台灣山豆根根部粗抽物誘導人類肝癌細胞（Hep3B）細胞週期停滯、細胞凋亡與抑制轉移之分子機轉;The Molecular Mechanism of Crude Extracts of Euchresta formosana Radix Induce Cell Cycle Arrest, Apoptosis and Inhibit Metastasis of Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line （Hep3B）
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(2) 目錄. 頁次. 表目錄. v. 圖目錄. vii. 中文摘要. xi. 英文摘要. xiii. 略字表. xv. 第一章. 緒言. 1. 第二章. 總論. 3. 山豆根之文獻考察. 3. 一、山豆根之本草學考察. 3. 第一節. 二、山豆根屬之藥用植物學考察. 14. 三、山豆根之生藥學文獻考察. 20. 四、山豆根之藥理學文獻考察. 23. 五、山豆根之成分文獻考察. 26. 第二節. 細胞週期及相關調控分子之影響. 29. 一、細胞週期. 29. 二、細胞週期相關調控分子. 31. 第三節. MAPK 家族. 35. 第四節. 轉錄因子 NF-κB. 38. 第五節. 細胞凋亡. 40. 一、細胞凋亡的定義. 40. 二、細胞凋亡的形態學變化. 40. 三、細胞凋亡與壞死的區別. 41. 四、細胞凋亡的調控機轉. 42. 第六節 第三章. 48. 細胞轉移. 51. 實驗材料與方法 實驗材料. 51. 一、台灣山豆根之採集. 51. 二、細胞株來源. 52. 第一節. i.
(3) 三、藥品試劑. 52. 四、實驗儀器. 55. 第二節. 57. 實驗方法. 一、基原鑑定方法. 57. 二、台灣山豆根粗抽物製備. 58. 三、人類肝癌細胞 Hep3B 細胞培養. 58. 四、倒立式像位差顯微鏡觀察細胞形態變化. 58. 五、流式細胞儀分析測定. 59. (一) 細胞存活率測定. 59. (二) 細胞週期及 Sub-G1 的比率分析. 60. (三) 粒腺體膜電位之檢測. 60. (四) 活性氧化物釋出之檢測. 62. (五) 鈣離子釋出之檢測. 63. (六) Caspase-3 活性分析. 64. 六、Caspase 抑制劑對台灣山豆根根部粗抽物誘發細胞凋亡之影響. 67. 七、細胞內分子螢光染色(Intracellular flouroescence staining). 67. (一) DAPI 染色分析. 67. (二) 彗星試驗 (Comet assay). 68. 八、DNA 的萃取和電泳分析. 70. 九、細胞蛋白質之萃取(Protein extraction). 72. (一) 細胞總蛋白之製備. 72. (二) 蛋白質濃度測定. 72. (三) 樣品蛋白質定量. 73. 十、細胞質中蛋白質之萃取. 74. 十一、SDS-PAGE 電泳分析. 74. 十二、西方點墨法(Western blotting). 77. 十三、細胞移動試驗. 79. 十四、細胞侵襲試驗. 79. 十五、細胞受傷試驗. 80. 十六、免疫螢光. 80 ii.
(4) 十七、統計分析方法 (Statistics analysis) 第四章. 81 82. 結果. 82. 第一節 生藥組織鑑定. 第二節 台灣山豆根根部粗抽物（EFR）對人類肝癌細胞（Hep3B）抑制增殖作 85. 用. 第三節 台灣山豆根根部粗抽物（EFR）對人類肝癌細胞（Hep3B）形態上的影 86. 響. 第四節 台灣山豆根根部粗抽物（EFR）對人類肝癌細胞（Hep3B）細胞週期之 影響. 87. 一、分析 24 小時細胞週期分布情形. 87. 二、分析 48 小時細胞週期分布情形. 87. 三、分析 72 小時細胞週期分布情形. 88. 第五節 台灣山豆根根部粗抽物（EFR）誘導人類肝癌細胞株（Hep3B）細胞 凋亡現象之探討. 89. 一、DAPI 染色檢測凋亡細胞. 89. 二、單細胞電泳分析(single cell gel electrophoresis assay) 檢測 DNA 損 89. 傷細胞. 三、DNA 電泳法檢測台灣山豆根根部粗抽物對人類肝癌細胞之細胞凋 89. 亡之影響. 第六節 台灣山豆根根部粗抽物（EFR）對人類肝癌細胞癌細胞株（Hep3B）細 胞之凋亡路徑探討. 91. 一、流式細胞儀檢測 EFR 對 Hep3B 細胞活性氧化物產生之影響. 91. 二、流式細胞儀檢測 EFR 對 Hep3B 細胞粒線體膜電位（ΔΨm）之影響 91 三、流式細胞儀檢測 EFR 對 Hep3B 細胞之鈣離子釋出. 91. 四、 流式細胞儀檢測 EFR 對 Hep3B 細胞之細胞凋亡相關蛋白質 caspase-3 活性. 92. 五、檢測 caspase 抑制劑 (z-VAD-fmk) 對 EFR 誘發細胞凋亡存活活性 92. 回復之作用. 第七節 利用西方點墨法探討台灣山豆根根部粗抽物（EFR）對人類肝癌細胞 iii.
(5) （Hep3B）細胞週期停滯之相關蛋白質表現. 93. 第八節 利用西方點墨法探討台灣山豆根根部粗抽物（EFR）對人類肝癌細 （Hep3B）凋亡之相關蛋白質探討. 94. 一、粒線體路徑相關蛋白質表現. 94. 二、細胞膜死亡受體凋亡路徑相關蛋白質表現. 94. 三、ER stress 相關蛋白質表現量. 94. 第九節 細胞體外侵襲試驗. 95. 第十節 細胞體外移動試驗. 95. 第十一節 細胞刮傷試驗. 96. 第十二節 細胞免疫螢光染色試驗. 96. 第十三節 利用西方點墨法探討台灣山豆根根部粗抽物（EFR）對人類肝癌細 胞（Hep3B）轉移之相關蛋白質探討. 97. 一、MAPK 相關蛋白質表現. 97. 二、NF-kB 相關蛋白質表現. 97. 三、MMP 相關蛋白質表現. 98. 第五章. 討論. 99. 第六章. 結論. 103 132. 參考文獻. iv.
(6) 表目錄 xvii. 表一 生藥學術語之英語略字 表二 台灣山豆根的根部成分研究. 27. 表三 four classes of Cyclins and CDKs in mammalian cell cycle. 31. 表四 Cell necrosis 與 apoptosis 之比較. 41. 表五 一次抗體. 53. 表六 1 倍磷酸鹽緩衝鹽溶液. 65. 表七 Viability Propidium iodide stain 之組成. 66. 表八 Cell cycle Propidium iodide stain 之組成. 66. 表九 流式細胞儀染劑配方及用量. 66. 表十 Comet assay 之 lysis buffer 配製. 69. 表十一 Alkaline buffer 之配製. 69. 表十二 Tris buffer 之配製. 69. 表十三 蛋白質標準品之配製. 73. 表十四 SDS-PAGE 下層膠（Separation gel）之配製及組成. 75. 表十五 SDS-PAGE 上層膠（Stacking gel）之配製及組成. 75. 表十六 Running buffer（1.5 M Tris-HCl, pH 8.8）之組成. 76. 表十七 Stacking buffer（0.5 M Tris-HCl, pH6.8）之組成. 76. 表十八 電泳緩衝液（running buffer）之組成. 76. 表十九 轉印緩衝液（Transfer buffer）之組成. 78. 表二十 轉漬夾內部組成. 78. 表二十一 PBS-tween 20 之組成. 78 v.
(7) 表二十二 廣豆根與台灣山豆根顯微特徵比較. vi. 84.
(8) 圖目錄 圖一 山豆根的歷代本草附圖. 9. 圖二 細胞週期的調節. 33. 圖三 Rb protein 與 E2F-1. 34. 圖四 The MAP Kinases Cascades. 37. 圖五 Fas 傳遞的凋亡路徑. 43. 圖六 細胞膜表面受體凋亡路徑. 44. 圖七 粒線體凋亡路徑. 47. 圖八 細胞轉移機制圖. 50. 圖九 台灣山豆根原植物. 51. 圖十 台灣山豆根藥材圖. 51. 圖十一 MMP 軟體的分析圖. 61. 圖十二 ROS 軟體分析圖. 63. 圖十三 鈣離子軟體分析圖. 64. 圖十四 Caspase-3 軟體分析圖. 65. 圖十五 廣豆根之生藥組織圖. 104. 圖十六 台灣山豆根之生藥組織圖. 105. Figure 17. The viable cells were determined by flow cytometry. 106. Figure 18. The apoptotic cells were determined by flow cytometry. 106. Figure 19. Morphology change of Hep3B cells after treatment with different concentration of EFR（0, 50, 75, 100, 125, 150 μg/ml）for 24 h Figure 20. Morphology change of Hep3B cells after treatment with different. vii. 107.
(9) concentration of EFR（0, 50, 75, 100, 125, 150 μg/ml）for 48 h. 107. Figure 21. Morphology change of Hep3B cells after treatment with different concentration of EFR（0, 50, 75, 100, 125, 150 μg/ml）for 72 h. 108. Figure 22. Morphology change of Hep3B cells after treatment with 125 μg/ml of EFR for 6-72 h. 108. Figure 23. The effects of EFR on cell cycle（24 h）and apoptosis in human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. 109. Figure 24. The effects of EFR on cell cycle（48 h）and apoptosis in human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. 110. Figure 25. The effects of EFR on cell cycle（72 h）and apoptosis in human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. 111. Figure 26. The Hep3B cells were incubated with various concentrations of EFR for 24 h and apoptosis were determined by DAPI staining. 112. Figure 27. The Hep3B cells were incubated with various concentrations of EFR for 48 h and apoptosis were determined by DAPI staining. 112. Figure 28. The Hep3B cells were incubated with various concentrations of EFR for 24 h and apoptosis were determined by Comet assay. 113. Figure 29. DNA fragmentation of Hep3B cells treated with EFR examined by DNA gel electrophoresis. 113. Figure 30. Flow cytometric analysis of ROS in human Hep3B cells treated with EFR for 2 hours. 114. Figure 31. The Hep3B cells (2x105 cells/ml) were treated with 125 μg/ml of EFR ( control : 0 μg EFR ) for 0-24 hours to detect the changes of ROS. 115. Figure 32. Flow cytometric analysis of ΔΨm in human Hep3B cells treated with EFR. viii.
(10) for 24 hours. 116. Figure 33. The Hep3B cells (2x105 cells/ml) were treated with 125 μg/ml of EFR (control: 0 μg EFR ) for 0-48 hours to detect the changes of ΔΨm. 117. Figure 34. Flow cytometric analysis of Ca2+ in human Hep3B cells treated with EFR for 24 hours. 118. Figure 35. The Hep3B cells (2x105 cells/ml) were treated with 125 μg/ml of EFR (control: 0 μg EFR ) for 0-48 hours to detect the changes of Ca2+. 119. Figure 36. Flow cytometric assays of the effects of EFR on caspase-3 activity. 120. Figure 37. Effects of EFR on the levels of Cdc25a, cyclin A, cyclin B1, cyclinE, CDK1, CDK2, E2F-1, P-pRb, p21, p27 in Hep3B cells by western blotting. 121. Figure 38. Effects of EFR on the levels of Bad, Bcl-xl, Bcl-xs in Hep3B cells by western blottimg. 121. Figure 39. Effects of EFR on the levels of cytochrome c, AIF, Endo G, cytosolic cytochrome c in Hep3B cells by western blotting. 122. Figure 40. Effects of EFR on the levels of caspase-3, 7, 9, PARP in Hep3B cells by western blotting. 122. Figure 41. Effects of EFR on the levels of Fas, FasL, caspase-8, Bid in Hep3B cells by 123. western blotting. Figure 42. Effects of EFR on the levels of GRP78, GADD153, Caspase-12 in Hep3B cells by western blotting. 123. Figure 43. Effects of EFR on the invasion of Hep3B cells in vitro. 124. Figure 44. Quantification of cells in the lower chambers, which was done by counting at 200X. 124. Figure 45. Effects of EFR on the migration of Hep3B cells in vitro. 125. Figure 46. Quantification of cells in the lower chambers, which was done by counting ix.
(11) at 200X. 125. Figure 47. In vitro wound closure. 126. Figure 48. Immunofluorescence showing RhoA localization. 126. Figure 49. Immunofluorescence showing ROCK-1 localization. 127. Figure 50. Effects of EFR on the levels of JNK-p, c-jun, c-jun-p, PKC, Raf-1, Ras, SOS-1, GRB2, VEGF, HIF-1α in Hep3B cells by western blotting. 127. Figure 51. Effects of EFR on the levels of ERK1/2, JNK1/2, p38-p, p38, MEKK3, MKK7, PI3K, AKT Thr348, AKT Ser473 in Hep3B cells by western blotting. 128. Figure 52. Effects of EFR on the levels of COX1, COX2, iNOS, NF-kB p65, NF-kB p50 in Hep3B cells by western blotting. 128. Figure 53. Effects of EFR on the levels of MMP-1, -2, -9, -10, RhoA, ROCK-1 and FAK in Hep3B cells by western blotting. 129. Figure 54. Proposed model of EFR mechanism of action for apoptosis in Hep3B cells 130 Figure 55. The proposed scheme of mechanism of EFR action on Hep3B cells. x. 131.
(12) 中文摘要 台灣山豆根（Euchresta formosana (HAYATA) OHWI） ，為豆科植物。主要分布於 爪哇、菲律賓及台灣全境低海拔山地叢林蔽蔭下生長。其根部常被當作民間常用 藥，具有瀉熱、解毒、消炎、消腫、止痛之效，尤其對喉痛及毒蛇咬傷特別有療 效，根及葉均用於治喉痛。近來有用於治療癌症，其機轉仍未充分了解。 本研究是探討台灣山豆根根部乙醇粗抽物的抗癌活性機轉。主要分成兩大部 分：一為細胞週期停滯及細胞凋亡；另一為抑制癌細胞轉移。結果顯示： (一) 95％ 的酒精粗抽物在人類肝癌細胞株 Hep3B 會導致細胞週期停滯在 S 期並誘導 sub-G1 peak 的產生，而凋亡部分：形態學觀察這些細胞，發現細胞膜 呈現模糊不清，細胞質空泡化，部分細胞皺縮並且死亡；DNA 的合成減少並在 電泳分析下可見典型的 DNA ladder pattern；而當細胞凋亡時染色質會凝結造成 DNA 斷裂，斷裂越多 DAPI 染劑則接上越多，實驗後可觀察到螢光強度增強， 因此台灣山豆根根部 95％酒精粗抽物具有細胞毒殺作用，並可導致細胞產生凋 亡作用。由西方墨點法分析細胞週期蛋白，結果顯示台灣山豆根根部乙醇粗抽物 造成細胞週期停滯在 S 期可能與細胞內 cyclin B1、cyclin E 減少與抑制 CDK1、 CDK2 蛋白質表現量及 CDK 抑制者 p21, p27 的活化有關。另外，為了進一步探 討凋亡路徑，以流式細胞儀分析粒線體膜電位、ROS 及鈣離子的釋出，顯示出 ROS 產生使得內質網的 GADD153、GRP78 蛋白表現量的增加，並使得鈣離子釋 出。此外，caspase-3,-7,-9 的活化導致 PARP 的裂解；Bcl-xl 的減少，Bax, Bad 的 增加，cytochrome c 的釋出，抑制細胞凋亡與促進細胞凋亡的分子等影響；另外， 細胞膜上的死亡受體路徑，Fas/CD95 表現量增加，caspase-8 表現增加並活化 caspase-3 及使 Bid 裂解。綜合以上的分析凋亡路徑可能與細胞膜上死亡受體路 徑、粒線體釋出 cytochrome c、ER stress 導致鈣離子的產生及 caspase 活化有關， 使 Hep3B 細胞產生 p53 不依賴性的凋亡現象。 (二) 針對 Hep3B 細胞體外轉移及侵襲試驗，基質金屬蛋白水解酶 matrix. xi.
(13) metalloproteinases (MMPs) 是 一 種 蛋 白 水 解 酶 ， 其 作 用 會 將 細 胞 外 基 質 extracellular matrix（ECM）降解。細胞外基質的降解，在癌細胞轉移侵襲上影響 扮演著舉足輕重的角色。結果顯示出控制組有轉移及侵襲的現象，而加藥組則完 全抑制了 Hep3B 細胞的轉移和侵襲。由西方墨點法分析 RhoA, ROCK-1, FAK 以 及 MMP-1, -2, -9, -10 皆有抑制表現，進而抑制細胞的轉移趨勢。綜合上述兩方 面結果可知對於人類肝癌細胞抗癌活性的影響機制，以及提供一個對未來更深入 研究探討的基石，並開拓ㄧ新藥物發展為肝癌臨床上治療與預防上的新契機。. xii.
(14) ABSTRACT Euchresta formosana (HAYATA) OHWI (Leguminosae) distributed in Java, Philippines and Taiwan occurring in shady and humid places. The roots of this plant have been used in detoxification, reduce inflammation, detumescence, analgesia, especially for the throat and snake wounds in Taiwan. Recently it can use in cancer therapy, but underlying mechanism is not well known. Our research to investigate the mechanism of anticancer activity of the 95% ethanol extracts from Euchresta formosana. Our data can be divided into two parts: the first part contains cell cycle arrest and cell apoptosis; the second part includes inhibition of metastasis. The data showed that the effects of 95% ethanol extracts of Euchresta formosana radix (EFR) on the cell cycle and apoptosis in human hepatocellular carcinoma (HCC) Hep3B cells were investigated. The results indicated that EFR decreased DNA synthesis and viable Hep3B cell numbers in a concentration-dependent manner. The EFR induced a p21- and p27-dependent cell cycle arrest in S-phase and apoptosis of the Hep3B cells. The induction of apoptosis by EFR treatment was also confirmed by DAPI staining. The EFR inhibited cyclin-dependent kinase (CDK) -1 and -2 expression and decreased cyclin B1 and E levels, resulting in S-phase arrest. The EFR induced reactive oxygen species (ROS) production followed by endoplasmic reticulum (ER) stress that was based on the increase of GADD153 and GRP78 which led to the release of Ca2+ in the Hep3B cells. The EFR promoted apoptosis was associated by increasing activation of caspase-3, -7, and -9 and enhanced poly(ADP-ribose) polymerase cleavage and increased expression of p21CIP1/WAF1, p27KIP1, Bax and Bad. Furthermore, the level of Bcl-xl decreased after EFR treatment. Alteration of these key anti- and pro-apoptotic proteins could contribute to the increase in p53-independent apoptosis that was observed in the Hep3B cells. The other phase, the. xiii.
(15) effect of EFR on cell migration and invasion by the human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line (Hep3B) was examined. Hep3B cells treated in vitro with EFR migrated and invaded less than cells treated with phosphate-buffered saline (PBS) as a control. EFR inhibited migration and invasion by down-regulating the production of RhoA and ROCK-1, FAK and matrix metalloproteinase-1, -2, -9 and -10 relative to PBS only. These results showed that EFR inhibits invasion and migration by liver cancer cells by down-regulating proteins associated with these processes, resulting in reduced metastasis. Thus, EFR should be considered as a possible therapeutic agent for inhibiting primary tumor growth and preventing metastasis.. xiv.
(16) 略字表 2-ME. 2-Mercaptoethanol. AIF. apoptosis-inducing factor. AP-1. activator protein-1. Apaf-1. apoptosis protease-activating factor-1. APO.. apoptosis. APS. ammonium persulfate. BSA. bovine serum albumin. Caspase. cystein aspartate-specific protease. CDK. cyclin-dependent kinase. CDKI. cyclin-dependent kinase inhibitor. CD95. Fas receptor. DED. death effector domain. DISC. death Inducing Signaling Complex. DD DMEM. C-terminal death domain Dulbecco’s modified Eagle medium. DMSO. dimethyl sulphoxide. DCFDA. 2’7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate. DiOC6. 3,3’-dihexyloxacarbocyanine. E2F. early gene 2 factor. ECL. enhanced chemiluminescence. ECM. extracellular matrix. EDTA. ethylenediamine –tetra-acetic acid. EFR. Euchresta formosana radix. EGF-receptor. epidermal growth factor-receptor. ER. endoplasmic reticulum. ERK. extracellular signal-regulated kinase. ELISA reader. enzyme-Linked Immunosorbent Assay reader. FADD. Fas-associated protein with death domain. FBS. fetal bovine serum. FACS. flow cytometry xv.
(17) FAK. focal Adhesion Kinase. GRP78. glucose-related protein 78. HCC. hepatocellular carcinoma. HRP IC50. horseradish peroxidase inhibition concentration. IGF-1. insulin-like growth factor-1. I-κB. inhibitor of NF-kappa B. JNK. C-jun N-termal kinase. MAPK. mitogen-activated protein kinase. MMP. matrix metalloproteinases. NF-κB. nuclear factor- kappa B. PARP. poly (ADP-ribose) polymerase. PBS. phosphate-buffer saline. PI. propidium iodide. PI3K. phosphatidylinositol 3-kinase. PKC. protein kinase C. pRb. retinoblastoma protein. PS. phosphatidylserine. PVDF. polyvinylidene fluoride. RNase A. ribonuclease A. ROS. reactive oxygen species. SDS. sodium dodecyl sulfate. SDS-PAGE. sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. TEMED. N,N,N’,N’ Tetramethyl-ethylendiamine. TNFγ. tumor necrosis factor gamma. TNFR1. tumor necrosis factor receptor 1. TRADD. TNFR-associated factor 2. TRAIL. TNF-releated apoptosis inducing ligand. TRAF2. TNF-associated factor 2. TUNEL. Terminal deoxynucleotidyltransferase UTP Nick End Labeling. VEGF. vascular endothelial growth factor xvi.
(18) 表一 生藥學術語之英語略字 略號. 術語. 中文名. bf. bast fiber. 靱皮纖維. c. cambium. 形成層. ca. clustered crystal. 集晶（簇晶）. cx. cortex. 皮（皮部）（皮層）. ep. epidermis. 表皮. f. fiber. 纖維. fb. fiver bundle. 纖維束. kl. cork layer. 栓皮層. kc. cork cambium. 栓皮形成層. ph. phloem (leptome). 篩部. mr. medullary ray. 髓線. p. parenchyma. 柔細胞（柔組織）. v. vessel (trachea). 導管. vb. vascular bundle. 維管束. vd. bordered pit vessel. 有緣孔紋導管. vg. ring vessel. 環紋導管. vp. pitted vessel. 孔紋導管. vr. reticulate vessel. 網紋導管. vs. spiral vessel. 螺旋紋導管. x (xy). xylem. 木部. xp. protoxylem. 原生木部. xvii.
(19) 第一章 緒言 肝癌（肝惡性腫瘤）是常見的惡性腫瘤，在過去的半個世紀以來肝癌病人仍 有高死亡率(1)，暫居癌症死亡的第三位，每年影響全球將近一百萬人(2)。罹患肝 癌高危險群以 35 歲以上的成年人為主(3)，目前患者有年輕化的趨勢。造成肝癌 的原因很多包括抽煙、酒精、黴菌毒素和人類肝炎病毒(4)，根據行政院衛生署統 計，癌症為台灣十大死因之首，而肝癌高居第二位。治療方法以外科手術、放射 療法、化學治療為主，然而這些結果並非讓人滿意，積極尋求更佳抗癌藥物的篩 選及癌症預防，實為當務之急。 肝癌大致上可分為原發性肝癌和轉移性肝癌兩大類。 所謂原發性肝癌就是 指由肝本身的細胞或組織所產生的惡性腫瘤，包括肝細胞癌、肝膽管癌、肝細胞 與肝膽管之混合型癌和肝母細胞癌等。而癌症的發生屬於多步驟的連續發展與進 化，並可使癌細胞從原位癌轉移到其他地方，而造成了癌細胞的轉移，超過 90 ％的癌症病人並非死於原位癌而是次位癌所造成的死亡(5-6)。細胞透過組織或器 官移動能力是在癌細胞的發展中扮演著重要的角色，其演化過程是因腫瘤細胞附 著到細胞外的基質，而其相關的蛋白質水解酵素會造成基質的分解，所以腫瘤細 胞轉移到其他地方，會藉由蛋白質水解使其基質的組成改變(7-9)。 一般標準的化學治療對於轉移細胞可以減少細胞的增生和降低敏感度 (10-12). 。因此，癌症的治療種類必須往二方面發展，一是造成癌細胞凋亡(13-15)，另. 一方面和減少腫瘤細胞的侵襲和穿透活性進而達到抑制癌轉移之效果。許多的天 然物質被認為具有改善免疫功能的價值、預防癌症及當抗氧化劑等作用來當作癌 症治療的藥物。台灣山豆根（Euchresta formosana（HAYATA）OHWI）植物自古以 來就是傳統中草藥，具有清熱、解毒、止痛、消炎之功效，而在台灣民間常應用 於治療毒蛇咬傷。近代研究指出具有抗血小板凝集(16)、抗 HIV 病毒(16)，對肝癌 細胞 59T(17)、胃腺癌細胞 SCM-1 具有細胞毒性(17)等作用。至於台灣山豆根之根 部粗抽物的抗癌活性目前並無文獻記載細胞週期停滯和細胞凋亡的相關資料。. -1-.
(20) 因此，為了提昇本土山豆根藥材之研發，多年來學者不斷投入研究其成份與藥理 作用，企圖尋找符合現代醫療需求。故本研究以台灣山豆根根部（EFR）為研究 材料，探討其對人類肝癌細胞 Hep3B 細胞之影響，首先測試 EFR 對 Hep3B 細胞 存活率之影響，及藉由型形態（morphology）上觀察細胞之變化，再更進一步利 用 DAPI 染色、單細胞凝膠電泳（single cell gel electrophoresis；Comet assay）及 DNA fragmentation 觀察細胞是否有細胞損傷（DNA damage）；另外針對粒線體 膜電位（ΔΨm） 、活性氧化物產生（ROS products） 、凋亡蛋白活性之檢測、鈣離 子的釋出（calcium release）來討論並以 Western blot 來驗證凋亡路徑之影響。 另一方面，探討 EFR 對 Hep3B 細胞抑制轉移之影響，使用了體外細胞穿透、 侵襲和受傷試驗，檢測細胞加入 EFR 是否具有抑制癌細胞的轉移，並以 Western blot 來檢測抑制癌細胞的轉移的相關蛋白質表現。期望進一步找出具抗癌的體外 分子機制(18)，並能以台灣山豆根來達到成為市售山豆根之代用品。. -2-.
(21) 第二章 總論 第ㄧ節 山豆根之之文獻考察 一、山豆根之本草考察 （一）歷代諸家本草所錄山豆根原文 開寶本草：山豆根 味甘，寒，無毒。主解諸藥毒，止痛，消瘡腫毒，人及 馬急黃發熱，咳嗽，殺小蟲。生劍南山谷。蔓如豆(19)。 圖經本草曰：山豆根，生劍南山谷，今廣西亦有，以忠、萬州者佳。苗蔓如 豆根，以此為名。葉青，經冬不凋，八月採根用。今人寸截，含以解咽喉腫痛， 極妙。廣南者，如小槐，高尺餘，石鼠食其根。故嶺南人捕石鼠，破取其腸胃曝 乾。解毒攻熱，甚效(20)。 重輯嘉祐補註神農本草：山豆根 味甘，寒，無毒。主解諸藥毒，止痛，消 瘡腫毒，人及馬急黃發熱，咳嗽，殺小蟲。生劍南山谷。蔓如豆(21)。 經史證類備急本草：山豆根 味甘，寒，無毒。主解諸藥毒，止痛，消瘡腫 毒，人及馬急黃發熱，咳嗽，殺小蟲。生劍南山谷。蔓如豆。 圖經曰：山豆根，生劍南山谷，今廣西亦有，以忠、萬州者佳。苗蔓如豆， 根以此為名。葉青，經冬不凋，八月採根用。今人寸截，含以解咽喉腫痛，極妙。 廣南者如小槐，高尺餘，石鼠食其根。故嶺南人捕石鼠，破取其腸胃曝乾。解毒 攻熱，甚效。 經驗方：備急治一切疾患，山豆根方：右用山大豆根不拘多少，依下項治療。 一名解毒，二名黃結，三名中藥。患蠱毒，密遣人和水研已，禁聲，服少許，不 止再服。患痜瘡，以水研敷瘡上。患喉痛，含一片細嚥津。患五種痔，水研服。 患齒痛，含一片於痛處，患麩豆等瘡，水研服少許。患頭風，搗末油調塗之。患 赤白痢搗末蜜丸，空心煎水下二十丸，三服自止，患腹脹滿喘悶，搗末少許，煎 水調一盞差。患瘡癬，搗末，臘月猪脂調塗之。患頭上白屑，搗末油浸塗。如是. -3-.
(22) 孩兒，即乳汁調半錢。患中宿冷蠱，寸白蠱，每朝空心酒調三錢，其蠱自出。患 五般急黃，空心以水調二錢。患蠱氣，酒下二錢。患霍亂，橘皮湯下三錢。患熱 腫，水研濃汁塗，乾即更塗。女人患血氣腹腫，以末三錢，熱酒下空心服之。卒 患腹痛，水研半盞，入口差。蜘蛛咬，唾和塗之。狗咬，蚍蜉瘡，蛇咬，並水研 敷之，若大以水調服二錢(22)。 經史證類大觀本草：山豆根 味甘，寒，無毒。主解諸藥毒，止痛，消瘡腫 毒，人及馬急黃發熱，咳嗽，殺小蟲生劍南山谷。蔓如豆。 圖經曰：山豆根，生劍南山谷，今廣西亦有，以忠、萬州者佳。苗蔓如豆， 根以此為名。葉青，經冬不凋，八月採根用。今人寸截，含以解咽喉腫痛，極妙。 廣南者如小槐，高尺餘，石鼠食其根。故嶺南人捕石鼠，破取其腸胃曝干。解毒 攻熱，甚效。 經驗方、備急：治一切疾患，山豆根方：右用山大豆根不拘多少，依下項治 療。一名解毒，二名黃結，三名中藥。患蠱毒，密遣人和水研已，禁聲，服少許， 不止再服。患禿瘡，以水研敷瘡上。患喉痛，含一片細咽津。患五種痔，水研服。 患齒痛，含一片於痛處，患麩豆等瘡，水研服少許。患頭風，搗末油調塗之。患 赤白痢搗末蜜丸，空心煎水下二十丸，三服自止，患腹脹滿喘悶，搗末少許，煎 水調一盞瘥。患瘡癬，搗末，臘月猪脂調涂之。患頭上白屑，搗末油浸塗。如是 孩兒，即乳汁調半錢。患中宿冷蟲，寸白蟲，每朝空心熱酒調三錢，其蟲自出。 患五般急黃，空心以水調二錢。患蠱氣，酒下二錢。患霍亂，橘皮湯下三錢。患 熱腫，水研濃汁塗，乾即更塗。女人患血氣腹腫，以末三錢，熱酒不空心服之。 卒患腹痛，水研半盞，入口瘥。蜘蛛咬，唾和塗之。狗咬，蚍蜉瘡，蛇咬，並水 研敷之，若大以水調服二錢(23)。 重修政和經史證類備用本草：山豆根味甘，寒，無毒。主解諸藥毒，止痛， 消瘡腫毒，人及馬急黃發熱，咳嗽，殺小蟲生劍南山谷。蔓如豆。 圖經曰：山豆根，生劍南山谷，今廣西亦有，以忠、萬州者佳。苗蔓如豆， 根以此為名。葉青，經冬不凋，八月採根用。今人寸截，含以解咽喉腫痛，極妙。 -4-.
(23) 廣南者如小槐，高尺餘，石鼠食其根。故嶺南人捕石鼠，破取其腸胃曝干。解毒 攻熱，甚效。 經驗方、備急：治一切疾患，山豆根方：右用山大豆根不拘多少，依下項治 療。一名解毒，二名黃結，三名中藥。患蠱毒，密遣人和水研已，禁聲，服少許， 不止再服。患禿瘡，以水研敷瘡上。患喉痛，含一片細咽津。患五種痔，水研服。 患齒痛，含一片於痛處，患麩豆等瘡，水研服少許。患頭風，搗末油調塗之。患 赤白痢搗末蜜丸，空心煎水下二十丸，三服自止，患腹脹滿喘悶，搗末少許，煎 水調一盞瘥。患瘡癬，搗末，臘月猪脂調涂之。患頭上白屑，搗末油浸塗。如是 孩兒，即乳汁調半錢。患中宿冷蟲，寸白蟲，每朝空心熱酒調三錢，其蟲自出。 患五般急黃，空心以水調二錢。患蠱氣，酒下二錢。患霍亂，橘皮湯下三錢。患 熱腫，水研濃汁塗，乾即更塗。女人患血氣腹腫，以末三錢，熱酒不空心服之。 卒患腹痛，水研半盞，入口瘥。蜘蛛咬，唾和塗之。狗咬，蚍蜉瘡，蛇咬，並水 研敷之(24)。 本草品彚精要：山豆根主解諸藥毒止痛消瘡腫毒人及馬急黃發熱咳嗽殺小蟲 （名醫所錄） 【名】解毒黃結中藥【苗】 ［圖經曰］其葉青色經冬不凋苗蔓如豆根 以此為名也今人寸截含以解咽喉腫痛極妙廣南者如小槐高尺余石鼠食其根人捕 石鼠破取其腸胃曝干解毒攻熱甚效【地】［圖經曰］生劍南山谷今廣西亦有［道 地］宜州果州以忠萬州者佳【時】 ［生］春生新葉［採］八月取根【收】暴乾【用】 根【色】黑黃【味】苦【性】寒洩【氣】氣薄味厚陰中之陽【臭】朽【主】止咽 痺消瘡腫【製】刮去皮剉用【治】 ［療］ ［圖經曰］寸截含之除咽喉腫痛［別錄云］ 密遣人水研禁聲服少許消蠱毒如不止再服之及治五種痔疾并麩豆等瘡又止腹痛 入口即瘥○末水調服少許治腹脹喘滿悶服二錢除五般急黃以水研敷熱腫并狗咬 蛇咬蚍蜉瘡并效【合治】搗末合油調塗治頭風○搗末合密為丸空心煎水下二十丸 治赤白痢○搗末合臘月猪脂調塗瘡癬○搗末合油浸塗治頭上白屑小兒乳汁調半 錢○搗末空心合酒調下三錢治宿冷蟲寸白蟲其蟲自出○末合酒調下二錢治蠱氣 ○合橘皮湯下三錢治霍亂○末三錢以熱酒調空心服之治女人血氣腹腫○末以唾 -5-.
(24) 和塗之治蜘蛛咬瘡(25)。 本草蒙筌：味苦、氣寒。無毒。各處山谷俱有，廣西出者獨佳。俗呼金鎖匙， 苗長一尺許。葉兩傍而有曲鈕，子成簇而色鮮紅。粒似豆圓，名因此得。凡資療 病，惟取其根。口嚼汁吞，止咽喉腫痛要藥﹔水調末服，除人馬急黃捷方。敷蛇 虫咬傷，去血氣腹痛(26)。 本草綱目： 【釋名】解毒 綱目、黃結 綱目、中藥。 頌曰：其蔓如大豆，因 以為名。【集解】頌曰：山豆根，生劍南及宜州、果州山谷，今廣西亦有，以忠 州、萬州者為佳。苗蔓如豆，葉青，經冬不凋，八月采根。廣南者如小槐，高尺 餘，石鼠食其根。故嶺南人捕鼠，取腸胃曝乾，解毒攻熱效。【氣味】甘，寒， 無毒。時珍曰：按：沈括筆談云：山豆根 味極苦，本草言味甘，大誤矣。 【主治】 解諸藥毒，止痛，消瘡腫毒，發熱咳嗽，治人及馬急黃，殺小蟲 開寶。含之嚥 汁，解咽喉腫毒，極妙（蘇頌）。研末湯服五分，治腹脹喘滿。酒服三錢，治女 人血氣腹脹，又下寸白諸蟲。丸服，止下痢。磨汁服，止卒患熱厥心腹痛，五種 痔痛。研汁涂諸熱腫禿瘡，蛇狗蜘蛛傷（時珍） 。 【附方】舊十，新三。解中蠱毒： 密取山豆根和水研，服少許，未定再服。已禁聲者，亦愈。五般急黃：山豆根末， 水服二錢。若帶蠱氣，以酒下。霍亂吐痢：山豆根末，橘皮湯下三錢。赤白下痢： 山豆根末，蜜丸梧子大。每服二十丸，空腹白湯下，三服自止。 （以上并備急方） 水蠱腹大有聲，而皮色黑者：山豆根末，酒服二錢。聖惠方 卒患腹痛：山豆根， 水研半盞服，入口即定。頭風熱痛：山豆根末，油調，塗兩太陽。頭上白屑：山 豆根末，浸油，日塗之。牙齦腫痛：山豆根一片，含於痛所。（以上並備急方） 喉中發癰：山豆根，磨醋噙之，追涎即愈。勢重不能言者，頻以雞翎掃入喉中， 引涎出，就能言語。 （永類方）麩豆諸瘡，煩熱甚者：水研山豆根汁，服少許。 （經 驗方）疥癬蟲瘡：山豆根末，臘猪脂調塗。 （備急方）喉風急證，牙關緊閉，水 穀不下：山豆根、白藥等分，水煎噙之，嚥下，二、三口即愈。（楊清叟 外科） (27). 。 本草匯言：味苦，氣寒，無毒。蘇氏曰:山豆根，生劍南及宜州、果州及廣 -6-.
(25) 西忠州、萬州。莖蔓如大豆，葉青翠，經冬不凋。今廣南一種，如小槐，高尺餘， 石鼠食其根，補取其腸胃曝干，解毒攻熱，甚效。不識果然否。 山豆根 通咽喉，蘇頌 下結熱，開寶 解蠱毒之藥也。宋正泉稿 此藥苦寒清 肅，得降下之令，善除肺胃郁熱，如咽喉腫痺不通，小兒丹毒熱腫，婦人血氣腹 脹，及痢疾赤白，急黃疸症。又療熱厥心痛，天行熱疹，五疳五痔，凡一切暴感 熱疾，涼而解毒，表里上下，無不宜之。但苦寒多泄，凡脾胃虛冷者，勿服。 集方 楊清叟方：治喉風急症，牙關緊閉，水谷不下，用山豆根，白藥子各 等分，水煎噙之，咽下二三口，即癒。經惠方 共四首：治中蛊毒。用山豆根， 和白湯研服少許，未淨再服。已禁聲音者亦愈。治小兒丹毒赤腫，以山豆根水摩， 擦患處。治女人血氣熱郁成腹脹者。用山豆根，同木香，白湯磨服。治水蠱腹大 有聲，面皮色黑者，用山豆根，同烏藥白湯磨服。備急方：治赤白痢疾。用山豆 根五錢，川黃連二錢，共為末，蜜丸梧子大，每服一錢，白湯下。方脈正宗 共 四方：治五般急黃。用山豆根，為末，白湯調服二錢，兼蛊氣者，以酒調下；治 熱厥心痛，以山豆根，白湯磨服少許；治小兒五種熱疳，以山豆根為末，每服三 分，白湯調服；治血熱痔痛。用山豆根冷水磨服(28)。 植物名實圖考（上） ：山豆根生長沙山中。矮科硬莖，莖根黑褐，根稍微白。 長葉光滑如木犀而靭柔，微齒圓長，有齒處邊厚如卷。梢端結青實數粒如碧珠。 俚醫以治喉痛。按形似與圖經不類，根味亦淡，含之有氣一縷入喉微苦，又一種 也。秋深實紅如丹，與小青無異。又名地楊梅(29)。 植物名實圖考（下）：山豆根，開寶本草始著錄。今以為治喉痛要藥，以產 廣西者良。江西、湖南別有山豆，皆以治喉之功得名，非一種。 雩婁農曰：甚矣物之利於人者易於售偽，而欲利人者，不可不博求而致意也。 山豆根治喉痛，舉世知之、賴之。然余所見江右、湘、滇之產，味皆薄而與原圖 異，而原圖又非如小槐者。不至其地，烏知其是耶、非耶(30)？ 植物名實圖考長編：開寶本草：山豆根味甘，寒，無毒。主解諸藥毒，止痛， 消瘡腫毒，人及馬急黃發熱，咳嗽，殺小蟲生劍南山谷。蔓如豆。 -7-.
(26) 圖經曰：山豆根，生劍南山谷，今廣西亦有，以忠、萬州者佳。苗蔓如豆， 根以此為名。葉青，經冬不凋，八月採根用。今人寸截，含以解咽喉腫痛，極妙。 廣南者如小槐，高尺餘，石鼠食其根。故嶺南人捕石鼠，破取其腸胃曝干。解毒 攻熱，甚效。 經驗方、備急：治一切疾患，山豆根方：右用山大豆根不拘多少，依下項治 療。一名解毒，二名黃結，三名中藥。患蠱毒，密遣人和水研已，禁聲，服少許， 不止再服。患禿瘡，以水研敷瘡上。患喉痛，含一片細咽津。患五種痔，水研服。 患齒痛，含一片於痛處，患麩豆等瘡，水研服少許。患頭風，搗末油調塗之。患 赤白痢搗末蜜丸，空心煎水下二十丸，三服自止，患腹脹滿喘悶，搗末少許，煎 水調一盞瘥。患瘡癬，搗末，臘月猪脂調涂之。患頭上白屑，搗末油浸塗。如是 孩兒，即乳汁調半錢。患中宿冷蟲，寸白蟲，每朝空心熱酒調三錢，其蟲自出。 患五般急黃，空心以水調二錢。患蠱氣，酒下二錢。患霍亂，橘皮湯下三錢。患 熱腫，水研濃汁塗，乾即更塗。女人患血氣腹腫，以末三錢，熱酒不空心服之。 卒患腹痛，水研半盞，入口瘥。蜘蛛咬，唾和塗之。狗咬，蚍蜉瘡，蛇咬，並水 研敷之；若大。以水調服二錢。 廣西通志 山豆根萬承土州者佳。苗蔓如豆葉青，經冬不凋，根解熱毒(31)。. -8-.
(27) 圖經本草. 經史證類備急本草. 經史證類大觀本草. 本草綱目. 重修政和經史證類備用本草. 植物名實圖考(上). 圖一、山豆根的歷代本草附圖. -9-. 植物名實圖考(下).
(28) （二）山豆根之本草系統圖 宋 開寶本草 (974AD) (山豆根). 本草圖經 (山豆根). 宋 嘉祐補注神農本草 (1061AD) (山豆根). 本草蒙荃. 宋 經史證類備急本草 (1098AD) (山豆根). (1565AD) (山豆根、金鎖匙) 宋 經史證類大觀本草 (1108AD) (山豆根). 明 本草綱目 (1583AD) (山豆根、解毒 黃結、中藥). 宋 重修政和經史證類備用本草 (1249AD) (山豆根). 清 植物名實圖考. 本草匯言 (1624AD) (山豆根). (1848AD) (山豆根、地楊梅). 清 植物名實圖考長編 (1848AD) (山豆根). 中華人民共和國藥典 (2000AD) (山豆根). 中華中藥典 (2004AD) (山豆根). - 10 -. 明 本草品彙 精要(1505AD) (山豆根、解毒 黃結、中藥).
(29) （三）山豆根之本草學考察 1. 藥名之考訂 山豆根之名最早見於開寶本草(19)，蔓如豆為稱；圖經本草曰：苗蔓如豆根， 以此為名(20)。；李時珍本草綱目(27)曰：一名解毒，二名黃結，三名中藥。植物 名實圖考(29)：秋深實紅如丹，與小青無異。又名地楊梅。 綜合上述，山豆根以其形態“蔓苗如豆根”為其源之正名，又名解毒、黃結、 中藥等或別稱地楊梅。 2. 形態、種類及產地之考定 圖經本草曰： 「山豆根，生於劍南山谷。……今廣西亦有，以忠、萬州者佳。 葉青，經冬不凋，八月採根用。……。廣南者如小槐，高尺余(20)。」 嘉祐補注神農本草曰：「生劍南山谷，蔓如豆(21)。」 證類本草曰：「附有宜州及果州山豆根圖，亦截然不同(22)。」 植物名實圖考曰：「山豆根，開寶本草使著錄。今以為治喉痛要藥，以產廣西者 良。江西、湖南別有山豆，皆已治喉之功得名，非一種(30)。」 廣西通誌曰：「山豆根萬承土洲者佳，苗蔓如豆葉青，經冬不凋(31)。」 綜合上述，考歷代諸家本草藥圖對照及歷代文獻均指出，山豆根為豆科 （Leguminosae）植物柔枝槐（Sophora subprostrata CHUN et T. CHEN），亦即越南 槐 （Sophora tokinensis GAGNEP）的乾燥根。其產地於“劍南山谷”，即今四川 成 都，今廣西亦有，以忠州，即今廣西 南寧，及萬州，即今廣東 萬縣者佳。苗蔓 如豆，根以此為名，葉青經冬不凋，八月採根。………廣南者如小槐，高尺余……。 證類本草附有宜州與果州山豆根圖，亦截然不同，以忠州………者佳………廣南 者如小槐，高尺余，所指就是現今作廣豆根用的柔根槐。 3. 性味、藥能之考訂 開寶本草曰：「山豆根，味甘，寒，無毒。主解諸藥毒，止痛，消瘡腫毒， 人及馬急黃發熱，咳嗽，殺小蟲(19)。」 圖經本草曰：「破取其腸胃暴干，解讀攻熱、甚效(20)。」 李時珍本草綱目曰：「按沈括筆談雲云，山豆根，味極苦，本草言味甘，大誤 - 11 -.
(30) 矣(27)。」 雩婁農曰：「山豆根治喉痛，舉世知之、賴之(30)。」 廣西通誌曰：「根解熱毒(31)。」 綜合上述，山豆根味苦、寒，無毒，解諸毒藥，止痛，消瘡腫毒，發熱咳嗽， 治人及馬急黃，殺小蟲等作用。 4. 修治、方用及禁忌之考訂 【修治】 圖經本草(20)曰：「八月採根用。」 【方用】 「患蠱毒，密遣人和水研已，禁聲，服少許，不止再服。患禿瘡， 經驗方曰： 以水研傅瘡上。患喉痛，含一片細嚥津。患五種痔，水研服。患齒，含一片於痛 處。患麩豆等瘡，水研服少許。患頭風，搗末油調塗之。患赤白痢，搗末蜜丸， 空心煎水，下二時玩，三服自止。患腹脹滿喘悶，搗末少許，煎水調一盞，差。 患瘡癬，搗末，臘月猪脂調塗之。患頭上白屑，搗末油浸塗；如是孩兒，即乳汁 調半錢。患中宿冷蠱，寸白蟲，每朝空心熱酒調三錢，其蠱自出。患五般急黃， 空心以水調二錢。患蠱風，酒下二錢。患霍亂，橘皮湯下三錢，換熱腫，水研濃 汁塗，乾即更塗。女人換血氣腹脹，以末三錢熱酒下，空心服之。卒患腹痛，水 研半盞，入口，差。蜘蛛咬，唾和服之。狗咬，蚍蜉瘡，蛇咬，並水研傅之；若 大，以水調服二錢(22, 24)。」 李時珍本草綱目曰：「研末湯服五分，治腹脹喘滿。酒服三錢，治女人瀉氣 腹脹。又下寸白諸蟲，丸服止下痢。膜之福，止卒患熱厥心腹痛。五種痔痛，研 汁塗諸熱腫禿瘡，狗蛇蜘蛛傷(27)。」 明倪朱謨本草匯言：「楊清叟方：治喉風急症，牙關緊閉，水谷不下，用山 豆根，白藥子各等分，水煎噙之，咽下二三口，即癒。經惠方：治中蛊毒。用山 豆根，和白湯研服少許，未淨再服。已禁聲音者亦愈；治小兒丹毒赤腫，以山豆 根水摩，擦患處；治女人血氣熱郁成腹脹者。用山豆根，同木香，白湯磨服；治 水蠱腹大有聲，面皮色黑者，用山豆根，同烏藥白湯磨服。備急方：治赤白痢疾。 用山豆根五錢，川黃連二錢，共為末，蜜丸梧子大，每服一錢，白湯下。方脈正 宗：治五般急黃。用山豆根，為末，白湯調服二錢，兼蛊氣者，以酒調下；治熱. - 12 -.
(31) 厥心痛，以山豆根，白湯磨服少許；治小兒五種熱疳，以山豆根為末，每服三分， 白湯調服；治血熱痔痛。用山豆根冷水磨服(28)。 略急方：治霍亂吐痢，山豆根末 7g，橘皮湯下。 治赤目白痢，山豆根末，蜜丸 梧子大，每服 20 丸，空腹服，白湯下。 “治卒換腹痛，山豆根，水研 100ml 服。” “治牙齦腫痛，山豆根 1 片，含於痛處(32)。 【禁忌】苦寒多泄，凡脾胃虛冷者，勿服(28)。大苦大寒，脾胃所惡，食少而瀉 者，切弗沾唇。脾胃虛而大便不實者禁之。 綜合上述，山豆根於八月後採收，暴乾多生用根、水或酒製等。山豆根用於 熱毒蘊結，咽喉或牙齦腫痛，能清熱解毒，而消腫利咽止痛的功能。亦用於皮膚 外傷(33)。主治熱毒上攻，咽喉腫痛，急性咽喉炎，扁桃體炎，牙齦腫痛，肺熱 咳嗽，濕熱黃疸，癰癤腫毒，便秘(34)。因其味苦寒，脾胃虛冷及大便不實者， 勿服。. - 13 -.
(32) 二、山豆根屬（Euchresta BENN.）之藥用植物學考察 （一）中國產山豆根屬（Euchresta BENN.）之藥用植物學考察 豆科（Leguminosae）分布於全球，尤以熱帶地區為多，計有 550 屬，約 13,000 種。中國大陸及台灣入藥者總計 80 屬，約 266 種(35)。全球豆科山豆根屬植物計 有 5 種，品種如下： 1. Euchresta formosana（HAYATA）OHWI 2. E. japonica BENTH. Ex OLIV 3. E. strigillosa C.Y. WU 4. E. horsfieldii（LESCH）BENN. 5. E. tubulosa DUNN 山豆根屬（Euchresta BENN.）之特徵 灌木，蝶形花科。植物特徵為奇數羽狀複葉互生，小葉 3-7 枚，全缘，下面 通常被柔毛或茸毛，側脈常不明顯。總狀花序，花萼膜質，鐘狀或管狀，基部略 呈囊狀，邊緣通常 5 裂，萼齒短；花冠伸出萼外，通常白色，翼瓣和龍骨瓣有瓣 柄；雄蕊 10，兩體（9+1） ，花藥背著；子房有長柄，胚珠 1-2 枚，花柱 1，線形； 莢果核果狀，腫脹，不裂，橢圓形，果殼薄，通常亮黑色，具果頸，有種子 1 枚；種子無種阜，無胚乳，種皮白色，膜質(36-37)。. 山豆根屬種之檢索表(36) 1. 花萼杯狀或鐘狀，長不及 1 cm 2. 小葉通常 3 （5） 枚，花萼杯狀，長 2-5 mm，旗瓣先端不下凹---------------------------------------------------------------------------------------1.山豆根 E. japonica 2. 小葉（3）5-7 枚，花萼斜鐘狀，長約 9 mm，旗瓣先端微凹 3. 小葉 9 枚，橢圓狀披針形或狹橢圓形，先端漸尖-------------------------------------------------------------------------------------------2.台灣山豆根 E. formosana 3.小葉（3）5 枚，通常為倒卵形或寬橢圓形，先端突短漸尖，葉下面被貼 伏茸毛---------------------------------------------------3.伏毛山豆根 E. horsfieldii. - 14 -.
(33) 1. 花萼管狀，長 1 cm 以上，上部較寬，下部狹窄 4.小葉橢圓形或倒卵狀橢圓形，頂生小葉與側生小葉近等大，長 8-10.5 cm，寬 3.5-4.5 cm，花序長約 8 cm---------------------------------------------------------------------------------------------4a.管萼山豆根（原變種）E. tubulosa 4.小葉片倒卵形或橢圓形，頂生小葉較側生小葉大，花序長 14-16cm 5.葉片倒卵形，花萼管下部較長，約 9-10 mm--------------------------------------------------------4b.長序山豆根（變種）E. tubulosa var. longiracemosa 5.葉橢圓形，花萼管下部較短，約 4-5 mm--------------------------------------------------------------------4c.短管山豆根（變種）E. tubulosa var. brevituba 關於中國產山豆根屬植物之形態與分布，據文獻考察(36)如下 ： 1. 山豆根 E. japonica HOOKER ex REGEL 形態：藤狀灌木，幾不分枝，莖上常生不定根。葉僅具小葉 3 枚；葉柄長 4-5.5 cm，被短柔毛，近軸面有一明顯的溝槽；小葉厚紙質，橢圓形，長 8-9.5 cm， 寬 3-5 cm，先端短漸尖至鈍圓，基部寬楔形，上面暗綠色，無毛，乾後呈現皺紋， 下面蒼綠色，被短柔毛；側脈極不明顯；頂生小葉柄長 0.5-1.3 cm，側生小葉柄 無毛。總狀花序長 6-10.5 cm，總花梗長 3-5.5 cm，花梗長 0.5-0.7 cm，均被短柔 毛；小苞片細小，鑽形；花萼杯狀，長 3-5 mm，寬 4-6 mm，內外均被短柔毛， 裂片鈍三角形；花冠白色，旗瓣瓣片長圓形，長 1 cm，寬 2-3 mm，先端鈍圓， 匙形，基部外面疏被短柔毛瓣柄線形，略向後折，長約 2 mm，翼瓣橢圓形，先 端鈍圓，瓣片長 9 mm，寬 2-3 mm，瓣柄捲曲，線形，長約 2.5 mm，寬不及 1 mm， 龍骨瓣上半部黏合，極易分離，瓣片橢圓形，長約 1 cm，寬 3.5 mm，基部有小 耳，瓣柄長約 2 mm；子房扁長圓形或線形，長 5 mm，子房柄長約 4 mm，花柱 長 3 mm，果序長約 8 cm，莢果橢圓形，長 1.2-1.7 cm，寬 1.1 cm，先端鈍圓， 具細尖，黑色，光滑，果梗長 1 cm，果頸長 4 cm，無毛。 分布：產廣西、廣東、四川、湖南、江西、浙江；生長於山谷或山坡密林中， 海拔 800-1350 m，亦分布於日本(36)。 - 15 -.
(34) 2. 台灣山豆根 E. formosana（HAYATA）OHWI 形態：灌木，枝條“之”字形曲折，先端有極細的黃褐色短柔毛。小葉 （3） 5-7 （-9）枚，紙質至膜質，狹橢圓形至橢圓狀披針形，先端漸尖，基部楔形或 鈍；頂生小葉長 9 cm，寬 3.5 cm，小葉柄長 1.2 cm，側生小葉長 6-8 cm，寬 2.5-2.8 cm，小葉柄長 2 mm。總狀花序長 10-15 cm，花密集；總花梗被極短的黃色短柔 毛；花梗長 2-6 mm，苞片小，披針形，長 2 mm；花帶紫白色；萼深鐘狀，長 8 mm，頂端寬 6-7 mm，基部略上呈淺囊狀，兩面有極短的柔毛，萼齒短而鈍；旗 瓣匙形，長 1.5 cm，寬 5.5 cm，頂端二淺裂或微缺，向下漸狹窄，無瓣柄，多少 有點向外彎，基部兩面有短柔毛，翼瓣刀片狀，瓣片半長圓形，長 9 mm，寬 3 mm， 基部有耳，瓣柄線形，長 6 mm，寬不及 1 mm，無毛；龍骨瓣的瓣片長圓形， 長 8 mm，寬 4 mm，頂端鈍，基部有耳，瓣柄線形，長 5.5 mm，寬不及 1 mm； 花絲與龍骨瓣等長，外面基部被短柔毛，花葯短形；子房扁。子房柄長 7 mm， 無毛。莢果卵球形，長 2.2 cm，有光澤，黑色，頂端具細尖，基部有長 1 cm 的 果頸；種子 1 枚。花期 8 月，果期次年 2 月。 分布：產台灣。琉球群島及菲律賓亦有分布(36)。. 3. 伏毛山豆根 E. horsfieldii（LESCHENAULT）BENNET 形態：灌木，高約 45 cm，枝及小枝無毛，有縱細紋。葉具小葉 3-5 枚，葉 柄長 8-12 cm，小葉厚紙質，上面無毛，下面密生貼服茸毛；中脈在上面稍凹下， 下面略突起，側脈約 5-6 對，兩面均不明顯；頂生小葉寬橢圓形或倒卵狀橢圓形， 長 11-17.5 cm，寬 6-8 cm，先端突短漸尖，基部楔形至近圓形，幾無小葉柄。總 狀花序長達 13-21 cm，密生細短貼服毛，總花梗長 10 cm；苞片小，長約 1 mm， 不明顯；花萼寬鐘形，長寬均約 5-6 mm，頂端 5 淺齒，斜，近於平節，有極細 貼服毛；花冠乳白色，長 1.5 cm，下垂，易脫落，旗瓣瓣片長方形，長 1.1 cm， 寬 4 cm，頂端鈍圓，微凹，基部兩側有小耳，折合，向背部反曲，瓣柄長約 5 mm， 寬約 1 mm，向上寬展，翼瓣長方形，長 1 cm，寬 3 mm，頂端鈍圓，基部兩側 - 16 -.
(35) 有小耳，上側較大，上緣黏合，瓣片長 1.1 cm，寬達 4 mm，瓣柄長達 4 mm，寬 不足 1 mm；雄蕊管長 1.4 cm；子房長橢圓形，長約 6 mm，基部漸狹成長約 5 mm 的子房柄，胚珠 1 枚，花柱長約 4 mm，柱頭小，點狀；果橢圓形，長 2 cm，寬 1.3 cm，亮黑色，不裂，果柄長 6-8 mm，果頸長 1.2 cm，兩者間有一關節。 分布：產雲南河口、麻栗坡、馬關。生長於石灰岩山地常綠闊葉林中。海拔 1000-1400 米。印度尼西亞、泰國、越南、不丹，尼伯爾亦有(36)。. 4a. 管萼山豆根（原變種）E. tubulosa DUNN var. tubulosa 形態：灌木，葉具小葉 3-7 枚，葉柄長 6-7 cm，小葉紙質，橢圓形或卵狀橢 圓形，先端短漸尖至鈍，基部楔形至圓形，上面無毛，下面被黃褐色短柔毛，頂 生小葉和側生小葉近等大，長 8-10.5 cm，寬 3.5-4.5 cm，側生小葉柄長約 0.6-1 cm，中脈在上面平或稍凹，下面稍突起，側脈約 5-6 對，不明顯。總狀花序頂生， 長 8 cm，總花梗長 4 cm，花梗長 4 cm，均被黃褐色短柔毛；花長 2-2.2 cm；花 萼管形，下半部狹，長 9 mm，寬 2 mm；基部有小囊，上半部擴展成杯狀，長 6 mm，裂片鈍三角形，長 1-1.5 mm；旗瓣摺合並向背後彎曲，長 1.5 cm，先端鈍 而微凹，上半部寬 5 mm，向下漸狹成瓣柄，最基部寬 2 mm，翼瓣瓣片長圓形， 長 8.5 mm，寬 3.5 mm，先端鈍圓，基部平節，無耳狀突出，瓣片一側直，一側 彎曲，瓣柄於弧曲的一側下延並略彎，長約 7 mm，寬 1 mm，龍骨瓣長圓形， 下部分離，上部黏合，先端鈍圓，瓣片長 7 mm，寬 3 mm，基部有小耳突出， 瓣柄長 6 mm，寬不及 1 mm；雄蕊管長 1.2 cm；子房線形，長 5.5 cm；子房柄長 1.3 cm，花柱線形，長 4 cm，果橢圓形，長 1.5-1.8 cm，寬 8 mm，黑褐色，兩端 鈍圓而先端有一極短的小尖頭，果序長 10 cm，果柄長 5 mm，果頸長 1.4 cm。 花期 5-6（7）月，果期 7-9 月。 分布：產湖北、西北、湖南、四川。海拔 300-1700 m (36, 38)。. 4b. 長序山豆根（變種）（廣西植物）E. tubulosa var. longiracemosa（S. LEE et - 17 -.
(36) H.Q.WEN）CHEN CHEIH 形態：本變種與原變種的區別為：葉具小葉 3-5 枚，葉柄長 7-10.5 cm，小 葉寬橢圓形至倒卵形。先端突短漸尖，頂生小葉長 13.5-14 cm，寬 9-10 cm，小 葉柄長 1-1.5 cm，側生小葉，長 10.5-13 cm，寬 7 cm，基部楔形至寬楔形，小葉 柄長 3-5. mm。總狀花序，長 14-16 cm。花期 4-6 月。. 分布：產廣西。生於石灰岩山坡林中。海拔 1200 m (36)。. 4c. 短萼山豆根（變種）E. tubulosa var. brevituba CHEN CHEIH 形態：本變種與長序山豆根 var. longiracemosa 的區別在於變種花萼管下部 較短，長約 5 mm；與原變種管萼山豆根 var. tubulosa 相比，則花序較長，約為 14.5 cm，花萼管下部亦短。花期 6 月。 分布：產雲南，海拔 750 m (36)。. - 18 -.
(37) （二）台灣產山豆根之藥用植物學考察 豆科（Leguminosae）分布全省，草本，藤本，灌木或喬木。根絕大多數具 根瘤菌。葉單葉或複葉，常為羽狀複葉，一般互生，具葉枕。子房上位，單一心 皮。莢果。臺灣自生及歸化的共有 79 屬。 山豆根屬（Euchresta BENN.）植物，灌木，分布琉球、菲律賓、爪哇、台灣 全境低海拔山地叢林蔽蔭下自生。奇數羽狀複葉，花萼鐘形，歪斜，具 5 萼齒， 花瓣蝶形，兩體雄蕊（9+1） ，莢果卵球形，種子 1 粒。台灣產的豆科山豆根屬植 物，根據台灣植物誌（Flora of Taiwan）(39) 及台灣大學廖日京教授所著之台灣木 本植物學名目錄(40)，所記載只有一種：台灣山豆根（Euchresta formosana（HAYATA） OHWI）又名山豆根、青皮虎、七葉連。。 就上述植物，依據植物學文獻(41-44)以及經著者整理，其植物形態分述於下： 形態：常綠灌木枝綠色而帶光澤。葉互生，具長柄，奇數羽狀複葉，小葉對 生，小葉 7-9 枚，對生，具短柄，葉片革質，長橢圓形或倒長橢圓形，長 5-8 cm， 寬 2-3.5 cm，基部鈍形或楔形，先端漸尖或尖銳，全緣，鮮綠色，光滑無毛。總 狀花序，頂生，被褐色毛。花具梗，萼筒壺形淺綠色，先端淺齒緣，花白色或帶 紫色，旗瓣無瓣柄 ，篦形，先端凹缺，翼瓣與龍骨瓣均呈小刀形。子房有柄。 漿果廣橢圓形，長約 2 cm，初綠熟黑，種子 1 粒，花期 3-5 月。果期 8-12 月。 分布：台灣全境中低海拔山地陰性闊葉林中。. - 19 -.
(38) 三、山豆根之生藥學文獻考察 （一）廣豆根 (Sophora subprostrata) 之生藥學文獻考察 1. 2001年鄭曉敏、楊官娥、鄭佳林為了糾正臨床中醫用藥中山豆根、北豆根、土 豆根的使用混亂現象，對山豆根類生藥品種藥源、成分、藥理作用、臨床應用 進行了比較分析，以資鑑別應用。實驗得知山豆根、北豆根確有抑菌和抗炎作 用,其中山豆根的抑菌作用較强,北豆根的抗炎作用較强；土豆根的抑菌作用最 强,但無抗炎作用。山豆根、北豆根總生物鹼溶液的抑菌、抗炎作用均大於其 水煎劑,说明二者的有效成分均為生物鹼。抗心律失常實驗的结果表明,北豆根 的作用最强,山豆根次之,土豆根較差，急性毒性實驗结果表明,土豆根毒性最强, 山豆根次之,北豆根毒性最小(45)。 2. 2002年賀立京力因山豆根、北豆根為常用中藥，具有清熱解毒、消腫利咽和祛 風止痛的功效。鑒於其功效、用量不盡相同，將山豆根(廣豆根)、北豆根、苦 甘草(西豆根)、木藍根此四種依來源、產地、形狀、大小、表面、質地、斷面、 氣味、顯微特徵及使用情況作了比較，以防止4種藥材相互混用的情形(46)。 3. 2004 年董嘉德、劉寶玲、王廣山針對中華藥典所收載的山豆根、北豆根、防 己科的蝙蝠葛、木藍屬土豆根、毛茛科單葉升麻、紫金牛科百兩金等相關偽品 作了性狀與顯微特徵鑑別(47)。 4. 2005年李京萍、李敏對山豆根與偽品花木藍根依性狀和理化區別方法作了鑑別 比較，防止兩者混用、誤用。兩者雖均為豆科植物，但其性狀鑑別存在較大差 異。由於花木藍根不含苦參鹼、氧化苦參鹼及色素等成分，所以在鑑別中均顯 陽性，極易與山豆根區別(48)。 5. 2006 年張晶、高淑英對山豆根的藥材品種鑑別進行討論，主要針對廣豆根的 植物形態、產地分布、採收加工、藥材鑑別方面詳細記錄並就其偽品及易混品 北豆根、木藍根、胡枝子根、滇豆根、西豆根等藥材也作了性狀比較與討論(49)。 6. 2007 年林苗、李春等對山豆根及其混淆品朱砂根的鑑別研究，分別採用性狀、. - 20 -.
(39) 顯微及理化鑑定等進行鑑別，並比較兩者成分、藥理、功效及主治等方面。結 果兩者的性狀、顯微及理化鑑定均有明顯區別，成分、藥理、功效及主治也有 很大的差異。兩者可利用常用的中藥鑑定方法來區別，且其所含成分不同、功 用也不同，不能混用(50)。. - 21 -.
(40) （二）台灣山豆根 (Euchresta formosana) 之生藥學文獻考察 1. 1970 年賴榮祥教授將山豆根分成中國之部、日本之部、台灣之部等三部分去 探討山豆根的基原：而得到的結果實際出現在中國市場上的有廣豆根蝙蝠葛 根和木蘭根等三種類；另外根據當時 1966-1968 年與東丈夫教授進行山豆根 的生藥學研究，並發現在日本市場品記載為 Euchresta japonica 的學名，其正 確的基原應為 Sophora subprostrata CHUN et. T. CHEN；而在台灣全省包括澎湖 縣的中草藥店進行市場品的調查，直至 2001 年 6 月市場上所用的山豆根只有 廣豆根一種而已，部分地區有偽品崗脂麻根。綜合以上所述，以廣豆根的市 場佔有率較高(51)。 2. 1996 年蔡敏鈴針對台灣市售山豆根類藥材做了相關的生藥學研究，結果發現 台灣市售之山豆根類藥材為廣豆根 Sophora subprostrata CHUN et. T. CHEN，亦 即越南槐之乾燥根；台灣山豆根則為植物 Euchresta formosana（HAYATA ） OHWI；但台灣民間亦將多種植物誤當山豆根使用，如嘉義一帶有以崗脂麻代 替廣豆根(52)。 3. 1996 年陳忠川教授在行政院衛生署中醫藥委員會進行中藥材之鑑定研究。其 目的在於辨明中藥之真偽與來源植物，利用顯微鏡鏡檢解剖藥材，觀察其內部構 造，粉末特徵，照相製圖，敘述各藥材之內部，粉末組織之內容，並就市售中藥 之來源植物，進行實際調查採集，綜合各方面之鑑定，以作為各種藥材之標準品， 提供中藥 GMP 之檢驗標準。他又發現本省所產與進口山豆根藥材均用代用品與 偽藥。故在其研究成果中完成了 50 種藥材，其中包括台灣山豆根之組織描述及 組織圖、粉末構造，以期樹立未來中藥材 GMP 之檢驗及標準依據，確定藥材使 用時之真偽並確保療效(53)。. - 22 -.
(41) 四、山豆根之藥理學文獻考察 （一）廣豆根 (S. subprostrata) 之藥理作用 1. 抗腫瘤作用(antitumor activity) 山豆根水提取物給小鼠 I.P，對子宮頸癌 U14 有抑制作用；I.P 對大鼠腹水型 專用肉瘤及實體腹水肝癌治癒率在 60%以上，並延緩腹水形成及延長生命。 從山豆根中分離出來的苦參鹼，對小鼠艾氏腹水癌無論試管試驗或離體試驗 都有效，氧化苦參鹼則無效，對少數肉瘤 180 則都有效。山豆根中所含的紫 檀素類，槐樹素對肉瘤-180 也有抑制作用(54)。 2. 抗病毒作用(antivral activity) 利用 472 種中草藥的水和酒精萃取物，針對 Type Ι HSV 病毒作一系列的試 驗，發現山豆根具有抗病毒的效果(55)。 3. 抗心率不整作用 山豆根總鹼有抗實驗性心率不整作用，經分析總鹼中主要含氧化苦參鹼，氧 化苦參鹼在離體心肌標本上，有增強收縮力的作用；減緩心率自動節率；對 腎上腺素誘發心房自率活動有拮抗作用；不影響心肌興奮性；苦參鹼作用相 似，具有正性肌力和負性頻率作用。中毒量則降低心肌的收縮力與興奮性(56)。 4. 抗潰瘍作用(antiiuler activity) 有抑制胃液分泌作用，對於實驗性潰瘍(幽門結紮潰瘍,醋酸潰瘍)的大白鼠， 口服給藥對潰瘍組織有明顯的修復作用(57)。 5. 抑菌作用(antibacterial activity) 利用具有治療感染性疾病的 18 種中藥來偵測對 10 種微生物造成的病因是否 具有體外抑菌的活性，結果顯示山豆根也具有抗菌效果(58)。 6. 突變活性（mutagenic activity） 利用 rec-assays 將商業上常用的 104 種粗抽物，結果顯示其中的 45 種包括山 豆根具有誘導有機體突變的活性(59)。 7. 腎上腺性受器抑制作用（adrenergic receptor blocker） 利用傳統中藥來做活性測試篩選，並分離出活性成分，結果顯示山豆根具有 腎上腺性受器抑制作用(60)。 8. 抗有絲分裂活性（antimitogenic activity） - 23 -.
(42) 針對茵蔯蒿、深綠卷柏、白朮、廣豆根（山豆根）4 種藥材，之前已證明具有 抗腫瘤的效果，其中茵蔯蒿是直接破壞癌細胞的作用；其他 3 種則是與免疫 力的增加及抗有絲分裂活性來達到抗癌作用(61)。 9. 抗牛皮癬作用（psoriasis treatment） 臨床研究裡證明山豆根具有抗牛皮癬作用(62)。 10. 抑制血小板形成作用（plaque formation suppressant） 在傳統的中藥裡，其中包括山豆根具有抑制血小板凝集的作用(63)。 11. 誘發腫瘤壞死（tumor necrosing factor induction） 茵蔯蒿、深綠卷柏、白朮、廣豆根（山豆根）4 種藥材，在免疫學抗癌方面 可誘導出 Tumor necrosis factor (TNF) 的產生，因此這些粗抽物的抗癌機制可 能是誘導內在的 TNF 所啟動的(64)。 12. 解熱活性（hypothermic activity） 利用廣豆根（山豆根）的根部來做老鼠體溫調節試驗，結果發現其具有解熱 的活性(65)。. - 24 -.
(43) （二）台灣山豆根 (E. formosana) 之藥理作用 1. 2003年羅文利發現在部分isoflavones 類化合物呈現明顯對arachidonic acid （AA）及collagen 所誘發的血小板凝集的抑制作用；其他類化合物則無明 顯的作用。和抗HIV活性研究方面，化合物euchretin M、formosanatin C、 flemiphyllin 顯示具有抑制HIV 病毒在H9淋巴結中的複製。其EC50值： <0.1、<0.1、<0.627 μg/ml，其治療指數（TI）：>2.22、>2.18、> 0.39(16)。 2. 2002年羅文利在抗癌活性研究方面，化合物 euchretin A、J、M顯示對人 類肝癌細胞 59T 有細胞毒殺作用（10 μg/ml，癌細胞存活率 48.0%、 12.5%、28.5%）；而化合物 euchretin J 對胃腺癌細胞 SCM-1 有細胞毒 殺作用（10 μg/ml，癌細胞存活率 47.0%）(17)。 3. 1996年蔡敏鈴針對台灣山豆根類藥材共六種藥材分別是市場品廣豆根、及 台灣山豆根根部、台灣山豆根莖部、崗脂麻、樹豆、蔓草蟲豆之甲醇粗抽 物做了藥理學研究，結果發現在急性毒性試驗裡（g/kg）得知小鼠的LD50 分別為2.21、0.49、1.06、2.54、3.56、3.45；另外在鎮痛試驗中，五種 藥材均有作用，其中以台灣山豆根的效果最好；細胞毒性方面，以崗脂麻 抑制活性最強，對人類喉癌細胞及老鼠血癌細胞皆有最強的抑制作用；在 抗菌試驗中，以台灣山豆根的莖部有較強的抑菌作用(52)。 4. 台灣山豆根的水和酒精粗抽物具有解熱效果(66)。 5. 在老鼠實驗中處於低溫（22℃）及高溫（30℃）的狀態下，觀察給藥後的 老鼠反應；結果得知台灣山豆根在體溫調節方面具有代謝，呼吸和血管運 動活性的作用(67)。. - 25 -.
(44) 五、山豆根之成分文獻考察 （一）廣豆根 (S. subprostrata) 之成分文獻考察 1. 建立山豆根苦參鹼含量的測定方法。關於苦參鹼的測定方法有中和法、比色 法、螢光猝滅法、氣相色譜法、薄層掃描法、高效毛細管電泳法和高效液相 色譜法等，筆者在文獻的基礎上，經過篩選，採用苯基柱，以甲醇：水：三 乙胺(50：50：0.05 ,v/ v) 作為流動相，對山豆根中苦參鹼進行了測定,獲得滿 意的效果。該方法簡單、快速、重複性好，可用於生藥及其它製劑分析(68)。 2. 利用多種柱層析方法,從山豆根中分得5 個化合物。經過理化及波譜分析,分別 鑑定為L-maackiain (1)，trifolirhizin (2)，quercetin (3)，rutin (4) and isorhamnetin3-rutinoside (5)。其中化合物3、5 為首次從該植物中分離得到(69)。 3. 採用兩種不同方法測定山豆根中總堿含量,結果基本一致。容量法測定結果重 現性好,精密度高,該法實驗條件簡單,一般實驗室均可操作,但操作較繁。酸性 染料比色法靈敏度高,取樣量少,操作簡便,但易受許多因素影響,故要求取樣準 確,操作過程儘量平衡,測定溫度保持在20～25℃之間為宜(70)。 4. 山豆根中含抽提出生物鹼、多糖、黃酮有柔枝槐酮、柔枝槐素、柔枝槐酮色 烯、紫檀素、染料木素、山槐素、谷甾醇等成分，有抑瘤、抑菌、消炎、鎮 痛、免疫調節等生理活性(71)。. - 26 -.
(45) （二）台灣山豆根 (E. formosana) 之成分文獻考察 1. 1989年Mizuno, M.等學者從台灣山豆根莖部分離出coumaronochromones 類的 化合物：euchretin A、B、C (72)。 2. 1989年Mizuno, M.等學者從台灣山豆根根部分離出 flavanones 類化合物 euchrenone a5、a6，euchrestaflavanone A、B、C，xambioona；pterocarpans類 化合物maackiain (73)。 3.. 1991年Mizuno, M.等學者從台灣山豆根根部分離出coumaronochromones 類 化合物：euchretin D、E；和 flavanones 類 euchrenone a11、a12 (74)。. 4. 1995年Matsuura, N等學者從台灣山豆根根部分離出flavanones 類化合物 euchrenone a10，lupinifolin，sophoranochromene (75)。 5.. 2002年羅文利以台灣山豆根分離了並確定其結構有9個compounds，其中包括 6 個 coumaronochromones ， 有 formosanatin A (1) ， formosanatin B (2) ， formosanatin C (3)，formosanatin D (4)，euchretin E，和euchretin G；2個 flavonones，euchrenone a16 (5)，euchrestaflavanone A (6)；1個isoflavone， daidzein。對於這些化合物 (1)－(5) 是為新compounds，而 euchrestaflavanone A 和 daidzein則為第一次從這個屬種裡分離出來的. (76). 。. 從前人研究台灣山豆根植物 Euchresta formosana (HAYATA) OHWI之根部分離得 到的化合物並確定其結構整理如表二。 表二、台灣山豆根的根部成分研究. (77). 1.. 18個 coumaronochromone. euchretin A-N、 formosanatin A-D. 2.. 2個 isoflavone 類化合物. formononetin, retusin 8-methylether. 3.. 1個 flavonol 類化合物. quercetin. 4.. 9個 flavanone 類化合物. euchrestaflavanone. A-C 、 glabrol 、. euchrenone a1-a2 、 euchrenone a11 、 euchrenone a16-a17 5.. 2個 pterocarpan 類化合物. maackiain、trifolirhizin - 27 -.
(46) 6.. 2個 lupin 生物鹼化合物. 7.. 1 個 cyclohex-2-en-1-one 類 化 合 blumenol A. （-）-cytisine、（+）-matrine. 物 8.. 3個 benzenoid 類化合物. vanillin 、 p-hydroxybenzoic acid 、 3（ 4-hydroxy-3-methoxyphenyl ） -acrylic acid octadecyl ester. 9.. 1個 coumestan 類化合物. medicagol. 10. 1個 lignan 類化合物. （+）-syringaresinol. 11. 4個 steroid 類化合物. β-sitosteryl. D-glucoside 、 stigmasteryl. D-glucoside、β-sitosterol、stigmasterol. - 28 -.
(47) 第二節 細胞週期及相關調控分子之影響 一、細胞週期（Cell Cycle）：(78, 79) 一個細胞分裂增殖成兩個細胞，中間受到許多分子調控複製程序的進行，這 期間我們稱之為細胞週期，整個週期可被分為兩大時期–interphase（包含 G1、S、 G2 phase）及 M phase，而在這過程當中，則會有三個 checkpoints 來決定細胞週 期是否能進入至下一時期： G0 phase：又稱 senescence 或 quiescence，為細胞靜止期，經由某些分子的 刺激，可進行分化或進入 G1 期。 G1 phase：G 意指為 Gap，處於 M 期及 S 期的中間時期，細胞會複製本身 胞器與蛋白質，增大自體體積，準備進入 S 期，此期間可長達數 小時至數天之久，此期細胞開始生長，同時產生 RNA 及合成蛋 白質，複製胞器，細胞體積增加，目的是為 DNA 複製做好準備， 此時期染色體數目為 2N。由 G1 要進入 S 期為第一個 checkpoint。 S phase：S 意指 Synthesis，此期細胞進行的是 DNA 的複製工作，需 10 至 12 小時的時間，染色體數目介於 2N~4N 之間。 G2 phase：為 S 期與 mitosis 的中間時期，為進入 M 期作準備，此時在細胞 核內的的 DNA 含量由 G1 phase 的 2N 變成 4N。。而要由 S 進入 到 M 期為第二個 checkpoint。 M phase：M 意指 Mitosis，為細胞週期最短的一期，進行細胞核與細胞質的 分裂，又可細分為數個時期，如下： Prophase：核內複製完的染色體進行濃縮，胞質中 mitotic spindle 進行組裝，兩個 centrosome 分別移向兩側。 Prometaphase：centrosome 移至 spindle pole 處，核膜破裂，染色 體藉由 kinetochores 附著到 spindle microtubules 上，並開始移動。 - 29 -.
(48) Metaphase：染色體排列於 spindle pole 中間的赤道板上，準備進 行分裂。此時為第三個 checkpoint。 Anaphase ： 複 製 完 的 染 色 體 進 行 分 裂 成 兩 子 染 色 體 ， 此 時 kinetochore microtubules 開始縮短，spindle pole 往外 側移動。 Telophase：分裂完的子染色體移至 spindle pole 處，染色體開始 decondense，新的核膜及細胞質中 contractile ring 開 始形成 Cytokinesis：核膜形成完全，細胞質分裂為二，細胞準備重新回 到 interphase。 當 DNA damage 時，cell cycle 無法通過 check point 而停滯（arrest） ，此時細 胞會進行 DNA 修復（DNA repair） ，一旦修補完成時才能進入下一期，若是發現 無法彌補的錯誤時，細胞就會選擇走向細胞凋亡（Apoptosis）路徑，以避免錯誤 遺傳至下一代(80)。. - 30 -.
(49) 二、細胞週期相關調控分子 （一）Cyclins and CDKs 調控細胞週期的進行主要為 Cyclins 與 CDKs（cyclin-dependent kinases）兩 大家族，單獨的 CDKs 並無磷酸化其下游分子的能力，必須當 CDKs 與 Cyclins 結合形成複合體時，CDKs 才具有蛋白質激酶的活性，即可磷酸化下游分子；CDKI 主要可分為兩大家族—CIP/KIP 家族與 INK4（Inhibitor of CDK4）家族。CIP/KIP 家族，包括了 p21CIP/WAF1/sdi1、p27KIP1 以及 p57KIP2；INK4 家族則有 p15INK4a、 p16INK4b、p18INK4c、p19INK4d(81)。 在細胞週期的四個時期中，都有特定促使每一時期進行的 Cyclin-CDK complexes，G1 期有 Cyclin D-CDK4/6 complexes 以及 Cyclin E-CDK2 complexes， S 期有 Cyclin A-CDK2 complexes，G2 期有 Cyclin B-CDK1 complexes。列表如下： 表三、four classes of Cyclins and CDKs in mammalian cell cycle(82 - 84) Cell-cycle stages. Cyclins. CDKs. Early G0/Mid G1 phase. Cyclin D1,D2,D3. CDK4﹐CDK6. Late G1 phase. Cyclin E. CDK2. S phase. Cyclin A. CDK2. M phase. Cyclin B. CDK1（cdc2）. 然而，就算 CDKs 與 Cyclins 結合在一起並不能代表一定就有活性，當 CDKs 某些位置上被加上磷酸根時，有可能會使其失活性，例如在 Tyr15 的位置被 Wee1 kinase 磷酸化時，就會使 CDKs 失活性，相反的，在相同位置 Cdc25 phosphatase 解磷酸化時，會使得 CDKs 又恢復活性；另外，在 Thr14 如被 Myt1 加上磷酸根， 同樣會使 CDKs 失活性，而在 Thr161 位置由 CAK（cyclin H/CDK7 complex）加 上磷酸根的話，可使得 CDKs 為活性形態，因此我們可以了解到，當 CDKs 上的 Thr14 和 Tyr15 有一者或兩者均被加上磷酸根時，CDKs 活性是被抑制的，而. - 31 -.
(50) Thr161 單獨被磷酸化，CDKs 才具活性(85)。 另一方面，Cyclins 的表現量是隨著細胞週期而有所變化的，在 G2 期表現的 cyclin B 如果在進入 mitosis 的晚期時，若沒有被 anaphase-promoting complex （APC）進行 ubiquitylation 而分解，則會使 mitosis 停止於 anaphase；而在 G1/S transition 時的 cyclin E 如果大量表現，因為要進入到 S 期需要 CDK2 與 cyclin A 的結合，但大量的 cyclin E 把 CDK2 都抓住了，因此便無法進入到 S 期(86)。. （二）CDK inhibitors CDK inhibitors 顧名思義就是抑制 CDK 活性的分子，CDKIs 主要可分為兩大家 族–CIP/KIP 家族與 INK4（means Inhibitors of CDK4）家族，CIP/KIP 家族成員有 p21CIP1/WAF1/sdi1、p27KIP1 及 p57KIP2；INK 家族則有 p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c 和 p19INK4d(81)。 一般而言，CIP/KIP 家族中的 p57KIP2 主要是跟細胞的分化比較相關，而 p21CIP1/WAF1/sdi1 與 p27KIP1 對於所有的 cyclin-CDK complexes 均有抑制作用(87)，它 們會形成 cyclin-CDK-CDKI 型式的三元體，藉由遮蔽掉 CDKs 的 catalytic site， 使不能與下游分子反應，進而抑制了細胞週期的進行(88)。 另一方面，INK 家族則對於 G1 期的 CDK4 與 CDK6 具有選擇性的抑制作用，它 們的結構上含有 ankyrin repeat domains(89)，會與 cyclin D 競爭 CDK4 跟 CDK6 的 結合區域，使 cyclin D 無法與 CDK4 跟 CDK6 形成有活性的 complex，而使的細 胞週期停滯於 G1 早至中期(90)。. - 32 -.
(51) 圖二、細胞週期的調節(91). （三）pRb and E2F families pRb （ retinoblastoma protein, also called pocket protein ） 家 族 有 pRb1/p110、pRb2/p130 與 p170 三者，E2F（early gene 2 factor）家族則有 E2F-1. 到 E2F-6(92)， E2F 本身為 transcription factor，平時與 Rb protein 結合的時 候是沒有活性的，但當 Rb protein 被上游的 cyclin/CDK complexes 磷酸化 時，就會與 E2F 脫離，使 E2F 具活性。一般來說，Rb protein 本身有 16 個位置可能會被加上磷酸根，而 cyclin/CDK complexes 主要會去磷酸化 Rb protein C-terminal 的位置，比如說 cyclin D/CDK4 complex 會去磷酸化 Rb protein 在 Ser780、Ser795 與 Thr826 的位置(93)。一般認為，E2F-1,-2,-3 則作 用於 late G1 跟 S 期，為 transcription activators，E2F-4,-5 與 pRb2/p130 以及 E2F-6 和 pRb 較無相關，主要與 PcG 的結合是在 G0 與 early G1 期時，是扮演 transcription repressors 的角色(94)。 - 33 -.
(52) 近年來的研究發現，受到 E2Fs 家族調控的分子相當的多，除了調控細胞週 期進入 S 期的分子，如 cyclin E、cyclin A、c-Myb 和 CDK2 外；尚有與 DNA 合 成相關的，如 ORC protein、MCMs（mini chromosome maintenance proteins） 、 Cdc6、ribonucleotide reductase、thymidine synthase 與 DNA polymerase α 以及與 DNA 修復相關的分子，如 msh2 和 mih1（mismatch repair gene） ﹐Fanconi anemia 和 rpa3 （excision repair） 與 rad51、recQ1 和 rad54（double-strand break recombination repair） ；另外對於 mitosis 與 DNA-damage checkpoint、apoptosis 相關的分子，如 cyclin B、cdc2、Mad2、chk1、caspase-3 和 APAF-1，都會受到 E2Fs 家族的調控 (94). 。 因此，就最近的研究文獻報導，顯示 pRb 與 E2Fs 家族的分子，對於細胞的. 影響不僅調控細胞週期，並且可能參與細胞分化與死亡的調控。. 圖三、Rb protein 與 E2F-1 (91). - 34 -.
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