利用毛筆從皮膚採樣結合電噴灑質譜法運用於分析咖啡因及其代謝物之研究

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(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文. 指導教授︰林震煌博士（Cheng-Huang Lin）. 利用毛筆從皮膚採樣結合電噴灑質譜法運用於分析咖啡因及其代謝物之研究. Sampling and Profiling Caffeine and its Metabolites from an Eyelid using a Watercolor Pen based on Electrospray Ionization/Mass Spectrometry. 研究生：張凱茵（Kai-Yin Chang）. 中華民國一百零六年六月.

(2) 謝誌兩年前考上師大研究所時，很榮幸可以進入林震煌教授研究室當研究生。雖然這兩年教授身兼系主任，公務較為繁忙，還是會時常關心我們的實驗進度，在實驗遇到瓶頸時，會給予我們一些建議與幫助，使實驗可以一步一步順利往下進行，讓我們不致於拖到最後匆忙的結束實驗，真的很謝謝老師常常鼓勵我們。也很感謝口試委員丁望賢教授、呂家榮教授，在繁忙的日程中還抽空看完我們的論文，在口試中給予很多建議與指導，使論文內容得以更加完整。兩年的研究生生活有如時光飛逝，很快就過去了，A414 是這兩年的另外一個家，每天都有一半的時間待在這裡。第一年進來時有人瑛、陳瑩、紘瑋、建翔、明儒、亮安、慶豪學長教導我們如何操作實驗室儀器跟一些器具。每次實驗遇到困難時人瑛總是給予我不少建議與幫助，其他人會在每次進度報告後給予一些實驗室的建議，很開心在剛進實驗室的時候遇到大家。謝謝亞汶學姊總是在我問奇怪的問題時給予我很多建議，在非常忙碌的時候還借我做實驗，還提供了毛筆結合脫附電噴灑游離法的靈感，讓我利用這個想法來進行實驗並完成論文。一起進實驗室的筱粧，常常一起聊天分享生活上的大小事，在最後忙到不行的時候還抽空借我時間做實驗，有時候還會給我一些改善實驗的靈感。第二年有鈺婷、宇儂、柏鈞、芷寒、冠豪天天在實驗室耍寶聊天討論實驗，讓第二年的日子也過得非常的有趣。最後要感謝我的父母，在我做這個任性的決定後還是無條件的支持我，當太晚離開實驗室還會來接我回家，最後想說一句話我終於畢業啦！.

(3) 摘要本研究開發了一種新型非侵入性採樣結合電噴灑質譜法的方法，使用毛筆做為採樣工具，以乙醇作為溶劑，刷取受試者的眼皮進行採樣。之後將毛筆放置於質譜入口前進行偵測，由於乙醇揮發速度很快，因此會帶著分析物從毛筆表面上逸出，當分析物與電噴灑游離源所釋放出的離子接觸時，會使分析物被離子化，以進入質譜儀進行分析。本實驗有對不同部位及不同受試者進行研究分析，發現利用毛筆刷取眼皮採樣的訊號較為明顯；而經常喝咖啡跟經常運動的人跟不常運動及不喝咖啡的人相比，也會有不同的結果。研究結果證明，本實驗方法適用於受試者飲用咖啡後對咖啡因及其代謝物的分析。本實驗也對毛筆沾取乙醇隨時間的揮發作探討，發現前四分鐘揮發速率較快，因此實驗時間將控制在三分鐘內完成。. 關鍵字：毛筆、非侵入性採樣、電噴灑游離質譜法、咖啡因、代謝物. I.

(4) Abstract A novel and non-invasive sampling method was developed for use in electrospray ionization/mass spectrometry (ESI/MS). A watercolor pen (brush) was used as the sampling tool, in which the brush was rinsed with ethanol and used to collect a sample from the eyelid of a volunteer.. Following this, the brush was. quickly moved to the front of the mass inlet, where the ethanol as well as the analytes evaporated very fast and escaped from the brush surface. When the analytes make contact with the ESI plume, which arises from the ESI needle tip, they are ionized and then detected by the mass spectrometer.. The findings show that this new technique. is applicable for the analysis of caffeine and its metabolites from eyelids after the volunteers consumed cups of coffee.. Keywords: watercolor pen, non-invasive sampling, ESI/mass spectrometry, caffeine, metabolites II.

(5) 目錄摘要 ................................................................................................................. I ABSTRACT ..................................................................................................II 目錄 .............................................................................................................. III 圖目錄............................................................................................................ V 表目錄.......................................................................................................... VI 第一章緒論................................................................................................... 1 1-1 研究目的 .............................................................................................. 1 1-2 研究背景 .............................................................................................. 2 1-3 分析物介紹 .......................................................................................... 4 1-4 咖啡煮法 .............................................................................................. 7 第二章分析方法及原理 ............................................................................ 8 2-1 液相層析電噴灑質譜儀 (LC/ESI-MS) ............................................. 8 2-2 電噴灑質譜法的發展史 ...................................................................... 9 2-3 電噴灑游離化方法及原理 ................................................................ 11 2-4 藥物代謝 ............................................................................................ 13 第三章儀器、藥品與實驗方法 .............................................................. 14 3-1 毛筆尖電噴灑游離質譜法 (BRUSH-SPRAY/ESI-MS) ..................... 14 3-2 毛筆脫附電噴灑游離質譜法 ............................................................ 16 3-3 儀器及周邊設備列表 ........................................................................ 18 3-4 藥品列表 ............................................................................................ 20 3-5 人體採樣前處理及採樣方法 ............................................................ 21 III.

(6) 第四章結果與討論................................................................................... 22 4-1 毛筆尖脫附電噴灑最佳化 ................................................................ 22 4-1-1 毛筆距離質譜口位置.................................................................. 22 4-1-2 乙醇揮發 ...................................................................................... 25 4-1-3 不同支毛筆的再現性.................................................................. 28 4-2 罐裝咖啡--咖啡因代謝實驗 ............................................................. 30 4-3 研磨咖啡豆—咖啡因代謝實驗 ........................................................ 34 4-3-1 不同人體部位採樣 ..................................................................... 36 4-3-2 不同人對咖啡因及代謝物採樣................................................. 40 4-3-3 三位受試者的實驗整理............................................................. 43 第五章結論............................................................................................... 46 參考文獻....................................................................................................... 47 期刊論文....................................................................................................... 55 研究發表....................................................................................................... 56. IV.

(7) 圖目錄圖 1-1 咖啡因及人體代謝產物 ..................................... 4 圖 3-1 毛筆尖電噴灑游離質譜法實際裝置圖........... 15 圖 3-2 毛筆脫附電噴灑游離法實驗裝置示意圖....... 17 圖 4-1 本實驗使用的實際實驗裝置圖 ....................... 23 圖 4-2 毛筆位置與訊號強度 ....................................... 24 圖 4-3 乙醇揮發秤重實際實驗圖 ............................... 26 圖 4-4 乙醇揮發實驗結果 ........................................... 27 圖 4-5 罐裝咖啡-受試者 A 咖啡因代謝 .................... 31 圖 4-6 咖啡因代謝全掃描質譜圖 ............................... 33 圖 4-7 GC/MS 定量檢量線 ......................................... 35 圖 4-8 受試者 A 眼皮咖啡因代謝 .............................. 37 圖 4-9 受試者 A 耳朵咖啡因代謝 .............................. 38 圖 4-11 受試者 B 眼皮咖啡因代謝 ........................... 41 圖 4-12 受試者 C 眼皮咖啡因代謝 ........................... 42. V.

(8) 表目錄表 4-1 十隻毛筆沾取咖啡因溶液的訊號強度........... 29 表 4-2 受試者 A 喝罐裝咖啡結果 .............................. 32 表 4-3 三位受試者時間比較結果 ............................... 44 表 4-4 三位受試者刷到咖啡因含量比較結果........... 45. VI.

(9) 第一章緒論 1-1 研究目的對於藥物開發來說，藥物代謝是一門很重要的學問，一般對藥物代謝而言，最常測試的方法為取血液及尿液樣品進行偵測[1-3]。但是這兩種方法皆為侵入性，而且需要步驟繁複的前處理。尿液跟血液中含有大量的基質與鹽類，會有基質效應 (matrix effect)[11]干擾偵測。然而鹽類不容易游離化容易造成質譜儀阻塞，所以必須利用複雜的前處理以降低干擾，因此在檢驗過程中會花費不少資源與時間。為了能縮短時間及流程，開始有很多快速篩檢的方法開發研究。基於紙片電噴灑游離法 (paper-spray/ESI-MS)[1-10]的原理進而開發出的毛筆尖電噴灑游離法(brush-spray/ESI-MS)，而本研究基於毛筆尖電噴灑游離法進而改良成毛筆採樣結合脫附電噴灑游離法，本方法改良了毛筆的製作，使用市售水彩筆直接進行皮膚採樣，可以減少傳統質譜分析複雜的樣品前處理，在長時間監測情況下，可省下不少時間及有機溶劑的使用，亦可快速知道實驗結果。本實驗利用脫附電噴灑游離質譜法進行採樣與分析，達到簡單、快速、直接的定性質譜分析方法，對於人體藥物代謝的研究，提供此方法的可行性與潛力的初步證據。. 1.

(10) 1-2 研究背景質譜儀分析的樣品從有機小分子經過各種改良後，已經可以分析各類生物大分子。游離化方法也由一開始的電子游離法 (electron ionization, EI) [12]，利用加熱金屬絲產生電子，在電壓加速下形成電子束，帶有高能量（70 eV）去碰撞氣態樣品分子，吸收能量後，會解離一個電子，形成分子離子。然而因為分子離子依舊處於高能量狀態，將可能導致分子離子進一步發生化學鍵斷裂反應，使得分析物不容易觀察到分子離子訊號。因此 1966 年 M.S. Munson 等人提出了化學游離法 (chemical ionization, CI) [13]，進而改善這個問題，經由加熱金屬絲產生的電子先與反應氣體碰撞，產生氣體離子，在跟樣品分子碰撞進行電荷轉移，使分析物離子化。由於兩種游離方法皆須將樣品加熱氣化後，再行氣相碰撞形成離子，因此對於大分子量、熱不穩定、低揮發性的分析物皆不會游離化。所以進而發展出比較不傷害樣品的軟性游離法，如：電噴灑游離法（electrospray ionization, ESI），將分析物溶在易揮發溶劑中，通過施加高電壓的毛細管，在高電場的環境下，毛細管噴出來的溶液會因為電場斥力跟表面張力的關係形成泰勒錐（Taylor cone），當庫倫斥力大於表面張力時會分裂成微小液滴進入質譜儀。基質輔助雷射脫附游離法（matrix-assisted desorption ionization, MALDI）[14]為了使大分子游離化，基質選用能夠吸收雷射能量、與分析物有相似溶解性，通常為小分子有機酸。使用基質是為了將雷射能量間接轉移到分析物分子上，保護分析物不會因雷射能量太大而碎裂。然而在 2004 年 R.G. Cooks 等人開發出脫附電噴灑游離法 (desorption electrospray ionization) ，可以在一大氣壓力下進行的質譜法，利用此方法可將固體表面上微小量的分析樣品直接游離化，進質譜儀分析 [15-19]。利用電噴灑游離源產生的帶電荷液滴，藉由高速輔助器體與樣品表面產生碰撞，使得有機小分子或者是生物大分子產生游離化並脫附，進入儀器分析。因為這個方法的成功開發，使得直接游離化質譜法的分析技術開始大量發展。 2.

(11) 近年來在一大氣壓力下進行的質譜法開始蓬勃發展下[20-30]，R.G. Cooks 等人提出了紙片電噴灑游離法（paper-spray ionization）結合質譜儀可檢測多樣生物樣品，像是血液、尿液、唾液等等體液。利用此方法只須極少量的分析樣品以及施加高電壓，搭配鞘流溶劑可快速取得樣品的圖譜訊號，此方法與電噴灑游離法相似 [31-48]。但是有很多因素會影響電噴灑游離過程，像是紙片尖端角度、材質、電壓大小、溶劑流速，還有紙片尖端與質譜入口的距離等等。因此本實驗室對於紙片電噴灑游離法進行改良研究，於 2012 年發表有關研究，將電噴灑游離源的毛細管改成紙片載台，於紙片載台上放置邊長 1 公分尖角 15 度角的三角形濾紙，利用載台供給鞘流溶劑與施加高電壓，使紙片上的樣品以電噴灑形式游離化進行質譜分析。但因為濾紙的纖維非順向性，因此在 2013 年開發了竹筆尖電噴灑質譜法（nib-spray/ESI-MS）把三角濾紙更換成有順向性的竹筆尖，透過毛細現象及順向性使分析物滴在竹筆尖上時比濾紙更快游離化，以利質譜儀分析，有助於縮短分析時間亦可增加游離效率，使靈敏度與訊號強度皆有提升[49-52]。基於竹筆尖電噴灑原理，進而開發出也具有順向性且可攜帶式的毛筆尖電噴灑質譜法（brush-spray/ESI-MS），結合 3D 列印技術將毛筆製作成可攜式的採樣筆，採樣筆附有溶劑槽因此可攜帶直接進行採樣，亦可當電噴灑時的輔助溶劑。因毛筆具有柔軟性，可以對不同相態的樣品進行取樣（液態、固態）不受限制。本研究又基於毛筆尖電噴灑質譜法進行改良，開發出毛筆結合脫附電噴灑游離法，改良採樣筆需將毛筆上的毛剪下套上塑膠套環再放入透過 3D 列印出的裝置。選擇直接使用市售水彩筆直接採樣，採樣前沾取有機溶劑，直接刷取分析物表面後，將水彩筆直接放置於電噴灑游離源與質譜入口中間，利用電噴灑游離源釋放出的帶電離子與筆上的分析物結合，透過電場差異將分析物離子帶入質譜儀進行分析。此方法可減少採樣筆製作的時間，亦可保留毛筆尖採樣不受形態限制的優點，達到快速有效的質譜分析。 3.

(12) 1-3 分析物介紹. O H3C. N. N. O. CH3. Caffeine N. N. Molecular Weight = 194.13. CH3. O H3C. O. N. N N H. O. CH3. N. 84% 副黄嘌呤. H3C. N. O. O H N. N. N. CH3. 4% 茶鹼 Molecular Weight = 180.164 圖 1-1 咖啡因及人體代謝產物. 4. N. HN O. CH3. N. N. CH3. 12% 可可鹼.

(13) 咖啡因咖啡因分子與人體內的腺嘌呤核苷類似，腺嘌呤核苷與受器結合後可以減緩神經細胞的活動，一般在睡眠時會結合，而兩者因為結構相似可接合在同一個受器上。但是不同的是咖啡因分子與受器結合後，不會使細胞活動降低，反而因為阻止了腺嘌呤核苷受器結合，使得神經細胞分泌腎上腺素導致心跳加快、血壓增高。因此歐. 盟食品科學專家委員會評估，咖啡因每日攝取量最好在 300 毫克以下，對健康不致於造成影響。雖然咖啡具有提神效果，但攝取過量咖啡因，會使人有失眠、心悸、焦躁不安、頭痛等症狀，長期飲用含有咖啡因的飲品易產生心理依賴，當停用咖啡因時亦可能出現戒斷症狀。依衛生福利部食品藥物管理署的公告，規定生產者須標示咖啡因含量，以利消費者可以依照需求進行選擇。 1. 現煮咖啡 - 標示「紅、黃、綠」標誌具營業登記之連鎖飲料、連鎖便利商店及連鎖速食業者販售現煮咖啡，應於販售場所明顯處標示，或張貼紅黃綠符號、圖樣。紅色：表示每杯咖啡的咖啡因總含量為 201 毫克以上。黃色：表示每杯咖啡的咖啡因總含量介於 101~200 毫克。綠色：表示每杯咖啡的咖啡因總含量為 100 毫克以下。 2.. 包裝飲料咖啡 - 每 100 毫升所含咖啡因每 100 毫升所含咖啡因大於或等於 20 毫克，標示每 100 毫升所含咖啡因之毫克數。每 100 毫升所含咖啡因低於 20 毫克，標示「20 mg/100mL 以下」。每 100 毫升所含咖啡因等於或小於 2 毫克，則標示「低咖啡因」取代「20 mg/100mL 以下」。. 3. 即溶小包裝咖啡以每一包食用份量所含咖啡因總量（毫克）為標示方法。 5.

(14) 咖啡因代謝物咖啡因在肝臟中發生代謝反應，由細胞色素 P450 氧化酶（特別是 1A2 同工酶）酶系統氧化，形成三個同分異構物的二甲基黃嘌呤，這三個二甲基黃嘌呤對身體有不同的作用。 1. 副黃嘌呤（1,7-二甲基黃嘌呤，84%）- 能夠加速脂質溶解，導致血漿中的甘油及自由脂肪酸的含量增加。 2. 可可鹼（12%）- 會增加尿量，擴張血管。可可鹼亦是可可豆中主要的生物鹼，同時也存在於巧克力中。 3. 茶鹼（4%）- 能夠舒緩支氣管平滑肌，被用作治療哮喘。治療所用的量遠大於由咖啡因代謝所產生的。這些化合物會再進一步代謝，最終透過尿液排泄出體外。. 6.

(15) 1-4 咖啡煮法美式咖啡利用手沖式滴漏或常見滴漏式美式咖啡機沖煮出來的黑咖啡，通稱為美式咖啡，水溫 85-95℃之間，咖啡與水比例約為 1:10 到 1:30 之間，沖泡方式簡單、方便，器材需求也較低，是自行沖泡最常選擇的方式。. 義式咖啡義式咖啡是以高溫、高壓的方式淬取出濃縮的咖啡，由於「高壓」是義式咖啡必要的條件，因此必須要有設備才能達成，咖啡和水的比例依使用的機器的條件不同，約介於 1:4 到 1:10 之間。. 7.

(16) 第二章. 分析方法及原理. 2-1 液相層析電噴灑質譜儀 (LC/ESI-MS) 層析法是普遍常見，可分離純化複雜的混合物的方法。以層析系統的動相來做分類，主要有氣相層析與液相層析等，而液相層析用於純化大部分的化合物。液相層析與氣相層析有各自的優缺點，液相層析發展比較複雜，關鍵是液相層析中移動相和固定相皆有作用，不像氣相層析的移動相對分離沒有任何作用，只負責攜帶樣品通過固定相。液相層析的主要原理是透過分子間作用力將混合物進行分離，透過移動相 (mobile phase)與固定相 (stationary phase)的交互作用力。當混合物進入層析系統時，會因為各個分子的化學特性不同，因而影響化合物在層析管柱內流動的快慢，利用各化合物不同的移動速率離開管柱時間將會有所不同來達成分離的效果。液相層析質譜儀對於分子量大、有極性、不易揮發、熱不穩定性的化合物有很好的靈敏度跟選擇性。1986 年 Tal’roze 等人開發出將液相層析與質譜儀結合的技術，利用液體直接導入（direct liquidintroduction, DLI）的方法，與電子游離法（electron impact ionization, EI）、化學游離法（chemical ionization, CI）…等等質譜游離法做結合。然而目前液相層析質譜儀上最普遍使用的游離進樣方法為 1984 年 J.B. Fenn 等人開發出的電噴灑游離法（electrospray ionization, ESI）[53]，是常見的軟性游離法，可使熱不穩定分子游離，亦不會破壞分子結構，游離時可使分析樣品形成帶多價電荷的離子，大大的增加分析質量的動態範圍。. 8.

(17) 2-2 電噴灑質譜法的發展史. 1917 年. 1968 年. J. Zeleny 等物理學家將乙醇通入微米尺寸的毛細管並施加高電壓，發現在毛細管尾端出現微小液滴噴灑的現象，這是首次電噴灑現象被提出。早期主要用在工業技術上[54] M. Dole 等美國科學家成功將電噴灑技術運用在化學領域上，利用電噴灑游離法量測到玉米膠質與溶菌脢，但因當時的偵測器為法拉第杯，只能偵測到電流訊號，無法證明電噴灑的離子帶有多價電荷[55-56]。. 1984 年. M. Yamashita、J. B. Fenn 等耶魯大學科學家首次將電噴灑游離法與四極柱質譜儀進行結合，因此證明電噴灑的離子帶有多價電荷 [57-58]。 M. L. Aleksandrov 等人將液相層析儀串聯電噴灑質譜儀，可同時分離與離子分析[59]。. 1987 年. J. D. Henion 等人將電噴灑游離改良成離子噴灑（ion spray）[60]。 R. D. Smith 等人將毛細管電泳與電噴灑質譜儀進行結合[61]。 J. B. Fenn 等人透過電噴灑游離質譜法測到高分子聚合物 PEG，得. 1988 年. 1992 年. 1994 年. 到最高電荷帶 23 價的正電荷離子訊號。同年在蛋白質中測得最高電荷帶 45 價的正電荷離子訊號，讓電噴灑游離質譜法開始使用於生化分子的分析上。 R. D. Smith 等人對電噴灑游離源的毛細管進行改良，將內徑縮小至 1~3 μm，測得更穩定的離子訊號亦能增加靈敏度[62]。 M. Mann 等人運用理論計算得到與 R. D. Smith 的實驗結果相同，而當時稱使用內徑小於 1μm 的毛細管進行電噴灑的裝置為 nanospray。發現靈敏度居然比一般電噴灑游離法還要來得高，所需要的樣品量很少，溶劑流速也較低，而後廣泛運用於微量生化分析。[63-64]. 2004 年. 2006 年. R. G. Cooks 研究團隊利用帶有電荷的溶劑液滴進行離子化，再打在分析樣品表面，樣品表面被溶劑液滴溶解後脫附，經碰撞產生樣品離子，此方法稱為脫附電噴灑游離法（desorption electrospray ionization, DESI）。國立中山大學謝建台教授開發了電噴灑輔助雷射脫附游離法（electrospray-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, ELDI-MS）以雷射能量使樣品分子脫附後，將樣品分子以氣相導入以溶劑電噴灑的區域中，讓樣品分子與帶電溶劑反應然後離子化[67]。 9.

(18) 2010 年. R. G. Cooks 研究團隊提出了利用紙片進行電噴灑游離的方法（paper-spray ionization）。將樣品滴在三角濾紙片上，並於紙片上施加高電壓，不用輔助氣流即可直接電噴灑游離分析。. 2012 年. 國立台灣師範大學林震煌教授開發了可快速切換紙片電噴灑游離 (paper-spray-MS)和毛細管電泳分離質譜 (capillary electrophoresis-mass spectrometry, CE-ESI-MS)技術。假如樣品較為複雜，可先利用毛細管電泳做分離，再進行質譜分析。若樣品較為簡單，可直接使用紙片電噴灑游離法進行分析[68]。國立台灣師範大學林震煌教授開發類似紙片電噴灑的竹筆尖電噴. 2013 年. 2014 年. 灑質譜法(nib-spray/ESI-MS)，將三角型濾紙換成具有順向性的竹筆尖，利用其本身的順向性以及毛細現象，使樣品滴在竹筆尖上時可較濾紙更加快速的離子化並噴灑至質譜儀，不但可減少偵測時間也有助於提高離子化效率，而提高偵測靈敏度以及分析物的訊號強度。[65-66] E. Verpoorte 等人結合了利用 3D 印表機印製裝置結合紙片電噴灑，透過印製裝置的溶劑槽，將紙片上的樣品緩慢沖提出來，並可在溶劑槽加入不同溶劑，直接萃取紙片上的樣品。[74] R. N. Zare 等人利用蓋玻片當作載台，對載台施加電壓，進行電噴. 2015 年. 2017 年. 灑游離。因蓋玻片不會與樣品反應，而將反應物滴在蓋玻片上，再將催化劑滴在反應物上進行反應，透過邊反應邊進行電噴灑游離進入質譜儀分析，此方法可看到進行反應過程中產生的過渡產物的荷質比，成功將無機催化反應與質譜儀進行結合。[75] 國立台灣師範大學林震煌教授發表了毛筆尖電噴灑游離法 (brush-spray/ESI-MS)，將採樣與游離源進行結合。利用毛筆的柔軟性製作成採樣筆，可對樣品進行採樣後，直接接上通有高電壓的針尖進行游離分析[69]。. 10.

(19) 2-3 電噴灑游離化方法及原理 1991 年 Kebarle 等人提出電噴灑游離理論，主要為以下三大部分：(1) 霧化（nebulization） (2) 去溶劑（desovation） (3) 游離化（ionization）（1）霧化：形成帶電液滴分析物溶在溶劑中通入有施加高電壓的毛細管內，在出口處產生強大的電場，因為電場的影響正負電荷會呈現分離的現象。若施以正電壓，帶正電荷的離子會因受電場斥力而往電位較低的出口處聚集，而反之負電荷會受電場吸引而附著在毛細管壁上。正電荷大量聚集於毛細管出口時，液珠表面會累積大量正電荷，當庫倫斥力大於表面張力時，出口處溶液會形成泰勒錐，突破泰勒錐後會噴灑出微小液滴形成霧化。（2）去溶劑：電噴灑溶劑分裂、揮發過程從毛細管出口噴灑出的微小帶電液滴會一直受到電場影響，被質譜入口的低電位吸引，往質譜口移動。但在飛行過程中會因為有機溶劑揮發，使得液滴體積越變越小，電荷密度上升，當電荷間的庫倫斥力大於液滴的表面張力，會使液滴為了達到平衡進而產生庫倫爆炸（Columbic explosion），形成更微小的液滴，在到達質譜入口前會不斷反覆反應，使得到達質譜口時因多次分裂除去溶劑只剩下分析物離子。（3）游離化：形成氣相離子的過程主要有兩個理論來解釋游離化形成氣相離子的過程。（a）離子揮發理論（ion evaporation model, IEM） B. A. Thormson 跟 J. V. Iribame 等人利用過渡狀態理論 (transitation state theory) 作為背景，說明氣相離子並非是在溶劑完全揮發後才形成，是形成帶電液滴在飛行至 11.

(20) 質譜入口的途中，因為不斷的發生溶劑揮發與庫倫爆炸，當液滴縮小至 10~20 nm 時，內部電荷不穩定為了平衡斥力達到新平衡，液滴中的分析物會因電荷斥力轉化成氣相離子。通常用來解釋小分子分析物。. （b）電荷殘留理論（charge residue model, CRM） M. Dole 等人提出當帶電液滴在飛往質譜口的過程中，不斷的產生溶劑揮發與庫倫爆炸，當溶劑完全揮發，無法再進行分裂時，原本在液滴上的電荷會轉移到分析物上，使分析物形成帶電荷的氣相離子。通常用於解釋大分子化合物。. 12.

(21) 2-4 藥物代謝藥品對人體來說為異物，人體服用藥物之後，會進入胃釋放主要成分，在跟隨胃中其他東西一起進入小腸。小腸的表面積較胃大，因此藥物分子會透過小腸吸收進入血液，經由血液流動遍布於全身，經由靜脈進入肝臟進行分解代謝。藥物代謝[71-74]定義為藥物的化學結構與酵素進行催化反應而產生變化。酵素是生物中具有化各種反應的功能分子。藥物經由服用後，都會被代謝至某種程度。藥物代謝被視為大多藥物在人體內消失的最主要方法。一般來說代謝物會比原藥物更有極性，因此能容易排出體外。藥品的代謝是經由血液循環至全身，因此實驗選擇用透過皮膚採樣，採樣選擇較薄的皮膚，容易測得血管擴散的部位，並挑選平常不易接觸到的皮膚來進行採樣。. 13.

(22) 第三章. 儀器、藥品與實驗方法. 3-1 毛筆尖電噴灑游離質譜法 (brush-spray/ESI-MS) 毛筆尖電噴灑游離法是近年來常壓游離法研究不斷推陳出新，因此改良紙片電噴灑游離法進而開發出來的新游離法。將通有高壓電的針尖與毛筆尖結合，以甲醇作為鞘流溶劑輔助噴灑，因高電壓使甲醇溶劑帶電、揮發達成離子化的目標。將採樣筆當游離化載台用，樣品以微量吸量管滴在毛筆尖端，使樣品快速游離化並噴灑進入質譜儀。採樣筆亦可直接採樣，將採樣筆於代測物表面反覆刷取進行採樣，再將筆直接接上接有高電壓的針尖，進行電噴灑游離分析，圖 3-1 為實際實驗圖。. 14.

(23) 圖 3-1 毛筆尖電噴灑游離質譜法實際裝置圖. 15.

(24) 3-2 毛筆脫附電噴灑游離質譜法本研究是將毛筆尖電噴灑作改良，開發出毛筆尖脫附電噴灑質譜法，毛筆尖電噴灑每次採樣上機後都需先調整位置，位置會因不同之採樣筆而有所不同。為了改良此問題，選擇使用市售的水彩筆進行實驗，先將毛筆沾取揮發性有機溶劑，再將潤濕後的毛筆反覆刷取代測物表面數次進行採樣，在溶液揮發完之前將毛筆放置於毛筆架將毛筆鎖在裝置上，電噴灑游離源與質譜入口的中間，利用電噴灑游離源噴灑出的帶電液滴與毛筆上的代測物結合，使分析物形成分析物離子，透過輔助氣體將分析物帶至質譜口進行分析，實驗裝置示意圖如圖 3-2。本實驗所使用的水彩筆為尼龍毛製編號為 000 是畫筆中編號最小的，毛長為 0.7 mm，毛寬為 1.5 mm，一隻筆大約有 300 根毛，每一根毛大約為 50~55 μm。. 16.

(25) +. +. + +. + + +. +. ESI plume. MS inlet. 圖 3-2 毛筆脫附電噴灑游離法實驗裝置示意圖. 17.

(26) 3-3 儀器及周邊設備列表 Spray 相關儀器名稱. 廠商. 型號. mass spectrometer. Thermo Finnigan. LCQ Deca XP Plus. 迴轉泵. EDWARDS. EM30. 其他相關儀器及耗材. GC. Agilent HP. 6890. mass spectrometer. Agilent HP. 5972. 桌上型電子顯微鏡. Hitachi. TM3030. 智慧型半微量天平. Sartorius. MSA125P-100-DA. 18. 示意圖.

(27) 超音波洗淨器. BRANSON. 3510. 智慧電動移液器. Sartorius. 735061. Research. 微量吸量管. Eppendorf. 毛筆. Renoir C10 RESABLE PRO. 000. 磨豆機. BRAUN. KSM2. 咖啡機. BRAUN. KF400. micropipet. 19. 100-1000 μL 10-100 μL 0.5-10 μL.

(28) 3-4 藥品列表類別. 藥品名稱. 來源. 分子量. 化學式/結構式. Coffee bean 咖啡豆. coffee shop (Arabica, Brazil). -. C8H10N4O2. 分析物. O. H3C. Caffeine 咖啡因. Hayashi Pure. 194.19 g/mole. Chemical. N. N. N. O. N CH3. 溶劑. Methanol 甲醇 99.9%. Merck. 32.04 g/mole. Ethanol 乙醇 96%. J.T backer. 46.07 g/mole. 20. H3C H3C. CH3. OH. OH.

(29) 3-5 人體採樣前處理及採樣方法本實驗以市售尼龍毛水彩筆對眼皮與耳朵進行採樣，觀察長時間的藥物代謝。人體採樣觀察藥物代謝實驗步驟： (1) 首先將買來的市售毛筆，泡入乙醇利用超音波震盪反覆震洗，至毛上無染料析出。 (2) 實驗前先將市售咖啡豆經由磨豆機研磨後，把磨細的咖啡粉放置美式咖啡機中，加入 200 ml 的水進行沖泡。濾紙及煮咖啡時會有水分消耗，因此沖泡出來的咖啡為 155ml。 (3) 每次研磨沖泡咖啡後，取 1 mL 利用 GC/MS 進行定量。 (4) 實驗時以乙醇潤濕毛筆後，反覆刷取眼皮或耳朵表面進行採樣。 (5) 喝下咖啡的前 10 分鐘，先以毛筆採樣分析一次。 (6) 喝下咖啡後每 10 分鐘採樣分析一次，持續 180 分鐘。 (7) 每次採樣完後更換乾淨乙醇，將毛筆泡入後放置超音波震盪震洗 30 分鐘。. 21.

(30) 第四章. 結果與討論. 4-1 毛筆尖脫附電噴灑最佳化 4-1-1 毛筆距離質譜口位置本實驗對於毛筆放置的位置對訊號的影響進行探討，利用本實驗的結果可以知道在哪個位置有最穩定最強的訊號，以此進行接下來的實驗。在質譜口與電噴灑游離源涵蓋的範圍約 1.2 mm2 的矩形範圍內，緩慢調整 X 軸與 Y 軸位置，觀察訊號強度的變化。. 實驗步驟將毛筆沾取 10 μg/ml 的咖啡因溶液（溶劑為甲醇），輔助氣體為氮氣，輔助溶劑為甲醇，將毛筆放置於質譜口與電噴灑游離源的中間，如圖 4-1 所示，以旋鈕調整 X、Y 軸位置，調整以找出訊號值最好的位置。. 實驗結果經由位置移動後，將離子訊號強度與 X、Y 平面作圖，如圖 4-2 所示，發現在垂直距離質譜口 3 mm 的位置與水平距離質譜口 1.5 mm 的位置有最好的訊號值。毛筆須放置較接近電噴灑游離源而距離質譜入口較遠有最好訊號值，推測可能是因為如果距離電噴灑游離源太遠形成的離子數會下降，而且因有輔助氣體將離子吹出毛筆，因此毛筆可以不用很靠近質譜入口。接下來的實驗皆會固定以此位置進行。. 22.

(31) Y 軸旋鈕. X 軸旋鈕. 圖 4-1 本實驗使用的實際實驗裝置圖. 23.

(32) 圖 4-2 毛筆位置與訊號強度. 24.

(33) 4-1-2 乙醇揮發本實驗是利用毛筆沾取乙醇後刷取人體皮膚，為了確定在沾完乙醇後需要在多少時間內完成實驗，因此對毛筆一次沾取的乙醇含量與揮發所需要的時間進行觀察。. 實驗步驟先將乾燥毛筆放入天平進行秤重，取得空筆重量。接下來將毛筆放入乙醇溶液中，吸滿溶劑後拿出馬上放置天秤上進行秤重，如圖 4-3 所示，利用手機記錄隨時間變化乙醇重量在毛筆上的含量變化，每分鐘記錄一次重量。. 實驗結果每分鐘記錄的重量 – 毛筆空筆重 = 每分鐘乙醇在毛筆上含量根據本實驗結果如圖 4-4 得知毛筆一次沾取乙醇的量為 6 mg 左右。前 4 分鐘揮發速率較快，第 5 分鐘時乙醇含量只剩 1 mg 左右，5 分鐘後揮發速率會趨於平緩，在 27 分鐘會完全揮發完畢，由於前 4 分鐘揮發速率較快，因此實驗皆會於三分鐘內結束，以避免分析物在移動至儀器過程揮發掉。. 25.

(34) 圖 4-3 乙醇揮發秤重實際實驗圖. 26.

(35) 8. weight (mg). 6. 4. 2. 0 0. 10. Time (min). 20. 圖 4-4 乙醇揮發實驗結果. 27. 30.

(36) 4-1-3 不同支毛筆的再現性利用此實驗對於不同支毛筆採樣進行觀察，測試是否會因為不同支毛筆而產生明顯的實驗誤差，進而影響實驗結果。實驗步驟準備十隻乾燥毛筆，分別沾取 10μg/mL 的咖啡因溶液，再放置於裝置上進行質譜儀偵測。實驗結果對 10 支毛筆進行測試，所得到訊號值的結果平均為 1.19x105，如表 4-1 所示。其中 4、6、7、10 號的毛筆測得的訊號值較為接近。因為市售毛筆雖然規格固定，在製作上還是會有誤差，可能有些筆毛量較多有些筆毛量較少，筆毛長度也會有些微誤差，所以在實驗沾取相同濃度的溶液時，每支筆吸附的量也會有所不同，因此實驗結果所得的訊號值會有些差異。. 28.

(37) 次數 Ion intensity. 1 1.62E+05 7 8.22E+04. 2 5.84E+04. 3 2.42E+05. 8 4.93E+04. 9 1.49E+05. 4 8.82E+04. 5 2.13E+05 平均. 10 7.20E+04. 1.19E+05. 表 4-1 十隻毛筆沾取咖啡因溶液的訊號強度. 29. 6 7.79E+04 標準差 6.44E+04.

(38) 4-2 罐裝咖啡--咖啡因代謝實驗以一般市售罐裝咖啡並使用自製採樣筆來進行實驗，分別於早上 9:30、下午 14:00、晚上 17:30 喝下咖啡，持續監測 180 分鐘。透過實驗可以觀察咖啡因在人體中早、中、晚代謝時間的差異。. 實驗步驟本實驗利用毛筆尖電噴灑質譜法來進行，準備 4 隻採樣筆，先將以乙醇潤濕。以採樣筆反覆刷取眼皮 10 次後，將採樣筆直接上機調整好位置後，進行質譜分析。喝咖啡前 10 分鐘先採樣一次，記錄人體背景值，喝咖啡後每 10 分鐘採樣一次，持續採樣 180 分鐘。每次採樣完都將採樣筆放入更換過乙醇的樣品瓶，放入超音波震盪進行震洗，以避免殘留影響下次採樣分析。. 實驗結果透過 SIM 模式與 Full Scan 模式進行質譜分析，在全掃描模式下，在代謝產物出現時可以看到很明顯的咖啡因訊號，如圖 4-6 所示。將早上、下午、晚上所得的實驗結果作圖得到圖 4-5，整理咖啡因代謝訊號產生的時間如表 4-2，觀察發現人體早上的代謝速率較快，於 62 分鐘左右會代謝出現訊號，而下午需要 90 分鐘才可以看到代謝訊號，人體晚上的代謝速率緩慢， 127 分鐘才會出現代謝訊號。市售咖啡雖然包裝有標示咖啡因含量，但是裡面還有添加一些其他的物質，而且市售咖啡咖啡因含量都偏低，實驗時無法看到經由人體代謝反應後的代謝物訊號，使用採樣筆採樣上機後須先調整位置在進行質譜分析，每支筆會因為製作方式不同而有位置的不同，在調整位置時溶劑也一直在揮發，所以進行質譜分析時訊號誤差較大。 30.

(39) Caffeine 3.50E+04. 喝下咖啡的時間點 3.00E+04 90 min. Ion intensity. 2.50E+04 2.00E+04 1.50E+04. 62 min 127 min. 1.00E+04 5.00E+03. 0.00E+00 09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00. time. 圖 4-5 罐裝咖啡-受試者 A 咖啡因代謝. 31.

(40) 人. 時間早. 午. 晚. 62 ± 4.3min. 90 ± 0 min. 127 ± 8.3min. 部位受試者 A. 眼皮. 表 4-2 受試者 A 喝罐裝咖啡結果. 32.

(41) 1.2E+05 Caffeine. 1.0E+05. Ion intensity. 8.0E+04 6.0E+04 4.0E+04 2.0E+04 0.0E+00 150. 160. 170. 180 m/z. 圖 4-6 咖啡因代謝全掃描質譜圖. 33. 190. 200.

(42) 4-3 研磨咖啡豆—咖啡因代謝實驗因市售的罐裝咖啡中咖啡因濃度較低，或多或少有加入一些其他添加物，為了更進一步測試是否可以看到咖啡因經由人體代謝後的產物，選擇購買咖啡豆自行研磨沖泡進行實驗。每次沖泡咖啡後取 1 ml 的咖啡稀釋，以 GC/MS 進行定量，一杯 155 ml 的咖啡約含有 210 mg 左右的咖啡因。. 實驗步驟本實驗利用毛筆脫附電噴灑質譜法來進行，與之前實驗相同準備 4 隻水彩筆，先將以乙醇潤濕。以毛筆反覆刷取眼皮 10 次後，將毛筆直接上已經調整好 X、 Y 軸距離的儀器裝置，進行質譜分析。每次實驗前都現磨咖啡豆進行沖泡，再將沖泡完 155mL 的咖啡取 1mL 過濾稀釋，利用 GC/MS 進行定量分析。喝咖啡前 10 分鐘先採樣一次，記錄人體背景值，喝咖啡後每 10 分鐘採樣一次，持續採樣 180 分鐘。每次採樣完都將採樣筆放入更換過乙醇的離心管，放入超音波震盪進行震洗，以避免前次採樣殘留影響下次採樣結果。. 實驗結果利用 GC/MS 定量每次喝下咖啡的咖啡因含量，以確定每次喝下的咖啡咖啡因含量，用檢量線（圖 4-7）進行定量，推算出平均每次喝下的咖啡因含量為 210.49 ± 43.10 mg。透過定量分析以確定每次喝下的咖啡，咖啡因含量不會相差過大，確保在實驗過程不會因咖啡因含量差異太大導致實驗無法順利測得。. 34.

(43) 9.00E+05 8.00E+05. Ion intensity. 7.00E+05 6.00E+05 5.00E+05 4.00E+05. 3.00E+05 2.00E+05. y = 16766x - 19053 R² = 0.9987. 1.00E+05 0.00E+00 0. 10. 20. 30. 40. conc. (μg/ml) 圖 4-7 GC/MS 定量檢量線. 35. 50.

(44) 4-3-1 不同人體部位採樣實驗結果不同部位採樣測試者為受試者 A，受試者 A 是個不喝咖啡、不常運動者。採樣部位為眼皮及耳朵進行比較，由於藥物代謝是經由血液運輸，因此選擇此兩個部位是因為眼皮為人體最薄的皮膚，而耳朵的皮膚上可以清楚看見很多微血管分布，亦是人體上較薄的皮膚。觀察兩個部位採樣分析後所得到的訊號，發現眼皮採樣的訊號除了在代謝物產生最高訊號時，其他時間訊號都較為平穩，如圖 4-8。相較耳朵採樣，雖然能看出代謝物產生最高訊號的時間，但在其他時間訊號波動幅度稍大，如圖 4-9 所示。因為此結果接下來的其他受試者皆選擇以眼皮進行採樣。圖 4-10 為受試者 A 在咖啡因代謝訊號最強時的全掃描質譜圖，根據此圖可明顯看出咖啡因代謝訊號，比喝罐裝咖啡使用採樣筆進行採樣的離子訊號值更高，而且亦可以觀察到咖啡因經由人體代謝的產物訊號。. 36.

(45) Caffeine. Caffeine metablites. 3.50E+04 喝下咖啡的時間點 3.00E+04 88 min. Ion intensity. 2.50E+04 2.00E+04 1.50E+04. 118 min. 58 min. 1.00E+04 5.00E+03 0.00E+00 09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00. time 圖 4-8 受試者 A 眼皮咖啡因代謝. 37.

(46) Caffeine. Caffeine metablites. 2.50E+04 喝下咖啡的時間點 2.00E+04 57 min. Ion intensity. 87 min. 117 min. 1.50E+04. 1.00E+04. 5.00E+03. 0.00E+00 09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00. time 圖 4-9 受試者 A 耳朵咖啡因代謝. 38.

(47) 3.00E+05 Caffeine. Ion intensity. 2.50E+05 2.00E+05 Caffeine metabolites. 1.50E+05 1.00E+05 5.00E+04 0.00E+00. 160. 170. 180. 190. 200. 210. m/z 圖 4-10 眼皮咖啡因代謝全掃描質譜圖. 39. 220.

(48) 4-3-2 不同人對咖啡因及代謝物採樣. 實驗條件除了受試者 A 喝咖啡進行實驗外，想知道此方法對其他人是否也可行，因為找了兩位受試者進行採樣分析。受試者 B 是經常喝咖啡、不常運動者，而受試者 C 是每天至少喝一杯咖啡、經常運動者。因為受試者 B 與 C 是經常喝咖啡者，如果是早上或下午進行喝咖啡採樣代謝物分析實驗，為了怕一大早喝的咖啡會干擾實驗採樣，所以實驗當天早上不會先喝過再進行，而晚上的實驗則因距離早上喝咖啡時間較久因此不會受到影響。. 實驗結果受試者 B 對於咖啡因及代謝物早上代謝所需時間為 50 分鐘，下午代謝時間為 85 分鐘，而晚上則為 110 分鐘，圖 4-11。受試者 C 對於咖啡因及代謝物早上代謝所需時間為 30 分鐘，下午代謝時間為 75 分鐘，而晚上則為 100 分鐘，圖 4-12。後面有對三位受試者代謝時間的結果進行比較與討論。. 40.

(49) Caffeine. 2.50E+04. Caffeine metablites. 喝下咖啡的時間點 110 min. 2.00E+04. Ion intensity. 50 min. 1.50E+04 85 min. 1.00E+04. 5.00E+03. 0.00E+00 09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00. time 圖 4-11 受試者 B 眼皮咖啡因代謝. 41.

(50) Caffeine. 5.00E+04. Caffeine metablites. 喝下咖啡的時間點. 4.50E+04 4.00E+04. Ion intensity. 3.50E+04. 30 min. 3.00E+04 2.50E+04. 100 min. 2.00E+04 1.50E+04. 75 min. 1.00E+04 5.00E+03 0.00E+00 09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00. time 圖 4-12 受試者 C 眼皮咖啡因代謝. 42.

(51) 4-3-3 三位受試者的實驗整理將實驗結果整理成表 4-2、表 4-3，經由實驗發現，不喝咖啡、不常運動的 A 對咖啡因代謝時間都比其他兩位受試者花費較多的時間。常喝咖啡但不常運動的 B 對咖啡因的代謝能力比 A 稍微好，但是差異並沒有很明顯。然而常運動又經常喝咖啡的 C 對咖啡因的代謝能力最好，比 B 與 A 快非常多，尤其是早上代謝時間差異很明顯。因此推測經常運動者對藥物代謝能力會比較好，而經常服用同樣藥物者會使此藥品排出體外的時間比不常吃此藥物者快。由三位受試者的結果發現，人體早上的代謝速率最快，下午次之，晚上則是最慢的。又對三位受試者每次刷到的咖啡因代謝物最高訊號值與標準品訊號進行比較換算，發現經由人體代謝後可刷取到的咖啡因含量約為 6 ~ 25μg，如表 4-3。. 43.

(52) 人. 時間早. 午. 晚. 部位眼皮. 58 ± 4.3 min. 88 ± 4.3 min. 118 ± 4.3 min. 耳朵. 57 ± 4.7 min. 87 ± 4.7min. 117 ± 9.4 min. 受試者 B. 眼皮. 50 ± 0 min. 85 ± 5min. 110 ± 0 min. 受試者 C. 眼皮. 30 ± 0 min. 75 ± 5 min. 100 ± 10 min. 受試者 A. 表 4-3 三位受試者時間比較結果. 44.

(53) 人. 時間早. 午. 晚. 部位眼皮. 7.0 ± 3.58 μg. 20.0 ± 10.22 μg. 17.4 ± 6.72 μg. 耳朵. 14.1 ± 2.97 μg. 19.3 ± 0.88 μg. 15.1 ± 1.13 μg. 受試者 B. 眼皮. 25.3 ± 2.85 μg. 12.8 ± 2.08 μg. 22.6 ± 0.62 μg. 受試者 C. 眼皮. 12.8 ± 8.33 μg. 5.8 ± 1.00 μg. 20.1 ± 0 μg. 受試者 A. 表 4-4 三位受試者刷到咖啡因含量比較結果. 45.

(54) 第五章. 結論. 本研究開發了一種非侵入性的人體皮膚表面採樣，降低了人體代謝採樣後處理步驟的複雜度，提供一個簡單方便，可以快速量測的一個方法，成功結合採樣與質譜進樣的方法。毛筆總重為 1.80 g，長為 17.7 cm。毛筆一次可吸附的乙醇量為 6 mg，經過 27 分鐘後會完全揮發完畢，但是前四分鐘揮發速率較快，因此實驗於 3 分鐘內會結束。接下來對於毛筆與質譜入口的距離做測試，以相同濃度與同樣參數條件之下進行位置移動，觀察不同位置的訊號強度變化情形，發現水平距離質譜口 1.5 mm 及垂直距離質譜口 3 mm 的位置，有最好的訊號條件。本研究使用於 ESI-MS 分析的新型採樣方法的開發。利用水彩筆，可以通過刷取受試者的眼皮或簡單地將分析物的溶液滴至毛筆上或者僅僅將毛筆浸入分析物的溶液中來收集分析物。本實驗利用咖啡因當人體藥物代謝測試藥品，使用本研究所開發的方法，證實此採樣方法的可行性。觀察不同受試者對咖啡因的代謝，每個人對咖啡因代謝能力有所不同，但是早上的代謝能力都優於下午及晚上，晚上則是代謝能力最緩慢的。運用此方法進行採樣分析簡單、經濟實惠、非侵入性，最低可採樣到約 6μg 的咖啡因含量，適用於監測受試者長時間產生的代謝產物。. 46.

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(61)

(62) No.67. 研習證明 Certificate of Attendance 茲證明張凱茵君完成國立臺灣師範大學研究倫理中心之 2 小時研究倫理線上教育訓練課程 ( 含學習測驗及格 0.5 小時 )。中華民國 106 年 2 月 8 日主題社會與行為科學的研究倫理與. 講者國立臺灣師範大學健康促進與衛生教育學系暨研究倫理審查委員會主任委員. 貝蒙報告. 李思賢特聘教授. We hereby certificate that Kai-Yin Chang has completed the 2-hour Research Ethics On-Line Training Course of Center for Research Ethics, National Taiwan Normal University on 2/8/2017.. 國立臺灣師範大學研究倫理中心主任 Director of Center for Research Ethics, NTNU. 中華民國一. O. 六年二月八日.

(63) 期刊論文 1.. Development and Application of a Brush-Spray Derived from a Calligraphy-Brush-Style Synthetic Hair Pen for Use in ESI/MS Jen-Ying Liu, Pei-Chun Chen, Yea-Wenn Liou, Kai-Yin Chang, and Cheng-Huang Lin*. 2.. 毛筆尖電噴灑質譜法的開發與應用劉人瑛張凱茵劉亞汶陳姵君林震煌*. 3.. Sampling and Profiling Caffeine and its Metabolites from an Eyelid using a Watercolor Pen based on Electrospray Ionization/Mass Spectrometry Yea-Wenn Liou, Kai-Yin Chang, Sing-Han Wang and Cheng-Huang Lin*. 投稿中. 55.

(64) 研究發表研究發表 : 2016 美國化學會台灣分會研究生研討會. 發表題目：Development and application of a brush-spray/mass spectrometry Kai-Yin Chang (張凱茵), Jen-Ying Liu (劉人瑛), Cheng-Huang Lin (林震煌)* 時間 : 105 年 5 月 29 日 (日) 地點 : 國立台灣大學化學館. 研究發表 : 第二十三屆分析技術交流研討會. 發表題目：Sampling and Profiling Caffeine and its Metabolites from an Eyelid using a Watercolor Pen based on Electrospray Ionization/Mass Spectrometry Kai-Yin Chang (張凱茵), Cheng-Huang Lin (林震煌)* 時間 : 106 年 5 月 27 日 (六) 地點 : 國立中山大學理學院. 56.

(65) Mass DeveLSoPectrometr ment anD AY PPLIcatIon oF a BrusH -SPraY DerIveD From a CaLLIgraPHY-BrusH -St YLe SYntHetIc HaIr Pen For Use In ESI/MS DOI: 10.5702/massspectrometry.S0058. Vol. 6 (2017), S0058. Original Article. Development and Application of a Brush-Spray Derived from a Calligraphy-Brush-Style Synthetic Hair Pen for Use in ESI/MS Jen-Ying Liu, Pei-Chun Chen, Yea-Wenn Liou, Kai-Yin Chang, and Cheng-Huang Lin* Department of Chemistry, National Taiwan Normal University, 88 Sec. 4, Tingchow Road, Taipei 11677, Taiwan. The development of a novel type of a sampling/ionization kit for use in electrospray ionization/mass spectrometry is reported. Using a small calligraphy-brush-style synthetic hair pen (nylon-brush), and analogous to paper-spray mass spectrometry, the analytes can be collected, elution/desorption and then ionized from the surface of the nylon-brush. The body of the kit was produced by means of a commercial 3D-printer, in which ABS (acrylonitrile butadiene styrene) was used as the starting material. Meanwhile, a small nylonbrush was embedded inside a 3D-printed plastic cell, in which a solvent was supplied to rinse the brush by means of capillary action. The size and weight of the kit were 1 g and 4 cm, respectively. The kit is disposable and it has various functions, including non-invasive sampling, sample-evaporation and ionization. As a result, when a type of pesticide was selected as the test sample (dimethoate; C5H12NO3PS2), the limit of detection was determined to be 0.1 µg/mL. Collecting the pesticide from a leaf-surface (lettuce) was also successful. The process for fabricating the nylon-brush kit and the optimized experimental conditions are reported herein. Copyright © 2017 Jen-Ying Liu, Pei-Chun Chen, Yea-Wenn Liou, Kai-Yin Chang, and Cheng-Huang Lin. This is an open access article distributed under the terms of Creative Commons Attribution License, which permits use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited and is not used for commercial purposes. Please cite this article as: Mass Spectrom (Tokyo) 2017; 6(2): S0058 Keywords: calligraphy-brush-style synthetic hair pen, nylon-brush, brush-spray/mass spectrometry, 3Dprinter (Received July 21, 2016; Accepted December 30, 2016). INTRODUCTION A wide variety of ionization methods have recently been developed. Among these methods, ambient ionization mass spectrometry is in widespread use, because it is quite simple and straightforward and also increases the speed of a mass-spectrum analysis.1–11) Furthermore, since the development of ambient ionization mass spectrometry, socalled paper spray-mass spectrometry (PS-MS) has opened new insights in the field of mass spectrometric analysis and, since its debut on 2010, it has now become a quite popular and important method for use in mass spectrometry.12) Thus far, PS-MS has been applied successfully in many areas of research, including food science,13) the analysis of protein complexes,14,15) biofluid samples,16,17) the online chemical monitoring of cell cultures,18) rapid discrimination of bacteria,19) and drugs of abuse in whole blood or saliva,20–22) and even in an ambient organic analysis.23) Some novel alternate techniques based on PS-MS have also been reported, including a 3D-printed paper spray ionization cartridge/ continuous solvent supply and the rapid detection of cocaine. residues by paper spray ionization coupled with ion mobility spectrometry.24,25) Analysis of pesticide residues provides a measure of the nature and level of chemical contamination within the environment and of its persistence. However, it is often difficult to correlate pesticide residues in the environment, since demonstrating whether vegetables or fruits have been exposed to chemicals can be a difficult task. Selected sampling programs can be used to investigate the levels of pesticide in the environment and to rapidly determine the uptake of a pesticide by food chain components. In this study, dimethoate (O,O-dimethyl S-methylcarbamoylmethyl phosphorodithioate; C5H12NO3PS2), a common pesticide, was used as a test sample. We report on a combination of ambient ionization mass spectrometry and a simple sampling method that uses a calligraphy-brush-style synthetic hair pen. In general, there are two main types of brush tips: natural hair, i.e., animal hair, usually a weasel; synthetic hair, which is generally made from nylon. Herein, a commercially available calligraphy-brush-style synthetic hair pen (nylon-brush) was used and modified to fit the kit (a homemade 3D-printed plastic cell), in which a high volt-. * Correspondence to: Cheng-Huang Lin, Department of Chemistry, National Taiwan Normal University, 88 Sec. 4, Tingchow Road, Taipei 11677, Taiwan, e-mail: [email protected]. Page 1 of 4 (page number not for citation purpose).

(66) DeveLoPment anD APPLIcatIon oF a BrusH -SPraY DerIveD From a CaLLIgraPHY-BrusH -St YLe SYntHetIc HaIr Pen For Use In ESI/MS. age source can be applied. After obtaining a sample from the target surface using the nylon-brush, it can be directly used in the ESI process, immediately followed by mass spectrometric analysis. Details of the procedures for using the sampling/evaporation/ionization brush-kit and the limit of detection for dimethoate are also reported in detail.. MATERIALS AND METHODS Acetonitrile, methanol and acetone were purchased from Merck (Darmstadt, Germany). Dimethoate was obtained from Riedel-de Haen (Seelze, Germany). Analytical-grade n-dodecane was purchased from Alfa Aesar (Heysham, England). Lettuce (test sample) and calligraphy-brush-style synthetic hair pens were purchased from a local supermarket and a local art supply store (model, #8), respectively. A small bundle of synthetic pen hair (nylon) was cut to a length of 2 cm, and the resulting bundle of nylon hairs was imbedded in a piece of plastic tube (PE) to produce the nylon-brush, as shown in Fig. 1A. The seal cap (not shown), fixed cover, solvent cell (inside the body; capacity, 0.1 mL) and the body itself were fabricated by a 3D-printer, respectively. All of these parts are then combined to produce a kit that can be used in sampling and ionization. The length, diameter and weight of the finished products are 3.5 cm, 1.0 cm and 1.1 g, respectively. Before use, the kit was cleaned by ultrasonication (Branson 3510), using deionized water and then methanol, each for 15 min. The 3D-printer was purchased from GoHOT (Model, UP! Plus). The mass spectrometer (Finnigan LCQ Classic LC/MS/MS) used in this study was the same instrument that was used in our previous study.11,20–22) The mass signal was recorded under the full scan mode (m/z 100–400). An Xcalibur data system was used for data collection, and the data were converted. Vol. 6 (2017), S0058. into an ASCII text file. The capillary temperature and spray voltage were set at 200°C and 4.5 kV, respectively. The tube lens offset and capillary voltage were set at −36 and 36 V, respectively.. RESULTS AND DISCUSSION Figure 1A shows a schematic drawing of the brush-kit. As reported above, the seal cap, fixed cover, solvent cell and the body were all prepared by means of a 3D-printer. The resulting kit is economical, disposable and makes sampling easy. When the seal cap was installed, it can be used sampling for the purpose for measuring the nature and level of any type of chemical contaminant. The volume of the solvent cell for loading can hold 0.4 mL of methanol. In fact, it was possible to continuously rinse the nylon-brush, when methanol (at a rate of 6 µL/min), as an auxiliary liquid, was passed through the ESI needle. In order to investigate the sampling and ionization effect, various types of hair samples, i.e., nylon, from horse and weasel, respectively, were examined, and the findings indicated that a nylon-brush provided the most satisfactory results. This is because nylon-brush hairs are very smooth, tough and hydrophobic, which permits to ionization to occur within a very short period of time. It was found that when a 3 µL sample solution was loaded onto the brush by normal pipetting, a major peak appears during ∼0.1 sec, while a high voltage was applied. In contrast to this, when a chromatography paper was used, the ion intensity was weaker and decreased very slowly (up to ∼5 min). When vitamin B2 was selected as the test sample, the liner range of vitamin B2 was found from 0.1 to 100 ppm. Meanwhile the correlation coefficient was 0.98. The optimum ESI voltage for the procedure was also investigated. The ideal distance between the tip of the nylon-brush and the mass inlet was. Fig. 1. Upper drawing, schematic drawing of the brush-kit; bottom photo, actual situation for the mass inlet and the sampling/ionization kit used in this study. Page 2 of 4.

(67) DeveLoPment anD APPLIcatIon oF a BrusH -SPraY DerIveD From a CaLLIgraPHY-BrusH -St YLe SYntHetIc HaIr Pen For Use In ESI/MS. determined to be 8 mm. Of course, this arrangement dependents on different conditions, and the actual value would likely change, depending on the analytical parameters in use. Figure 1B (photo) shows the actual situation for the mass inlet when the sampling/ionization kit described above was used in this study. The kit is very light, so it can be held by an ordinary stainless ESI needle, in which a high voltage is applied. The ESI needle was attached to a metric XYZ translation stage, and for this reason, axial alignment was readily achieved. Figure 2 shows 4 photos of the nylon-brush when various high voltages were applied (frames a–d; 3.5, 4.0, 4.5, and 5.0 kV, respectively). It can be seen that the Taylor cone is not clear when 3.5 kV was used. It should also be noted that the 3.5 kV was applied to the ESI needle, but not to the tip of the nylon-brush. The actual voltage would be expected to be lower, but the actual value was not measured. On the other hand, when the voltage was increased to 5.0 kV, multiple Taylor cones were observed. Hence, the optimized voltage was found to 4.5 kV in this case. In Fig. 3, frame A shows a typical mass spectrum of the test sample (dimethoate) obtained using nylon-brush-spray/mass spectrometry. Herein, a 15 mL aliquot of an aqueous stock solution, which was placed in a 20 mL sample vial, contained 1.0 ppm of dimethoate. By using a micropipette, the sample solution (3 µL of the dimethoate solution) was dropped on the nylonbrush, which was then subjected to direct detection by the mass spectrometer, in which a +4.5 kV high voltage power supply was used; an auxiliary solvent was not needed in this case. An ion intensity of 4.31×105 counts was observed, in the case of the above analysis. Using the kit, it was possible to detect amounts of dimethoate as low as 3 ng (absolute weight). Meanwhile, the peaks at m/z 199 and 252 are assigned to the main fragment and [M+Na]+, respectively. The inset, in Fig. 3A bottom, shows the MS/MS spectrum of the parent ion, indicating that the peak at m/z 199 indeed was. Vol. 6 (2017), S0058. the main fragment is belong to the parent ion. The other inset, in Fig. 3A, shows a lower concentration level of dimethoate. As can be seen, a minor peak is also observed, i.e., the design of the brush-spray in ESI/MS, by using a calligraphybrush-style nylon-hair pen, was successful, even though the concentration of the analyte was extremely low. To examine the sampling effect from a “leaf surface” by the nylon-brush, a procedure that could be used to analyze pesticide residues. Fig. 2. Photos show the nylon-brush when various high voltages were applied (frames a–d; 3.5, 4.0, 4.5, and 5.0 kV, respectively).. Fig. 3. Frame A, mass spectra of the test sample (dimethoate; concentration level, 1.0 ppm; inset, 0.1 ppm) obtained by nylon-brush-spray/mass spectrometry, respectively; frame B, a nylon-brush sampling/ESI method was performed. Lettuce was selected as the test sample and the spiked concentration and volume were 1.0 ppm and 50 µL, respectively. Page 3 of 4.

(68) DeveLoPment anD APPLIcatIon oF a BrusH -SPraY DerIveD From a CaLLIgraPHY-BrusH -St YLe SYntHetIc HaIr Pen For Use In ESI/MS. on the surfaces of vegetables, lettuce was selected as the test sample. Frame B, in Fig. 3, shows the results obtained when the surface of the lettuce was swept by the nylon-brush; using methanol as the collection solvent. The spiked concentration and volume were 1.0 ppm and 50 µL, respectively. As can be seen, a very minor peak (indicated as [M+H]+) is observed and by comparing it to a blank sample, it is possible to identify it as arising from dimethoate. Furthermore, some additional peaks were also detected in this case, indicated as “*”. This indicates that some unknowns, probably some natural components associated with lettuce, were also extracted by the methanol when the nylon-brush was used. However, thus far we have not been able to identify these peaks. Thus, we conclude that the combination of brush-spray/ESI using a nylon-brush kit that was developed in this study, and ambient ionization mass spectrometry provides a new approach for efficiently collecting low levels of pesticide residues that are present on the surfaces of vegetables.. CONCLUSION The development of a novel method for nylon-brush-spray mass spectrometry by a calligraphy-brush-style nylon hair pen (nylon-brush) is described. By using a commercial 3Dprinter, an economical and disposable nylon-brush kit was successfully designed and developed. The nylon-brush kit can be used for non-invasive sampling and the collected analytes can be simultaneously evaporated/ionized when the kit is connected to an ESI needle. This method is simple and economical, and is suitable for use in the rapid screening of pesticides, since it has a high degree of sensitivity. In addition, the operating procedure is simple and an ion signal can be observed immediately. We believe this method has the potential for use in practical analyses and can also be regarded as a helpful tool for use in examining environmental samples. Further applications are currently being explored.. Acknowledgements This work was supported by a Grant from the National Science Council of Taiwan under Contract No. 103-2113-M-003-001-MY3.. REFERENCES 1) 2). 3). 4). 5). R. G. Cooks, Z. Ouyang, Z. Takáts, J. M. Wiseman. Ambient mass spectrometry. Science 311: 1566–1570, 2006. Z. Takáts, J. M. Wiseman, B. Gologan, R. G. Cooks. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science 306: 471–473, 2004. B. A. Thomson. Atmospheric pressure ionization and liquid chromatography/mass spectrometry together at last. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9: 187–193, 1998. J. Shiea, W. S. Wang, C. H. Wang, P. S. Chen, C. H. Chou. 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