4-1 毛筆尖脫附電噴灑最佳化
4-1-1 毛筆距離質譜口位置
本實驗對於毛筆放置的位置對訊號的影響進行探討，利用本實驗的結果可以 知道在哪個位置有最穩定最強的訊號，以此進行接下來的實驗。在質譜口與電噴 灑游離源涵蓋的範圍約 1.2 mm2的矩形範圍內，緩慢調整 X 軸與 Y 軸位置，觀 察訊號強度的變化。
實驗步驟
將毛筆沾取 10 μg/ml 的咖啡因溶液（溶劑為甲醇），輔助氣體為氮氣，
輔助溶劑為甲醇，將毛筆放置於質譜口與電噴灑游離源的中間，如圖 4-1 所 示，以旋鈕調整 X、Y 軸位置，調整以找出訊號值最好的位置。
實驗結果
經由位置移動後，將離子訊號強度與 X、Y 平面作圖，如圖 4-2 所示，
發現在垂直距離質譜口 3 mm 的位置與水平距離質譜口 1.5 mm 的位置有最 好的訊號值。毛筆須放置較接近電噴灑游離源而距離質譜入口較遠有最好訊 號值，推測可能是因為如果距離電噴灑游離源太遠形成的離子數會下降，而 且因有輔助氣體將離子吹出毛筆，因此毛筆可以不用很靠近質譜入口。接下 來的實驗皆會固定以此位置進行。
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圖 4-1 本實驗使用的實際實驗裝置圖
Y 軸旋鈕
X 軸旋鈕
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圖 4-2 毛筆位置與訊號強度
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4-1-2 乙醇揮發
本實驗是利用毛筆沾取乙醇後刷取人體皮膚，為了確定在沾完乙醇後需要在 多少時間內完成實驗，因此對毛筆一次沾取的乙醇含量與揮發所需要的時間進行 觀察。
實驗步驟
先將乾燥毛筆放入天平進行秤重，取得空筆重量。接下來將毛筆放入乙 醇溶液中，吸滿溶劑後拿出馬上放置天秤上進行秤重，如圖 4-3 所示，利用 手機記錄隨時間變化乙醇重量在毛筆上的含量變化，每分鐘記錄一次重量。
實驗結果
每分鐘記錄的重量 – 毛筆空筆重 = 每分鐘乙醇在毛筆上含量
根據本實驗結果如圖 4-4 得知毛筆一次沾取乙醇的量為 6 mg 左右。前 4 分 鐘揮發速率較快，第 5 分鐘時乙醇含量只剩 1 mg 左右，5 分鐘後揮發速率 會趨於平緩，在 27 分鐘會完全揮發完畢，由於前 4 分鐘揮發速率較快，因 此實驗皆會於三分鐘內結束，以避免分析物在移動至儀器過程揮發掉。
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圖 4-3 乙醇揮發秤重實際實驗圖
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圖 4-4 乙醇揮發實驗結果 0
2 4 6 8
0 10 20 30
w ei g h t (m g )
Time (min)
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4-1-3 不同支毛筆的再現性
利用此實驗對於不同支毛筆採樣進行觀察，測試是否會因為不同支毛筆而產 生明顯的實驗誤差，進而影響實驗結果。
實驗步驟
準備十隻乾燥毛筆，分別沾取 10μg/mL 的咖啡因溶液，再放置於裝置 上進行質譜儀偵測。
實驗結果
對 10 支毛筆進行測試，所得到訊號值的結果平均為 1.19x105，如表 4-1 所示。其中 4、6、7、10 號的毛筆測得的訊號值較為接近。因為市售毛筆雖 然規格固定，在製作上還是會有誤差，可能有些筆毛量較多有些筆毛量較少，
筆毛長度也會有些微誤差，所以在實驗沾取相同濃度的溶液時，每支筆吸附 的量也會有所不同，因此實驗結果所得的訊號值會有些差異。
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次數 1 2 3 4 5 6
Ion intensity 1.62E+05 5.84E+04 2.42E+05 8.82E+04 2.13E+05 7.79E+04
7 8 9 10 平均 標準差
8.22E+04 4.93E+04 1.49E+05 7.20E+04 1.19E+05 6.44E+04
表 4-1 十隻毛筆沾取咖啡因溶液的訊號強度
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4-2 罐裝咖啡--咖啡因代謝實驗
以一般市售罐裝咖啡並使用自製採樣筆來進行實驗，分別於早上 9:30、下午 14:00、晚上 17:30 喝下咖啡，持續監測 180 分鐘。透過實驗可以觀察咖啡因在 人體中早、中、晚代謝時間的差異。
實驗步驟
本實驗利用毛筆尖電噴灑質譜法來進行，準備 4 隻採樣筆，先將以乙醇 潤濕。以採樣筆反覆刷取眼皮 10 次後，將採樣筆直接上機調整好位置後，
進行質譜分析。喝咖啡前 10 分鐘先採樣一次，記錄人體背景值，喝咖啡後 每 10 分鐘採樣一次，持續採樣 180 分鐘。每次採樣完都將採樣筆放入更換 過乙醇的樣品瓶，放入超音波震盪進行震洗，以避免殘留影響下次採樣分 析。
實驗結果
透過 SIM 模式與 Full Scan 模式進行質譜分析，在全掃描模式下，在 代謝產物出現時可以看到很明顯的咖啡因訊號，如圖 4-6 所示。將早上、下 午、晚上所得的實驗結果作圖得到圖 4-5，整理咖啡因代謝訊號產生的時間 如表 4-2，觀察發現人體早上的代謝速率較快，於 62 分鐘左右會代謝出現訊 號，而下午需要 90 分鐘才可以看到代謝訊號，人體晚上的代謝速率緩慢，
127 分鐘才會出現代謝訊號。
市售咖啡雖然包裝有標示咖啡因含量，但是裡面還有添加一些其他的物 質，而且市售咖啡咖啡因含量都偏低，實驗時無法看到經由人體代謝反應後 的代謝物訊號，使用採樣筆採樣上機後須先調整位置在進行質譜分析，每支 筆會因為製作方式不同而有位置的不同，在調整位置時溶劑也一直在揮發，
所以進行質譜分析時訊號誤差較大。
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圖 4-5 罐裝咖啡-受試者 A 咖啡因代謝
0.00E+00 5.00E+03 1.00E+04 1.50E+04 2.00E+04 2.50E+04 3.00E+04 3.50E+04
09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00
Ion intensity
time
Caffeine 喝下咖啡的時間點
90 min
62 min
127 min
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人 時間 部位
早 午 晚
受試者 A 眼皮 62 ± 4.3min 90 ± 0 min 127 ± 8.3min
表 4-2 受試者 A 喝罐裝咖啡結果
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圖 4-6 咖啡因代謝全掃描質譜圖
0.0E+00 2.0E+04 4.0E+04 6.0E+04 8.0E+04 1.0E+05 1.2E+05
150 160 170 180 190 200
Ion intensity
m/z
Caffeine
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4-3 研磨咖啡豆—咖啡因代謝實驗
因市售的罐裝咖啡中咖啡因濃度較低，或多或少有加入一些其他添加物，為 了更進一步測試是否可以看到咖啡因經由人體代謝後的產物，選擇購買咖啡豆自 行研磨沖泡進行實驗。每次沖泡咖啡後取 1 ml 的咖啡稀釋，以 GC/MS 進行定量，
一杯 155 ml 的咖啡約含有 210 mg 左右的咖啡因。
實驗步驟
本實驗利用毛筆脫附電噴灑質譜法來進行，與之前實驗相同準備 4 隻水彩筆，
先將以乙醇潤濕。以毛筆反覆刷取眼皮 10 次後，將毛筆直接上已經調整好 X、
Y 軸距離的儀器裝置，進行質譜分析。每次實驗前都現磨咖啡豆進行沖泡，再將 沖泡完 155mL 的咖啡取 1mL 過濾稀釋，利用 GC/MS 進行定量分析。喝咖啡前 10 分鐘先採樣一次，記錄人體背景值，喝咖啡後每 10 分鐘採樣一次，持續採樣 180 分鐘。每次採樣完都將採樣筆放入更換過乙醇的離心管，放入超音波震盪進 行震洗，以避免前次採樣殘留影響下次採樣結果。
實驗結果
利用 GC/MS 定量每次喝下咖啡的咖啡因含量，以確定每次喝下的咖啡咖啡 因含量，用檢量線（圖 4-7）進行定量，推算出平均每次喝下的咖啡因含量為 210.49
± 43.10 mg。透過定量分析以確定每次喝下的咖啡，咖啡因含量不會相差過大，
確保在實驗過程不會因咖啡因含量差異太大導致實驗無法順利測得。
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圖 4-7 GC/MS 定量檢量線
y = 16766x - 19053 R² = 0.9987
0.00E+00 1.00E+05 2.00E+05 3.00E+05 4.00E+05 5.00E+05 6.00E+05 7.00E+05 8.00E+05 9.00E+05
0 10 20 30 40 50
Ion in tens it y
conc. (μg/ml)
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4-3-1 不同人體部位採樣
實驗結果
不同部位採樣測試者為受試者 A，受試者 A 是個不喝咖啡、不常運動者。
採樣部位為眼皮及耳朵進行比較，由於藥物代謝是經由血液運輸，因此選擇此兩 個部位是因為眼皮為人體最薄的皮膚，而耳朵的皮膚上可以清楚看見很多微血管 分布，亦是人體上較薄的皮膚。
觀察兩個部位採樣分析後所得到的訊號，發現眼皮採樣的訊號除了在代謝物 產生最高訊號時，其他時間訊號都較為平穩，如圖 4-8。相較耳朵採樣，雖然能 看出代謝物產生最高訊號的時間，但在其他時間訊號波動幅度稍大，如圖 4-9 所 示。因為此結果接下來的其他受試者皆選擇以眼皮進行採樣。圖 4-10 為受試者 A 在咖啡因代謝訊號最強時的全掃描質譜圖，根據此圖可明顯看出咖啡因代謝訊 號，比喝罐裝咖啡使用採樣筆進行採樣的離子訊號值更高，而且亦可以觀察到咖 啡因經由人體代謝的產物訊號。
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圖 4-8 受試者 A 眼皮咖啡因代謝
0.00E+00 5.00E+03 1.00E+04 1.50E+04 2.00E+04 2.50E+04 3.00E+04 3.50E+04
09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00
Ion in ten sit y
time
Caffeine Caffeine metablites
喝下咖啡的時間點
58 min
88 min
118 min
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圖 4-9 受試者 A 耳朵咖啡因代謝
0.00E+00 5.00E+03 1.00E+04 1.50E+04 2.00E+04 2.50E+04
09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00
Ion in ten sit y
time
Caffeine Caffeine metablites
喝下咖啡的時間點
57 min
87 min 117 min
39
圖 4-10 眼皮咖啡因代謝全掃描質譜圖 0.00E+00
5.00E+04 1.00E+05 1.50E+05 2.00E+05 2.50E+05 3.00E+05
160 170 180 190 200 210 220
Ion in ten sity
m/z
Caffeine
Caffeine metabolites
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4-3-2 不同人對咖啡因及代謝物採樣
實驗條件
除了受試者 A 喝咖啡進行實驗外，想知道此方法對其他人是否也可行，因 為找了兩位受試者進行採樣分析。受試者 B 是經常喝咖啡、不常運動者，而受 試者 C 是每天至少喝一杯咖啡、經常運動者。因為受試者 B 與 C 是經常喝咖啡 者，如果是早上或下午進行喝咖啡採樣代謝物分析實驗，為了怕一大早喝的咖啡 會干擾實驗採樣，所以實驗當天早上不會先喝過再進行，而晚上的實驗則因距離 早上喝咖啡時間較久因此不會受到影響。
實驗結果
受試者 B 對於咖啡因及代謝物早上代謝所需時間為 50 分鐘，下午代謝時間 為 85 分鐘，而晚上則為 110 分鐘，圖 4-11。
受試者 C 對於咖啡因及代謝物早上代謝所需時間為 30 分鐘，下午代謝時間 為 75 分鐘，而晚上則為 100 分鐘，圖 4-12。
後面有對三位受試者代謝時間的結果進行比較與討論。
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圖 4-11 受試者 B 眼皮咖啡因代謝
0.00E+00 5.00E+03 1.00E+04 1.50E+04 2.00E+04 2.50E+04
09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00
Ion in ten sit y
time
Caffeine Caffeine metablites
喝下咖啡的時間點
50 min
85 min
110 min
42
圖 4-12 受試者 C 眼皮咖啡因代謝
0.00E+00 5.00E+03 1.00E+04 1.50E+04 2.00E+04 2.50E+04 3.00E+04 3.50E+04 4.00E+04 4.50E+04 5.00E+04
09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00
Ion in ten sit y
time
Caffeine Caffeine metablites
喝下咖啡的時間點
30 min
75 min
100 min
43
4-3-3 三位受試者的實驗整理
將實驗結果整理成表 4-2、表 4-3，經由實驗發現，不喝咖啡、不常運動的 A 對咖啡因代謝時間都比其他兩位受試者花費較多的時間。常喝咖啡但不常運動的 B 對咖啡因的代謝能力比 A 稍微好，但是差異並沒有很明顯。然而常運動又經 常喝咖啡的 C 對咖啡因的代謝能力最好，比 B 與 A 快非常多，尤其是早上代謝 時間差異很明顯。因此推測經常運動者對藥物代謝能力會比較好，而經常服用同 樣藥物者會使此藥品排出體外的時間比不常吃此藥物者快。
由三位受試者的結果發現，人體早上的代謝速率最快，下午次之，晚上則是 最慢的。
又對三位受試者每次刷到的咖啡因代謝物最高訊號值與標準品訊號進行比 較換算，發現經由人體代謝後可刷取到的咖啡因含量約為 6 ~ 25μg，如表 4-3。
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人 時間 部位
早 午 晚
受試者 A
眼皮 58 ± 4.3 min 88 ± 4.3 min 118 ± 4.3 min
耳朵 57 ± 4.7 min 87 ± 4.7min 117 ± 9.4 min
受試者 B 眼皮 50 ± 0 min 85 ± 5min 110 ± 0 min
受試者 C 眼皮 30 ± 0 min 75 ± 5 min 100 ± 10 min 表 4-3 三位受試者時間比較結果
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人 時間 部位
早 午 晚
受試者 A
眼皮 7.0 ± 3.58 μg 20.0 ± 10.22 μg 17.4 ± 6.72 μg
耳朵 14.1 ± 2.97 μg 19.3 ± 0.88 μg 15.1 ± 1.13 μg
受試者 B 眼皮 25.3 ± 2.85 μg 12.8 ± 2.08 μg 22.6 ± 0.62 μg
受試者 C 眼皮 12.8 ± 8.33 μg 5.8 ± 1.00 μg 20.1 ± 0 μg 表 4-4 三位受試者刷到咖啡因含量比較結果