4-1 ARB8-2 細胞可能是一種多元性的神經幹細胞
本研究藉由 RT-PCR、Western blot 及細胞免疫染色等方法證實 ARB8-2 細胞株表現神經幹細胞(nestin 及 BLBP)、神經元(TH 及 βIII-tubulin)、星狀神經膠細胞(GFAP、vimentin 及 GS)、寡突神經膠 前驅細胞(A2B5)、上皮細胞(Cx43、occludin 及 KCT-2)、Müller cells (RPE65)及黑色素細胞(tyrosinase、TRP-2、MITF 及 SLC45A2)等標記。
其中神經元、星狀神經膠細胞及寡突神經膠細胞皆會由放射狀神經膠 細胞所分化(Fishell and Kriegstein, 2003; Malatesta et al., 2000; Voight, 1989)，且放射狀神經膠細胞由神經上皮細胞所生成，可表現 GFAP、
vimentin、BLBP 及 nestin 等蛋白，故放射狀神經膠細胞被認為是一 種神經幹細胞或是神經原始細胞 (Günther and Sorcha, 2003; Velasco et al., 2001)。nestin 為神經前驅細胞特有的 type IV 中間絲蛋白，它
2006; Pellegrini et al, 2007)。 crest cells (NCCs)所分化而來的 (Huang and Saint-Jeannet, 2004)且 NCCs 是由周邊神經系統之神經上皮所產生的，因此具有上皮細胞之 特性(Krispin et al., 2010)。另外 NCCs 亦會分化成神經元、神經膠細 胞及神經內分泌細胞等神經細胞 (Pavan and Raible, 2012)，這些細胞 特性與 ARB8-2 非常相似，所以推測 ARB8-2 細胞株可能與 NCCs 具 有同源關係。另外 Tyrosinase 及 tyrosinase-related protein-2 (TRP-2)已 經被報導與黑色素的生成有關 (Kim and Uyama, 2005)。
microphthalmia -associated transcription factor (MITF)在色素沉澱的誘 導上扮演重要的角色，它可以活化 tyrosinase 基因的表現(Kim et al.,
2006; Oka et al., 2000)。SLC45A2 為人類黑色素瘤的抗原，又稱 membrane-associated transporter protein，主要的功能為協助黑色素合 成 (Harada et al., 2001)。過去的文獻指出，當 SLC45A2 基因發生突 變時會使得黑色素無法順利合成，進而造成眼球及皮膚上的色素減少 (Newton et al., 2001)。另外 KCT-2 為角質形成細胞(keratinocytes)的非 專一性標記，當 tyrosinase 活性被抑制時會使得黑色素的合成減少，
且黑色素小體會從黑色素細胞轉移至角質形成細胞(Solano et al., 2006; Kondo and Hearing, 2011)。
在 PCR 的實驗中，ARB8-2 細胞株表現 GS、nestin、Cx43、nAChRs、
tyrosinase、TRP-2、Cx43、MITF、RPE65、SLC45A2、KCT-2、NKX 2.3、NKX 6.2 及 GATA 3 之 mRNA。但未表現 NKX 2.1、NKX 2.2 及 NKX 2.5、NKX 2.6、NKX 2.8、NKX 6.1、NKX 6.3、GATA 1、GATA 2、GATA 4、GATA 5 及 GATA 6。不表現的原因可能是：(1)ARB8-2 細胞本身就不表現此基因，(2)在設計 primer 時沒有選到物種 conserve 之區域，(3)跑 PCR 時的溫度條件不適合，導致專一性不足，(4)primer 與序列相似的基因做結合，導致最後得到的並非原先預期的基因。本 實驗室之前已有使用相同的 primer 對同為慈鯛科之魚種的細胞進行 PCR，結果發現本研究未表現之基因在其它魚種是有表現的，證明當 初設計之 primer 是可以使用的。另外 PCR 使用的溫度是參照當初設
計時所提供的適合溫度且定序結果顯示確實有某些 primer 與相似序 列的基因做結合。根據以上的結果推測 ARB8-2 可能本來就不會表現 NKX 2.1、NKX 2.2 及 NKX 2.5、NKX 2.6、NKX 2.8、NKX 6.1、NKX 6.3、GATA 1、GATA 2、GATA 4、GATA 5 及 GATA 6 等基因之 mRNA。
NKX 2.5、NKX 2.6、NKX 2.8、NKX 6.1、NKX 6.3、GATA 1、GATA 2、GATA 4、GATA 5 及 GATA 6 等轉錄因子的表現偏向血球及心肌細 胞的發育，說明了 ARB8-2 與心臟及血管較無關連性。
ARB8-2 所表現的 GS、nestin、Cx43、nAChRs、tyrosinase、TRP-2、
Cx43、MITF、RPE65、SLC45A2、KCT-2、NKX 2.3、NKX 6.2 及 GATA 3 之 mRNA，經過定序後至 NCBI 之 GenBank 比對後發現都與 斑馬擬麗魚所表現的基因有很高的相似性，顯示綠寶麗魚與斑馬擬麗 魚有較高的親緣關係。另外根據先前的研究，NKX 2.3 主要表現於內 胚層(如腸、肝)及中胚層(如心臟、血管及淋巴系統)中 (Buchberger et al., 1996; Pabst et al., 1997)。但在本研究中綠寶麗魚腦細胞株 ARB8-2 表現 NKX 2.3，腦及神經系統是屬於外胚層器官，此結果表示 NKX 2.3 可能也會表現於外胚層的組織中，不過到目前為止尚未有文獻指出外 胚層器官會表現 NKX 2.3，所以還需要更多的研究來證實 NKX 2.3 也會表現於神經系統中。
在 real-time PCR 的實驗中，在無添加 FBS 培養之 ARB8-2 其 Cx43、
GS、NKX 2.3 及 NKX 6.2 mRNA 之表現量皆比添加 10 % FBS 培養後 之 ARB8-2 的表現量高，且經 Student’s t-test 做統計分析後顯示具有 顯著差異，此結果顯示培養基 FBS 的有無會影響某些基因的表現量。
血清可被用來取代有絲分裂的生長因子，已有相關的文獻報導血清 培養對於細胞分化上基因及蛋白質表現量的影響 (Carolan et al., 1995; Pinyopummintr and Bavister, 1994)。另外也有文獻指出 FBS 可誘 導神經膠細胞大量表現 GFAP，並可以促進星狀神經膠細胞及寡突神 經膠細胞等神經細胞的分化 (Chiang et al., 1996; Ishii and Volpe, 1994)。在小鼠視網膜前驅細胞繼代培養時使用 FBS 含量較低的培養 基，細胞的 βIII-tubulin、microtubule-associated protein-2 (MAP-2)、
protein kinase C alpha (PKC-α)及 rhodopsin 等基因表現量會增加且有 明顯差異；GFAP 及 cellular retinaldehyde-binding protein (CRALBP) 表現量會下降且有明顯差異 (Hu et al., 2013)。
在 Western blot 及細胞免疫染色的實驗中，因魚類 antibody 的研發 較少，所以到目前為止有許多研究者使用其他物種的抗體來進行研究，
像是使用哺乳類蛋白質的專一性抗體來進行魚類之研究並從染色的 組織或細胞的外型來判定抗體是否有專一性結合 (Bodega et al., 1994;
Dahl et al., 1985; Onteniente et al., 1983)。本研究中 ARB8-2 可以表現 星狀神經膠細胞之標記 GFAP、vimentin 及 GS；神經幹細胞之標記
nestin 及 BLBP；神經元之標記 TH；寡突神經膠前驅細胞之標記 A2B5；
上皮細胞之標記 Cx43 及 occludin。在過去的研究中 GFAP 可以表現 於丁鱥 (Tinca tinca)之視網膜的星狀神經膠細胞及 Müller cell
(Velasco et al., 2001)；GFAP 及 vimentin 會表現在鱒魚的 Müller cell (De Guevara et al., 1994)。Peterson 等人 (2001)將斑馬魚視神經之 Müller cell 進行免疫染色，發現個體及年齡較小的斑馬魚其 GS 表現 較強。在魚類發育的早期，由於胺基酸及生長養分的代謝會持續產生 ammonia，使得 GS 表現量會較高 (Wick and Randall, 2002)。草魚 (Ctenopharyn odon idellus)的 Müller cell 經細胞免疫染色後，結果顯示 會表現 GS、GFAP 及 S100 等蛋白質 (Andreas et al., 1998)。另外黃臘 鰺的腦細胞株 SPB 可以表現 BLBP、GFAP 及 vimentin 等放射狀神經 膠細胞的標記；occludin 及 Cx43 等上皮細胞之標記，並且證實該細 胞為一種神經幹細胞 (Lin et al., 2013; Wen et al., 2010)。Cx43 主要為 星狀神經膠細胞之功能性間隙蛋白，此蛋白亦會於室管膜神經膠細胞 中。根據文獻指出，缺乏 Cx43 之大鼠，其星狀神經膠細胞不具有細 胞間隙溝通的功能。此外，星狀神經膠細胞可以藉由 Cx43 通道釋放 glutamate 至胞外，可調控突觸的活性 (Naus et al., 1997)。另外
Occludin 是一種 tight junction transmembrane protein，表現於上皮細胞 及內皮細胞中 (Harhaj and Antonetti, 2004)，並且可以調控多種細胞間
的訊息傳遞(Blasiget al., 2011)。
哺乳類動物之寡突神經膠細胞在體外培養時能形成髓鞘，但在鱒魚 的寡突神經膠細胞體外培養時發現寡突神經膠細胞在分化的初期便 停止分化，並且失去形成髓鞘的能力 (Jeserich and Stratmann, 1992)。
在本研究中 ARB8-2 細胞株會表現寡突神經膠前驅細胞之標記 A2B5，
顯示 ARB8-2 細胞株可能具有分化為寡突神經膠細胞的能力。A2B5 為寡突神經膠細胞之前驅細胞的標記，並且可以表現在 WMPC (white matter progenitor cell)、O2A (oligodendrocyte type 2 astrocyte progenitor) 以及 GRP (glial restricted precursor)等前驅細胞中。另外它也是早期細 胞分化的標記 (Liu and Rao, 2004)。另外根據先前的文獻指出，在金 魚腦組織受傷後進行細胞培養，在細胞免疫染色後發現會表現 GFAP、
A2B5 及 6D2 等標記，在大鼠視神經之 O2A 也有此表現產生，所以 推測金魚腦中的 O2A 細胞可能是星狀神經膠細胞及寡突神經膠細胞 的前驅細胞(Sivron et al., 1992)。另外黃臘鰺的腦細胞株 SPB、吳郭魚 的腦細胞株 TB2 及點帶石斑魚(Epinephelus coiodes)的腦細胞株 GBC4 等腦細胞株皆會表現 A2B5，且這些細胞株都已經被證實為神經幹細 胞或神經前驅細胞 (Wen et al., 2008, 2009, 2010)。此外，ARB8-2 亦 表現 nAChRs 蛋白質， nAChRs 為一種 ligand-gated 的離子通道，它 廣泛存在於 neuromuscular junctions、魚類電化學器官、中樞及周邊神
經系統 (Changeux, 2012)。許多證據顯示它與細胞的增生、附著及移 則是 GFAP 蛋白質之 dimer；從吳郭魚(Oreochromis mossambicus)腦細 胞分離之細胞株 TB2 以 vimentin 抗體進行 Western blot 分析，結果顯 示在分子量 60 kD 的位置有一條 band，此結果與本研究相符合 (陳, 2006)；黃臘鰺腦細胞株在 70 kD 與 38 kD 可表現 occludin 及 GATA 3 ( Lin et al., 2013)；吳郭魚腦細胞株在 60 kD 可表現 TH (陳, 2006)。TH 是 tyrosine 生成 dopamine 及 norepinephrine 的一種酵素，會表現在 dopamineric neurons。斑馬魚的腦室區有四種 dopamineric neurons 並 都會表現 TH 之蛋白質，包括背部腦室旁的節核 (dorsal paraventricular posterior tuberal nucleus)、腹部腦室旁後面的節核 (the ventral
paraventricular posterior tuberal nucleus)、後節核 (the posterior, P tuberal nucleus TN)及腦室旁的後節細胞 (paraventricular
organ-accompanying cells of the posterior tuberculum) (PoKey and
在 dopaminergic neurons (Shults et al., 1990)。
4-3 結論
根據本研究的結果推測 ARB8-2 細胞株為一種多能性的神經幹細 胞，它可能具有分化為神經元、星狀神經膠細胞、寡突神經膠細胞及 視網膜細胞的能力。根據先前的文獻指出放射狀神經膠細胞及
WMPC 皆可以分化為神經元、星狀神經膠細胞、寡突神經膠細胞，
但 WMPC 需要在低密度培養時才能分化為神經元 (Liu and Rao, 2004)。至目前為止，尚未有文獻指出放射狀神經膠細胞及白質前驅 細胞會表現黑色素之特性，另外本研究亦證明 ARB8-2 具有神經幹細 胞之特性，所以推測 ARB8-2 可能是位於綠寶麗魚大腦的多能性神經 幹細胞，可以作為研究神經細胞誘導及分化之用途。