3-1 ARB8-2 細胞株會表現星狀神經膠細胞之標記
Figure 1 為 GFAP 抗體分別對 ARB8-2 細胞株進行細胞螢光免疫
染色及 Western blot 分析。Fig. 1(a)為 ARB8-2 細胞株萃取之蛋白質經 SDS page 電泳並轉印後使用 GFAP monoclonal antibody 做 Western blot，顯示在分子量 100 kD 及 50 kD 各有一條 band。ARB8-2 細胞株 以 GFAP monoclonal antibody 做細胞螢光免疫染色之結果顯示於 Fig.
1(b)，結果顯示在細胞質的位置可以產生免疫反應，被染色的細胞外 型與纖維狀的星狀神經膠細胞相似。
ARB8-2 細胞株使用 vimentin monoclonal antibody 做 Western blot 分 析之結果顯示於 Fig. 2(a)，在 60 kD 各有一條 band。Fig. 2(b)為 vimentin monoclonal antibody 對 ARB8-2 細胞株進行細胞螢光免疫染 色。結果顯示在細胞質的位置可以產生免疫反應，且蛋白質之表現 量較 GFAP 多，被染色的細胞呈現細長纖維狀的外型，符合 vimentin 中間絲蛋白之特性。Fig. 3 為 GS monoclonal antibody 對 ARB8-2 細 胞株進行細胞螢光免疫染色分析，顯示在細胞質的位置可以產生免 疫反應且呈現纖維狀。Fig. 4 為從 ARB8-2 細胞株萃取之 total RNA 與 18SrRNA primer 進行 PCR 後跑電泳所得到的電泳圖，
Fig. 1.以 GFAP 抗體對 ARB8-2 細胞株進行分析，(a) Western blot (50 kD)及(b) 細胞螢光免疫染色，細胞核使用 DAPI 染色(藍色區域)，Bar=
20 μm。結果顯示在 50 及 100 kD 各有一條 band，免疫染色後外型呈 現纖維狀。
(a)
(b)
Fig. 2.以 Vimentin 抗體對 ARB8-2 細胞株進行分析，(a) Western blot (60 kD)及(b) 細胞螢光免疫染色，細胞核使用 DAPI 染色(藍色區域)，
Bar= 20 μm。結果顯示在 60 kD 有一條 band，免疫染色後外型呈現 纖維狀。
(a)
(b)
Fig. 3.以 GS 抗體對 ARB8-2 細胞株進行細胞螢光免疫染色，圖中顯 示細胞質的位置可以產生免疫反應且呈現纖維狀，細胞核使用 DAPI 染色(藍色區域)，Bar= 20 μm。
Fig. 4. ARB8-2 之 total RNA 與 18SrRNA primer 做 PCR 後之電泳分 析，結果顯示並沒有 band 產生，證明 total RNA 中未殘留 genomic DNA 。
M
顯示萃取過後的 total RNA 並未有 genomic DNA 汙染(contamination)。
另外 ARB8-2 細胞株會表現 GS 之 mRNA，此結果顯示於 Fig. 5。經 過定序後至 NCBI 的 GenBank 進行 blast，得知與已發表的斑馬擬麗 魚 (Maylandia zebra)之 glutamine synthetase (XM005721347.1)有 100
%的相似性，GS 的定序結果顯示於 Fig. 6。
3-2 ARB8-2 細胞株具有神經前驅細胞之特性
Figure 7 為 Nestin polyclonal antibody 對 ARB8-2 細胞株進行細胞 螢光免疫染色分析，顯示 nestin 表現於細胞質的位置。另外 ARB8-2 細胞株會表現 nestin 之 mRNA，此結果顯示於 Fig. 5。經過定序後至 NCBI 的 GenBank 進行 blast，得知與已發表的斑馬擬麗魚之 nestin (XM004560123.1)有 97 %的相似性，nestin 之定序結果顯示於 Fig. 8。
另外 ARB8-2 亦會表現 BLBP (brain lipid binding protein)之蛋白質，此 結果顯示於 Fig. 9。 麗魚之 connexin 43 (XM004564742.1)有 99 %的相似性，Cx43 定序結
Fig. 5. ARB8-2 之 cDNA 與多種 primer 做 PCR 後之電泳分析，GS (115 bp)、nestin (309 bp)、Cx43 (197 bp)及 nAChRs (453 bp)。C 表示 negative control，並未有 band 產生，顯示 PCR 的過程中無外來 DNA 的污染。
Fig. 6. ARB8-2 之 GS 序列(Query)與擬寶麗魚 GS 序列(Sbjct) 比對之 結果。
Fig. 7. 以 Nestin 抗體對 ARB8-2 細胞株進行細胞螢光免疫染色，圖中 顯示細胞質的位置可以產生免疫反應且呈現纖維狀，細胞核使用 DAPI 染色(藍色區域)，Bar= 20 μm。
Fig. 8 . ARB8-2 之 nestin 序列(Query)與擬寶麗魚 nestin 序列(Sbjct) 比 對之結果。
Fig. 9. 以 BLBP 抗體對 ARB8-2 細胞株進行細胞螢光免疫染色，圖中 顯示細胞質及細胞核的部分有紅色的螢光。細胞核使用 DAPI 染色(藍 色區域)，Bar= 20 μm。
Fig. 10. 以 Cx43 抗體對 ARB8-2 細胞株進行細胞螢光免疫染色，圖中 顯示細胞質的位置可以產生免疫反應，細胞核使用 DAPI 染色(藍色 區域)，Bar= 20 μm。
果顯示於 Fig. 11。
Figure 12 為 occludin polyclonal antibody 對 ARB8-2 做 Western blot 分析之結果，顯示在 70 kD 左右有一條明顯 band。
3-4ARB8-2 細胞株會表現 Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)之 mRNA 與蛋白質
Figure 13 為 nAChRs polyclonal antibody 對 ARB8-2 細胞株進行 細胞螢光免疫染色分析，結果顯示在細胞質的位置會產生螢光免疫反 應。另外 ARB8-2 細胞株會表現 nAChRs 之 mRNA，此結果顯示於 Fig. 5，經過定序後至 NCBI 的 GenBank 進行 blast，得知與已發表的 斑馬擬麗魚之 neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-3
(XM004545507.1)有 99 %的相似性，nAChRs 之定序結果顯示於 Fig.
14。
Fig. 11. ARB8-2 之 Cx43 序列(Query)與擬寶麗魚 Cx43 序列(Sbjct) 比 對之結果。
Fig. 12. 以 occludin 抗體對 ARB8-2 細胞株進行 Western blot 分析，在 70 kD 有一明顯的 band。
Fig. 13. 以 nAChRs 抗體對 ARB8-2 細胞株進行細胞螢光免疫染色，
圖中顯示細胞質的位置可以產生免疫反應，細胞核使用 DAPI 染色(藍 色區域)，Bar= 20 μm。
Fig. 14. ARB8-2 之 nAChRs 序列(Query)與擬寶麗魚 nAChRs 序列 (Sbjct) 比對之結果。
Fig. 15. 以 TH 抗體對 ARB8-2 細胞株進行 Western blot 分析，在 60 kD 有一明顯的 band。
3-7 ARB8-2 細胞株會表現黑色素細胞(melanocytes)之標記
ARB8-2 細胞株會表現 tyroasinase、TRP-2 及 MITF 之 mRNA，此結果顯示於 Fig. 17。Tyrosinase mRNA 經過定序後至 NCBI 的 GenBank 進行 blast，得知與已發表的斑馬擬麗魚之 tyrosinase
(XM004543885.1)有 100 %的相似性，tyrosinase mRNA 之定序結果顯 示於 Fig. 18。TRP-2 mRNA 經過定序後至 NCBI 的 GenBank 進行 blast，
得知與已發表的斑馬擬麗魚之 L-dopachrome tautomerase
(XM004557823.1)有 99 %的相似性，TRP-2 mRNA 之定序結果顯示於 Fig. 19。另外 Fig. 20 為 MITF mRNA 之定序結果，經過 NCBI 的 GenBank 進行 blast 後，得知與已發表的斑馬擬麗魚之 MITF (XM004568162.1)有 99 %的相似性。
Figure 17 顯示 ARB8-2 細胞株也會表現 SLC45A2 及 keratinocyte- associated transmembrane protein 2 (KCT-2)之 mRNA。SLC45A2 mRNA 經過定序後至 NCBI 的 GenBank 進行 blast，得知與已發表的 斑馬擬麗魚之 membrane-associated transporter protein (XM004549708.
1)有 99 %的相似性，SLC45A2 mRNA 之定序結果顯示於 Fig. 21。
KCT-2 mRNA 經過定序後至 NCBI 的 GenBank 進行 blast，得知與已 發表的斑馬擬麗魚之 KCT-2 (XM004561754.1)有 99 %的相似性，
KCT-2 mRNA 之定序結果顯示於 Fig. 22。
Fig. 16. 以 A2B5 抗體對 ARB8-2 細胞株進行細胞螢光免疫染色，圖 中顯示細胞質的位置可以產生免疫反應，細胞核使用 DAPI 染色(藍 色區域)，Bar= 20 μm。
Fig. 17. ARB8-2 之 cDNA 與多種 primer 做 PCR 後之電泳分析，
tyrosinase (439 bp)、TRP-2 (373 bp)、MITF (376 bp)、RPE65 (250 bp)、
SLC45A2 (224 bp)及 KCT-2 (157 bp)。C 表示 negative control，並未有 band 產生，顯示 PCR 的過程中無外來 DNA 的污染。
Fig. 18. ARB8-2 之 tyrosinase 序列(Query)與擬寶麗魚 tyrosinase 序列 (Sbjct) 比對之結果。
Fig. 19. ARB8-2 之 TRP-2 序列(Query)與擬寶麗魚 TRP-2 序列(Sbjct) 比對之結果。
Fig. 20. ARB8-2 之 MITF 序列(Query)與擬寶麗魚 MITF 序列(Sbjct) 比 對之結果。
Fig. 21. ARB8-2 之 SLC45A2 序列(Query)與擬寶麗魚 SLC45A2 序列 (Sbjct) 比對之結果。
Fig. 22. ARB8-2 之 KCT-2 序列(Query)與擬寶麗魚 KCT-2 序列(Sbjct) 比對之結果。
3-8ARB8-2 細胞株會表現 Müller cells 之標記
ARB8-2 細胞株會表現 Retinal pigment epithelium-specific 65 (RPE65)之 mRNA，此結果顯示於 Fig. 16。RPE65 是位於視網膜上皮 的一種酵素，與視覺傳導反應(visual phototransduction)及錐視蛋白 (cone opsins)的再生有關，它可將 all-trans-retinyl esters 水解成
11-cisretinol (Gollapalli and Rando, 2004; Jacobson et al., 2007; Mata et al., 2004)。另外 Müller cells 是一種位於視網膜的放射狀神經膠細胞，
主要的功能為分化成視網膜的神經元 ，並修補受損的視網膜
(Newman and Reichenbach, 1996)。RPE65 mRNA 之定序結果顯示於 Fig. 23，至 NCBI 的 GenBank 進行 blast，得知與已發表的斑馬擬麗魚 之 retinal Müller cells isomerohydrolase (XM004562052.1)有 99 %的相 似性。
3-9ARB8-2 細胞株會表現 homeodomain-containing transcription factors (NKX 2.3 及 NKX 6.2)之 mRNA
Figure 24 為 ARB8-2 細胞株之 cDNA 與 NKX family prrmer 進行 PCR 之結果，顯示在 NKX 2.2、NKX 2.3、NKX 2.5、NKX 2.6、NKX 6.2 及 NKX 6.3 都有 band 產生。其中 NKX 2.2 經定序後至 NCBI 的 GenBank 進行 blast 確認為 heat shock protein 且與已發表的斑馬擬麗 魚之 heat shock cognate 71 kDa protein (XM004574915.1)有 98 %的相
Fig. 23. ARB8-2 之 RPE65 序列(Query)與擬寶麗魚 RPE65 序列(Sbjct) 比對之結果。
Fig. 24. ARB8-2 之 cDNA 與 NKX family primer 做 PCR 後之電泳分 析，結果顯示 ARB8-2 只會表現 NKX 2.3 (242 bp)及 NKX 6.2 (231 bp)。
NKX 2.2 所表現的 band 為 heat shock protein；NKX 2.5 所表現的 band 為 rickle-like protein；NKX 2.6 所表現的 band 為 gap junction protein。
似性，定序結果顯示於 Fig. 25。NKX 2.3 之定序結果顯示於 Fig. 26，
經 NCBI 的 GenBank 進行 blast 後得知與已發表的斑馬擬麗魚之 homeobox protein NKX 2.3 (XM004571786.1)有 99 %的相似性。
NKX2.5 經定序後至 NCBI 的 GenBank 進行 blast 確認為 prickle-like protein 且與已發表的斑馬擬麗魚之 prickle-like protein 2
(XM004545288.1)有 98 %的相似性，定序結果顯示於 Fig. 27。NKX 2.6 經定序後至 NCBI 的 GenBank 進行 blast 確認為 gap junction protein 且 已發表的斑馬擬麗魚之 gap junction alpha-3 protein (XM0045733017.1) 有 99 %的相似性，定序結果顯示於 Fig. 28。NKX 6.2 之定序結果顯 示於 Fig. 29，經 NCBI 的 GenBank 進行 blast 後得知與已發表的斑馬 擬麗魚之 homeobox protein NKX 6.2 (XM004554563.1)有 100 %的相 似性。另外 NKX 6.3 之 PCR 結果顯示 primer 的專一性不足，所以無 法判定 ARB8-2 細胞株是否有表現 NKX 6.3 之 mRNA。
3-10ARB8-2 細胞株會表現 GATA transcription factors (GATA 3)之 mRNA 及蛋白質
Figure 30 為 ARB8-2 細胞株之 cDNA 與 GATA family prrmer 進行 PCR 之結果，顯示在 GATA 2 及 GATA 3 有 band 產生，但 GATA 2 mRNA 經過定序後至 NCBI 的 GenBank 進行 blast，確認為 MKI67 FHA domain-interacting nucleolar phosphoprotein 且與已發表的斑馬擬麗魚
Fig. 25. ARB8-2 之 heat shock cognate 71 kDa protein 序列(Query)與擬 寶麗魚 heat shock cognate 71 kDa protein 序列(Sbjct) 比對之結果。
Fig. 26. ARB8-2 之 NKX 2.3 序列(Query)與擬寶麗魚 NKX 2.3 序列 (Sbjct) 比對之結果。
Fig. 27. ARB8-2 之 prickle-like protein 2 序列(Query)與擬寶麗魚 prickle-like protein 2 序列(Sbjct) 比對之結果。
Fig. 28. ARB8-2 之 gap junction protein α 3 序列(Query)與擬寶麗魚 gap junction protein α 3 序列(Sbjct) 比對之結果。
。
Fig. 29. ARB8-2 之 NKX 6.2 序列(Query)與擬寶麗魚 NKX 6.2 序列 (Sbjct) 比對之結果。
Fig. 30. ARB8-2 之 cDNA 與 GATA family primer 做 PCR 後之電泳分 析，結果顯示 ARB8-2 只會表現 GATA 3 (1258 bp)。GATA 2 所表現的 band 為 MKI67 FHA domain-interacting nucleolar phosphoprotein。
之 MKI67 FHA domain-interacting nucleolar phosphoprotein
(XR191485.1)有 91 %的相似性，定序結果顯示於 Fig. 31。另外 GATA 3 之定序結果顯示於 Fig. 32，經 NCBI 的 GenBank 進行 blast，得知與 已發表的斑馬擬麗魚之 transcription factor GATA 3 (XM004569980.1) 有 99 %的相似性。
Figure 33 為 GATA 4 polyclonal antibody 分別對 ARB8-2 細胞株進行 細胞螢光免疫染色及 Western blot 分析。Fig. 33(a)為吳郭魚的腦組織、
吳郭魚胚胎細胞(TEB12)、黃臘鰺(Tmchinotus ovatus)腦細胞株 (SPB) 及 ARB8-2 細胞株萃取之蛋白質經 SDS page 電泳並轉印後使 GATA 4 抗體做 Western blot，結果顯示吳郭魚腦組織在分子量 38 kD 及 45 kD 各有一條 band；TEB12 在分子量 25 kD 有一條 band；SPB 在分子量 38 kD 及 50 kD 各有一條 band 而 ARB8-2 在分子量 38 kD 及 25 kD 各 有一條 band，這個結果顯示 GATA 4 antibody 會與其它序列類似的蛋 白質做非專一性結合。ARB8-2 細胞株以 GATA 4 polyclonal antibody 做細胞螢光免疫染色之結果顯示於 Fig. 33(b)，結果顯示在細胞核的 位置可以產生免疫反應。
GATA 4 在哺乳類動物心臟之發育扮演重要的角色，它主要表現在 內胚層及中胚層的組織中，如心臟、肝臟及肺臟等 (Molkentin, 2000)。
然而過去的文獻指出 GATA 3 會表現於外胚層的神經及非神經細胞中
Fig. 31. ARB8-2 之 MKI67 FHA domain-interacting nucleolar phosphoprotein 序列(Query)與擬寶麗魚 MKI67 FHA
domain-interacting nucleolar phosphoprotein 序列(Sbjct) 比對之結果。
Fig. 32. ARB8-2 之 GATA 3 序列(Query)與擬寶麗魚 GATA 3 序列
Fig. 33. 以 GATA 4 抗體對 ARB8-2 細胞株進行分析，(a) Western blot 及(b) 細胞螢光免疫染色，細胞核使用 DAPI 染色，Bar= 20 μm。結 果顯示在 38 及 25 kD 有一條 band，免疫染色於細胞核產生反應。
(b)
(a)
(Neave et al., 1995; Read et al., 1998; Sheng and Stern, 1999)。另外已有 算方法為平均值±平均標準差，並以 student’s t-test (SigmaPlot 2000, USA)做統計分析。當 P value<0.05 時，則視為有統計上的差異。
Figure 34 顯示在 ARB8-2 細胞株在無 FBS 培養基培養時，其 Cx43、
GS、NKX 2.3 及 NKX 6.2 mRNA 之相對表現量皆比使用 10% FBS 培 養基培養之 ARB8-2 細胞株還要高，且在統計上是有明顯差異的，顯 示未用 FBS 對 ABR8-2 進行細胞培養，ARB8-2 之 Cx43、GS、NKX
Fig. 34. 有無 FBS 培養後的 ARB8-2 細胞株之 Cx43、GS、NKX 2.3 及 NKX 6.2 mRNA 相對表現量，使用 18SrRNA 做為 control。
2.3 及 NKX 6.2 等基因表現量會比 10% FBS 培養的細胞來的高。