DCF-DA 是一種具有螢光性質，可滲透細胞膜特 異性的追蹤評估ROS 的產生。H2DCF-DA 會被細胞內的乙醯酯酶（esterases）去 乙醯化（deacetylated）成非螢光性的 DCFH，DCFH 會在細胞內被 H2O2 氧化成 螢光性質的DCF，並聚集在粒腺體中，所發散螢光則可反映出細胞內 H2O2的濃 度(161)。
2. 實驗步驟
將細胞種植於12 well plate中，細胞依照2×105 /well種植於培養皿中，經過24 小時靜置培養後，待細胞貼附後加入不同濃度的EFR（50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml、125 μg/ml、150 μg/ml），經2小時時間培養後，收細胞，將上層液移至 離心管中，加入PBS清洗細胞一次後，再將細胞以trypsin處理，置於37℃培養箱 中處理2 min後，將細胞打下來，加入1 ml PBS以中和trypsin之作用，再將所有 液體裝到離心管中，1500 rpm離心5 min，去除上清液，再加入1 ml PBS清洗細 胞，1500 rpm離心5 min，去除上清液，取ROS染劑H2DCF-DA染劑（1 μl H2DCF-DA /500 μl PBS）每管加入500 μl，一管blank不加藥也不加染劑，只加 入500 μl PBS，在置於37 ºC培養箱避光培養30 min後，transfer至FACS管中，以
（peak往右是產生自由基，往左是抗氧化）。
（紫外光）UV 的激發下，Indo-1-AM 放出螢光（emission）的強度會隨著細胞 內鈣離子濃度的改變，而發散出不同強度的螢光(162 )。
2. 實驗步驟
將細胞種植於12 well plate中，細胞依照2×105 /well種植於培養皿中，經過24 小時靜置培養後，待細胞貼附後加入不同濃度的EFR（50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml、125 μg/ml、150 μg/ml），經24小時時間培養後，收細胞，將上層液移至 離心管中，加入PBS清洗細胞一次後，再將細胞以trypsin處理，置於37℃培養箱 中處理2 min後，將細胞打下來，加入1 ml PBS以中和trypsin之作用，再將所有液 體裝到離心管中，1500 rpm離心5 min，去除上清液，再加入1 ml PBS清洗細胞，
1500 rpm離心5 min，去除上清液，（接下來步驟要避光處理），取Indo-1-AM染劑 每管加入1000 μl，需有一管blank不加藥也不加染劑，只加入1000 μl PBS，在置
M1 M2
100 101 102 103 104
於37ºC培養箱避光培養1h，每10 min上下混合一次，連續4-6次，之後加入PBS 洗2次，1500 rpm離心5 min，倒掉上清液，每管加入400 μl PBS，再transfer至FACS 管中，以流式細胞儀進行樣品分析，每樣品收集10000顆細胞以Cell Quest軟體分 析。將blank（格線的peak）把peak調在100~101之間control（斜線的peak）調在 100~101之間，M1 gated約0％，待條件設定好之後， sample接續上機，分析calcium release（peak往右為鈣離子釋出）
圖十三、鈣離子軟體分析圖
(六) Caspase-3 活性分析
1. 原理PhiPhiLux 是一種活細胞偵測凋亡的 kit，利用它來檢測凋亡細胞 caspase-3 之產生。PhiPhiLux-G1D1 kit 基質是種含有螢光物質之胺基酸序列（amino acid sequence），而活化之 caspase-3 可以裂解胺基酸序列之特定位置，而螢光物質釋 放出來，再經由流式細胞儀分析，可得知若螢光產量越多則產生活性之caspase-3 越多(163)。
2. 實驗步驟
M1
100 101 102 103 104
一次後，再將細胞以trypsin 處理，置於 37℃培養箱中處理 2 min 後，將細胞打 下來，加入1 ml PBS 以中和 trypsin 之作用，再將所有液體裝到離心管中，1500 rpm 離心 5 min，去除上清液，再加入 1 ml PBS 清洗細胞，1500 rpm 離心 5 min，
去除上清液，取10 µM substrate（Phiphilux green for caspase-3）（Phiphilux red for mitochondria） 每管加入 25 μl，置於 37 ºC 培養箱避光培養 1 h，1 h 後加入 1 ml PBS 洗 1 次，1500 rpm 離心 5min，倒掉上清液，每管加入 500 μl PBS，再 transfer 至FACS 管中，以流式細胞儀進行樣品分析，每樣品收集 10000 顆細胞以 CellQuest 軟體分析。將blank（格線的 peak）把 peak 調在 100~101之間control（斜線的 peak）
調在101~102之間，M1 gated 約 75％以上 sample 上機後，分析 caspase-3 活性（peak 往右為caspase-3 產生）
圖十四、Caspase-3 軟體分析圖
表六、1 倍磷酸鹽緩衝鹽溶液（1× phosphate buffer saline, PBS；pH 7.4）之組成
組成 重量（g）
NaCl 8.0 KCl 0.2
Na2HPO4 1.44
KH2PO4 0.24
加DDW 至總體積 1000 ml
M1 M2
100 101 102 103 104
表七、Viability Propidium iodide stain 之組成
組成 濃度 體積（ml）
Propidium iodide 2 mg/dl 10
1× PBS － 40
總體積50 ml
表八、Cell cycle Propidium iodide stain 之組成
組成 濃度 體積（ml） phenoxy] -2-（2’amino-5- methyl phenoxy）