結晶三大步驟的實驗方法

首先，要製備好單水草酸鈣晶種待用。然後依照結晶三大步驟的實 驗方法操作，包括結晶成核、結晶成長和結晶聚集 [48]。

一、製備草酸鈣晶種

將 100 ml 的 0.25 M 草酸鉀溶液緩緩加入到 100 ml 的 0.25 M 的氯 化鈣溶液中，不停的攪拌，將溶液溫度維持在 85 ^oC，調整此溶液的 pH 值降至 4.0 為止，可以利用 HCL 和 NaOH 滴定至適當 PH 值。之後再攪拌 8 小時，然後靜置整夜。靜置後，把上清酸液緩緩倒掉，再加入去離子 水清洗這些晶種，洗到此上清液的 pH 值升至 6.5 為止。製備好之晶種 用紅外線光譜儀檢查確定為單水草酸鈣。

二、結晶成核的抑制實驗

1.對照組：

先分別配好 100 ml 的 8.5 mM 氯化鈣溶液（內含 200 mM 的氯化鈉 和 10 mM 的醋酸鈉，pH 5.7 的緩衝溶液）和 100 ml 的 1 mM 草酸鉀溶液

（內含 200 mM 的氯化鈉和 10 mM 的醋酸鈉，pH 5.7 的緩衝溶液）。在使 用前先用 0.22 μm 的 Millex-GV 膜過濾此兩溶液，以去除會影響實驗 的大分子。

取 1 ml 的 8.5 mM 的氯化鈣溶液加入塑膠比色管中，控制環境在 37

℃，500 rpm 下，再加入 0.1 ml 的去離子水，最後再加入 1 ml 的 1 mM 的草酸鉀溶液，使其均勻的混合，至終濃度為 4.0 mM 以上的鈣離子和 0.47 mM 以上的草酸根離子，用 620 nm 的光源測此混合液的吸光值，測 10 分鐘，每 10 秒測一次 [49]。實驗均進行三次，取平均值為統計之用。

2.實驗組：

取 1 ml 的 8.5 mM 的氯化鈣溶液加入塑膠比色管中，控制環境在 37

℃，500 rpm 下，再加入 0.1 ml 的五苓散萃取液，最後再加入 1 ml 的 1 mM 的草酸鉀溶液，用 620 nm 的光源測此混合液的吸光值，測 10 分 鐘，每 10 秒測一次。實驗均進行三次，取平均值為統計之用。

草酸鈣晶體成核活性抑制的計算方式如下：

比較對照組與各實驗組的誘導時間（Induction time，Ti）。 Ti 相當於加入草酸鉀溶液直到產生草酸鈣晶核的數量和大小可被分光光

度計測量到的一段時間。Ti 是實驗組吸光值改變量到達對照組最高吸光值

改變量的 2.5 % 時所需要的時間。

三、結晶成長的抑制實驗

1.對照組：

將之前製備好的單水草酸鈣晶種取出使用，將其懸浮在內含 200 mM 的氯化鈉和 10 mM 的醋酸鈉的緩衝溶液中（pH 5.7）；晶體濃度為 1.5 mg/ml。使用前，利用超音波振盪 30 分鐘，取出後搖晃混合均勻使用。

再把此 3 ml 的單水草酸鈣晶體混合液，加至 27 ml 超穩定

(metastable)的草酸鈣溶液中；此超穩定溶液中有 0.833 mM 氯化鈣及 0.167 mM 的草酸鈉，俾使晶種的最終濃度維持在 0.15 mg/ml 以上[50]。

然後取出 2 ml 的晶體生長反應溶液，加入 0.1 ml 的去離子水，溫 度維持在 37 ^oC，讓其反應 40 分鐘。反應後，讓溶液通過 0.22 μm 孔 隙的過濾膜，去掉晶體，濾液加入石英比色管中，再用 214 nm 的光源 測此澄清液的吸光值，每 10 秒測一次 [51]。實驗均進行三次，取平均 值為統計之用。

2.實驗組：

加入 0.1 ml 的五苓散萃取液至 2 ml 的晶體生長反應溶液，溫度維 持在 37 ^oC，讓其反應 40 分鐘。反應後，讓溶液通過 0.22 μm 孔隙的 過濾膜，去掉晶體，濾液加入石英比色管中，再用 214 nm 的光源測此 澄清液的吸光值，每 10 秒測一次。實驗均進行三次，取平均值為統計

之用。

草酸鈣晶體成長活性抑制的計算方式如下：

抑制百分比(%) = Ao-Ai/Ao × 100 %

Ao 是 400 秒時對照組的吸光值變化，Ai 代表加入五苓散萃取液時的吸 光值變化。

四、結晶聚集的抑制實驗：

1. 對照組：

將之前製備好的單水草酸鈣晶種取出使用，將其懸浮在內含 200 mM 的氯化鈉和 10 mM 的醋酸鈉的緩衝溶液中（pH 5.7），晶體濃度約 0.8 mg/ml。再將此一懸浮液混合均勻，放在超音波下震盪 60 分鐘，並放置 在 37 ℃ 下至隔天。

要使用之前，須要再一次檢查 pH 值，並放在超音波下再震盪 30 分 鐘。然後取出混合均勻的懸浮液 20 ml，再加入 1.0 ml 的去離子水，以 20：1 的比例混合，讓混合液在 37 ℃，60 rpm 下，搖動 2 個小時。

2 個小時後，再把此溶液混合均勻，快速的取出 2 ml 至塑膠比色管 中，再放入分光光度計中，一開始條件控制在 1100 rpm，37 ℃ 下，用 620 nm 的光源測至吸光值穩定經過 10 秒之後，再把條件控制在 500 rpm、37 ℃ 下，用 620 nm 的光源測溶液吸光值經過 180 秒，然後停止 攪拌，使單水草酸鈣晶體發生自發性的沉澱，用 620 nm 的光源測溶液 吸光值經過 300 秒，吸光值每 10 秒測一次 [52]。實驗均進行三次，取 平均值為統計之用。

2.實驗組：

要使用 0.8 mg/ml 單水草酸鈣晶體懸浮液之前，須要再一次檢查 pH 值，並放在超音波下再震盪 30 分鐘。然後取出混合均勻的懸浮液 20 ml，

再加入 1.0 ml 的五苓散萃取液，以 20：1 的比例混合，讓混合液在 37 ℃，

60 rpm 下，搖動 2 個小時。

2 個小時後，再把此溶液混合均勻，快速的取出 2 ml 至塑膠比色管 中，再放入分光光度計中，一開始條件控制在 1100 rpm，37 ℃ 下，用 620 nm 的光源測至吸光值穩定經過 10 秒之後，再把條件控制在 500 rpm、37 ℃ 下，用 620 nm 的光源測溶液吸光值經過 180 秒，然後停止 攪拌，使單水草酸鈣晶體發生自發性的沉澱，用 620 nm 的光源測溶液 吸光值經過 300 秒，吸光值每 10 秒測一次。實驗均進行三次，取平均 值為統計之用。

草酸鈣晶體聚集活性抑制的計算方法如下：

抑制百分比(%) = (S0-St/S0) × 100 %

S0 是對照組的吸光值下降斜率，St 是有加五苓散萃取液的吸光值下降 斜率。

第六節、動物實驗的步驟

動物實驗分成兩大組來進行，第一大組飼養三週，第二大組飼養四 週。所有組別都以加入 0.75 % 乙二醇（ethylene glycol，EG）的食用 水和正常的飼料來餵養 [53]。

第一大組：飼養三週

第一大組使用 12 隻雄性 Sprague-Dawley 品系的大白鼠，體重大約 為 320 g。以隨機分組的方式分成四個小組，飼養三週。

第一小組（Group 3.1）為對照組，以 0.75 % 乙二醇加入食用水中 餵養，沒有任何的中藥治療。

第二小組（Group 3.2）為低劑量治療組，除了以 0.75 % 乙二醇加 入食用水中餵養外，每天用胃管灌食五苓散萃取液（濃度 80 mg/ml）1.5 ml 一次。

第三小組（Group 3.3）為中劑量治療組，除了以 0.75 % 乙二醇加

入食用水中餵養外，每天用胃管灌食五苓散萃取液（濃度 80 mg/ml）3.0 ml 一次。

第四小組（Group 3.4）為高劑量治療組，除了以 0.75 % 乙二醇加 入食用水中餵養外，每天用胃管灌食五苓散萃取液（濃度 80 mg/ml）4.5 ml 一次。

Group 3.2、Group 3.3、Group 3.4 的平均劑量各別為 375 mg/kg、

750 mg/kg、1125 mg/kg。

第二大組：飼養四週

第二大組使用 12 隻雄性 Sprague-Dawley 品系的大白鼠，體種大約 320 g。以隨機分組的方式分成四個小組，飼養四週。

第一小組（Group 4.1）為對照組，以 0.75 % 乙二醇加入食用水中 餵養，沒有任何的中藥治療。

第二小組（Group 4.2）為低劑量治療組，除了以0.75 % 乙二醇加 入食用水中餵養外，每天用胃管灌食五苓散萃取液（濃度80 mg/ml）1.5 ml一次。

第三小組（Group 4.3）為中劑量治療組，除了以0.75 % 乙二醇加 入食用水中餵養外，每天用胃管灌食五苓散萃取液（濃度80 mg/ml）3.0 ml一次。

第四小組（Group 4.4）為高劑量治療組，除了以0.75 % 乙二醇加 入食用水中餵養外，每天用胃管灌食五苓散萃取液（濃度80 mg/ml）4.5 ml一次。

Group 4.2、Group 4.3、Group 4.4 的平均劑量各別為 375 mg/kg、

750 mg/kg、1125 mg/kg。

飼養期間終止後，所有大白鼠用 isoflurane 麻醉，以空氣注射心 臟致死，然後解剖取出兩側腎臟。雙腎以福馬林（formalin）固定後，

再以石蠟（paraffin）包埋，用 eosin solution 染色製成切片。鼠腎 切片以光學顯微鏡和偏光顯微鏡分別觀察。

以偏光顯微鏡評估鼠腎切片

如同Nelde所述 [54]，在偏光顯微鏡 100倍下觀察鼠腎切片，所發 現的草酸鈣結晶沉積以半定量的方式分成四種等級(-, +, ++, +++)(附 錄一)，分別是從“沒有結晶沉積＂到“大量的結晶沉積＂。四種等級 再分別給予分數（0, 1, 2, 3）來表示，這分數稱為「結晶沉積指數」

（crystal deposition index）。

評估時，每隻大鼠選取一邊的鼠腎切片，在皮質（cortex）處隨機選取 10個視野（field），每個視野給予一個結晶沉積指數。