1-1 前言
1-1-1 綠寶麗魚
綠寶麗魚(Aequidens rivulatus)又稱紅尾皇冠，為輻鰭魚綱，鱸形
目，隆頭魚亞目，慈鯛科，寶麗魚屬，綠寶麗魚種。原產地為南美洲 厄瓜多爾及秘魯，在當地主要為食用魚。綠寶麗魚適合生長的溫度為 20 至 24 ℃，適合生長在 pH 值 6.5 至 8 的淡水環境中，最大長度可 達到 20 公分 (Kullander, 2003; Riehl and Baensch, 1991)。
1-1-2 腦神經細胞
腦神經細胞主要由神經元(neuron)及神經膠質細胞(neuroglial cell) 所組成。神經膠質細胞在中樞神經系統(CNS)中，又可細分為星狀神 經膠細胞(astrocyte)、寡突神經膠細胞(oligdendrocyte)、室管膜神經膠 細胞(ependymal cell)、放射狀神經膠細胞(radial glial cell)及微神經膠 細胞(microglial cell)。
神經元
神經元由神經突(neurite)及細胞體(soma)所組成，神經突又可分 為樹突(dendrite)及軸突(axon)。神經元之細胞膜在接受刺激及神經衝 動傳導上扮演重要的角色，通常由細胞體及樹突接受刺激訊息；軸突
傳導神經衝動。神經元依傳導方向及功能可分為：感覺神經元(sensory neuron)、運動神經元(motor neuron)及連絡神經元(interneuron)；神經 元亦可依神經元突起多寡來命名，如多極神經元，或是其釋放之神經
傳導物質來命名，如乙醯膽鹼神經元。在組織學上，βIII-tubulin、
acetyl-tubulin 及 neurofilament (NF)等細胞骨架蛋白或 dopamine、
tyrosine hydroxylase (TH)及 GABA (γ-aminobutyricacid)等神經傳導物 質皆可做為神經元之標記分子(Hermann et al., 2006; Sanchez et al., 2006)。
星狀神經膠細胞
星狀神經膠細胞在人類之 CNS 中為數量最多的細胞，約占 90%，
依形態可分為纖維性星狀神經膠細胞(fibrous astrocyte, type I)及原漿 性星狀神經膠細胞(protoplasmic astrocyte, type II)兩種。纖維性星狀神 經膠細胞主要分布在神經系統的白質，細胞突起的末端細長，分支比
如產生 apolipoprotein E 幫助腦部許多區域的平衡 (Jillian and Jeffrey,
2005)。星狀神經膠細胞源自放射狀神經膠細胞，所以兩者會表現許 多相同的標記，但其表現量有所差異，如 GS 和 S100 在星狀神經膠 細胞的表現量要比放射狀神經膠細胞高許多，因此有學者認為 GS 和 S100 才是星狀膠質細胞的標記，因有些特定的星狀膠質細胞沒有 GFAP (glial fibrillary acidic protein)表現 (Rungger-Brandle et al., 1989)，
所以一般認為的 GFAP 並不適合當作星狀神經膠細胞的標記。
常用來標記星狀神經膠細胞的分子有：中間絲蛋白 vimentin (Sivron et al., 1994)，攜鈣蛋白 S100 protein 與神經傳導因子 glutamate 相關蛋 白 glutamine synthetase (GS) (Monzon-Mayor et al., 1990), glutamate aspartate transporter (GLAST)及醣蛋白 tenascin-C (TNC) (Jingi et al., 2004)等。
寡突神經膠細胞
寡突神經膠細胞源自於神經上皮細胞(Warf et al.,1991; Pringle and Richardson, 1993)，位於 CNS 內的白質，主要的功能是形成髓鞘 (myelin) (Bunge, 1968)。寡突神經膠細胞可依照所形成髓鞘包覆軸突 的厚度來分類，type I 及 type II 之寡突神經膠細胞源自於 CNS 發育 的早期，並形成較薄的髓鞘，type III 及 type IV 出現於 CNS 發育的 晚期，形成的髓鞘較厚(Butt et al., 1997; 1998)。
一般用來標記寡突神經膠細胞的分子有：形成髓鞘的蛋白質 myelin
associated glycoprotein (MAG) (Butt et al., 1998), proteolipid protein (PLP)及 myelin basic protein (MBP)。A2B5 抗原是一種細胞膜上的神 經 節 糖 苷 ， 可 用 於 標 記 寡 突 神 經 膠 前 驅 細 胞 (oligodendrocyte progenitor cell)(Adolf et al., 2006) ， 而 galactocerosides (GalC) 及 sulfogalacto sylceramids (sulfatides) (Bosio et al., 1998)則是髓鞘上的醣 脂質，亦可當作寡突神經膠細胞的標記。
室管膜神經細胞
室管膜神經細胞是由神經上皮細胞(neuroepithelial cells)分化而
來，而在目前的研究中已得知室管膜神經細胞在成熟硬骨魚細胞CNS 中為主要分化及增生的區域 (Adolf et al., 2006; Ekstrom et al., 2001)。
室管膜神經細胞類似上皮細胞，外型上為單層的鱗狀立方體並包圍腦 室(ventricles)。室管膜神經細胞分為伸長細胞(tanycytes)及脈絡叢狀上 皮細胞(Mitro and Palkovits, 1981)。哺乳類之腦脊髓液(cerebrospinal fluid, CSF)在側腦室、第三腦室及第四腦室中形成，而室管膜神經細 胞具有許多纖毛及微纖毛，藉著調節纖毛的運動來幫助CSF在腦室系 統中流動(Oldendorf, 1972)。此外vimentin、S100及GFAP可用來標記 室管膜神經細胞，具有GFAP的細胞通常分布於室管膜(ependyma)以 及室管膜(subependyma)下層區域(Bodega et al., 1994)。
放射狀神經膠細胞
放射狀神經膠細胞廣泛存在發育中的CNS中(Parnavelas and Nadarajah, 2001)，為胚胎早期發育的細胞之一。成熟哺乳類動物的放 射狀神經膠細胞僅存於CNS少數區域，而卻大量存在於成熟魚類的 CNS中(Raymond and Easter,1983; Zupanc, 1999)。放射狀神經膠細胞 可引導神經元移動(Rakic, 1972; Hatten, 1999)並可分化成神經元
(Fishell and Kriegstein, 2003)、星狀神經膠細胞(Voight, 1989)及寡突神 經膠細胞(Malatesta et al., 2000)，故被認為可能是一種多能性的神經 膠前驅細胞。在先前的研究中顯示，魚類的放射狀神經膠細胞也會表 現GFAP及vimentin等標記(Zupanc and Clint, 2003)，另外在斑馬魚前腦 腦室中的放射狀神經膠細胞會表現aromatase，具有多功能性幹細胞的 能力(Pellegrini et al., 2007)。
微神經膠細胞
微神經膠細胞可能源自於自神經上皮細胞或是中胚層的造血細 胞(hemopoietic cell) (Alliot et al., 1991)，在免疫特徵上與巨噬細胞 (macrophages)相似，又可稱為腦內巨噬細胞，形態上屬於阿米巴型 (ameboid)，可引導細胞 apoptosis (Mallat and Chamak,1994)，並且能 移除死亡細胞的碎片(Ashwell, 1990; 1991)。另外，微神經膠細胞也能 產生一些營養因子(trophic factor)來維持神經元及神經膠細胞的正常
發育(Elkabes et al., 1996; Jonakait et al., 1996)。
許多證據顯示微神經膠細胞會導引並促進 CNS 神經突的生長 (Stolz et al., 1991)，促進星狀神經膠細胞增生、髓鞘及血管的形成 (Hamilton and Rome, 1994; Giulian et al., 1988)。常用來標記微神經膠 細胞的分子有：細胞膜上的醣蛋白 CD11b, CD34, CD43, CD68 及 isolectin-B4 與含鐵蛋白 ferritin (Kaneko et al., 1989)等。
1-1-3 魚類中樞神經系統
CNS 仍保留大量的放射狀神經膠細胞且持續產生新的神經元。但在 成熟哺乳類動物的 CNS 中，新的神經元只會在特定位置產生，如海 馬迴 (hippocampus)及下腦室區 (sub-ventricular zone) (Lagace et al., 2007)。魚類相較於哺乳類有好的再生及修復能力，哺乳類的星狀神 經膠細胞在正常情況下不會表現 vimentin，但當 CNS 受損時會持續 表現 vimentin；而魚類放射狀神經膠細胞則是表現 vimentin 及 GFAP (Arochena et al., 2004; Clint and Zupanc, 2002)，顯示 vimentin 的表現 與細胞的增生、分化及修復有關。大部分的文獻指出哺乳類及魚類的 放射狀神經膠細胞可以分化成寡突神經膠細胞，但 Malatesta 等人 (2000)指出囓齒類大腦皮質的放射狀神經膠細胞無法分化成寡突神 經膠細胞。
此外，哺乳類的神經幹細胞會表現 nestin 的中間絲，另外有文獻指 出斑馬魚會表現 nestin 的蛋白質(Tapanes-Castillo et al., 2014)，所以推 測其它硬骨魚類可能會有 nestin 表現。哺乳類及魚類的放射狀神經膠 細胞皆會表現出 BLBP (Adolf et al., 2006; Raymond et al., 2006)。另外 Pellegrini 等人(2007)指出魚類的神經幹細胞會表現 aromatase，而哺乳 動物的放射狀神經膠細胞和星狀神經膠細胞皆為異質性，具有多種不 同分化方向及不同分化程度的放射狀神經膠細胞，如表現 Olig2 與 NG2 的放射狀神經膠細胞為神經元和寡突神經膠細胞的共同前驅細
胞 (Park et al., 2004)，表現 her5 的細胞則為多能性神經幹細胞 (Chapouton et al., 2006)。哺乳類動物之成熟的寡突神經膠細胞不會表
現 A2B5 和PRGFRα，但形態上有許多分支的突起，可形成髓鞘。寡
突 神 經 膠 細 胞 和 星 狀 神 經 膠 細 胞 一 樣 具 有 不 同 的 來 源 ， O2A (oligdendrocyte type II astrocyte progenitor)為寡突神經膠細胞與星狀 神經膠細胞共同的前驅細胞，可同時表現 A2B5 和 GFAP，使用含血 哺乳類類似，一般常用的培養基有Eagles Minimum Essential Medium
(EMEM)、Eagles Basal Medium (EBM)、Medium199 (M-199)以及 的幫助，例如從虹鱒(Oncorhynchus mykiss)腦組織所分離的細胞，將其 培養在含胎牛血清(FBS)的培養基中3到4周，再利用免疫染色及西方 點墨法(Western blot)鑑定其細胞特性。結果發現此細胞表現GFAP以 及神經元標記NF-200 (Thompson et al., 1987; Jeserich and Rauen, 1990)。另外，當金魚(Carassius auratus auratus)腦細胞培養在包覆
於取得較為不易。根據以上兩點，不同魚類神經細胞株專一性標記的 database 建立及魚類神經細胞是否與哺乳類不同的特性與分化趨向，
都是將來可以被研究的方向。
1-2 研究動機與目的
在CNS的分化研究上，魚類從胚胎到成熟期間皆會持續產生新的 神經元，而在腦的功能與結構上，魚類又與胚胎時期的哺乳類動物相 似，所以藉由研究魚類腦部的原始未分化細胞可以對哺乳類神經系統 的發育與分化更為瞭解。
本研究使用逆轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)、西方點墨法(Western blot)、細胞免疫染色法 (Immunocytochemistry)、聚合酶連鎖反應(PCR)及即時聚合酶連鎖反 應(Real-time PCR)方法鑑定綠寶麗魚腦細胞株(ARB8-2)的細胞特性，
藉由研究其細胞株的分子表現來確定細胞的分化時期及其分化機制，
將有助於對於將來神經細胞在體外培養之研究。