3-1 酵素的基因序列、表現與純化
3-1-1 酵素的基因序列
在DNA 定序後，取得野生型與各突變株的胺基酸序列如下圖 3-1：SrtW 為 Sortase A 去除N 端 24 個胺基酸所表現的野生株(14, 16, 17)。以 SrtW 為模版做單一定點突變得到 Srt196 為 Sortase A 的 K196T 突變株，Srt165 為 Sortase A 的 D165A 突變株。為對 Sortase 進 行P94S、D160N、D165A、K196T 的點突變，本研究縮短質體長度去除 N 端 59 個胺基酸 保留有活性的區域（第60 個胺基酸 Q 至第 206 個胺基酸 K）（47）以利於點突變的疊加，
最後得到Sortase A 去除 N 端 59 個胺基酸且具有 P94S、D160N、D165A、K196T 點突變所 表現的突變株，簡稱SrtPro。
圖 3-1：Sortase A 野生型及突變株胺基酸定序表
3-1-2 酵素的表現與純化
一、Sortase A 野生株的表現與純化
Sortase A 野生株與突變株均能在胞內液中過量表現，純化後的酵素在 SDS－page 上估 測的分子量SortaseW、D165A、K196T 約 23000，如圖 3-2（A）中所示；SortasePro 約 17000，
如圖3-2（B）中所示。
maker SrtW_crude
圖 3-2：Sortase A 野生株及突變株的 SDS-page 蛋白質分子量
二、Sortase A 野生株的 MALDI-TOF 分析
蛋白質經trypsin處理後，會得到不同長度的片段，因Trypsin會水解蛋白質中所有的由 賴氨酸Lys或精氨酸Arg的羧基所構成的肽鍵，不過如果這兩個部份在C-terminal方向連接的 是proline，它就不會水解這個地方的鍵結(52)。所以經trypsin作用之後得到的片段，以 MALDI-TOF質譜儀分析，比對Matrix Science線上資料庫中Sortase A的胺基酸序列後，胺基 酸序列涵蓋度（sequence coverage MS）為54.7％，有部份重疊如下圖3-3，且其Mascot score
>52、significance threshold p<0.05如圖3-4，證實所純化的蛋白質為Sortase A。
SrtW D165A K196T
70K 70K
53K 53K
41K 41K
30K 30K
SrtPro
22K 22K
10K
(A) (B)
maker
圖 3-3：Sortase A 野生株的 MALDI-TOF 分析圖譜
圖 3-4：Sortase A 野生株的 Mascot Score
3-1-3 Sortase 野生株與突變株的分子量
以MALDI-TOF 質譜儀檢測 Sortase A 野生株與突變株的分子量，分析圖譜如附錄二所 示，得到下列結果：SrtW 的分子量為 22970.9，其理論值 23070.79，相對誤差 0.43％；D165A 的分子量為22942.0，其理論值 23026.78，相對誤差 0.37％；K196T 的分子量為 22902.4，
其理論值23043.72，相對誤差 0.61％；Srt Pro 的分子量為 16643.7，其理論值 17540.81，相
對誤差 5.11％。檢測結果符合預測的分子量，故經蛋白質純化後取得之野生株與突變株的
分子量以檢測值為準來計算對應的酵素濃度。
3-1-4 野生型酵素濃度測定
使用的蛋白質標準品為牛血清蛋白(BSA)，濃度為 10 mg/ml。將蛋白質標準品與緩衝 液混合，形成不同濃度的標準品，總體積為20μl，再加入 Bradford reagent 至 200 μl，放置 在室溫下2 分鐘，以 UV 光譜儀讀取各樣品 OD595 nm 之吸收值如表 3-1。
表 3-1、不同濃度 BSA 標準品與 OD595 之吸收值
BSA (μg) OD595 nm
0 0.332 0.4 0.35 0.8 0.373 1.2 0.4 1.6 0.414 2 0.452 3 0.513 4 0.572
根據UV 光譜儀讀取各樣品 OD595 nm 之吸收值劃出蛋白質標準品對 OD595 nm 之標 準檢量線，如圖3-5。故得到 OD595 nm 的量值（y 值）與 BSA 濃度（x 值）的關係為 y=0.0613x+0.3261（檢量公式）。
y = 0.0613x + 0.3261 R2 = 0.9966
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0 1 2 3 4 5
BSA(μg)
OD595
圖 3-5：蛋白質標準品對 OD595 之標準檢量線
取1 μl 待測蛋白質溶液，所測得對應的 OD595 吸收值如下：Srt W 為 0.4896、D165A 為0.483、K196T 為 0.443、SrtPro 為 0.3825，以內插法帶入檢量公式，可得 1μl 待測蛋白質 溶液的濃度如下：Srt W 為 2.6672 (μg/μl)、D165A 為 2.5595 (μg/μl)、K196T 為 1.9070 (μg/μl)、
SrtPro 為 0.9201 (μg/μl)，再參考 MALDI-TOF 分析儀鑑定 Sortase A 野生株與突變株的分子 量，如表3-2 所示，可得各溶液的莫耳濃度如下：Srt W 為 115.61 μM、D165A 為 111.16μM、
K196T 為 82.76 μM、SrtPro 為 51.11 μM。
表 3-2：Sortase A 野生株與突變株的濃度
1(μl) y(od) x(μg) MW (μM)
Srt W 0.4896 2.6672 23070.79 115.61 D165A 0.483 2.5595 23026.78 111.16
K196T 0.443 1.9070 23043.72 82.76
SrtPro 0.3825 0.9201 18000 51.11
3-2 野生型與突變型酵素的活性檢測
3-2-1 Sortase A 野生株的活性檢測
Sortase A 對 Abz-LPETG-Dnp 水解後，得到產物 Abz-LPET 與 G-Dnp，其 Abz-LPET 在 320 nm 的螢光激發下會有 420 nm 的波長散射，在螢光光譜儀可見螢光量值隨時間的增加 而增加，驗證Sortase A 在 pH 為 8 且常溫的環境中具有水解活性，如圖 3-7。
以LC－MASS 驗證其反應物與生成物。可見 Abz_LPETG_Dnp 荷質比 928 的訊號。被 Sortase A 水解後，也出現 Abz_LPET 荷質比 578 的訊號及 G_Dnp 荷質比 369 的訊號，如 圖3-6。
0924SrtW_ALD
Time
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00
%
0 100
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00
%
0 100
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00
%
0 100
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00
%
0 100
0924SrtW_ALD Scan ES+
369 3.93e7 9.93
29.39 12.60
0924SrtW_ALD Scan ES+
578 5.90e7 10.89
0924SrtW_ALD Scan ES+
928 6.01e7 12.54
0924SrtW_ALD Scan ES+
TIC
7.47 9.93 11.17 31.72 33.77
0924SrtW_ALD
m/z
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0 100
0924SrtW_ALD 184 (12.604) Sb (3,40.00 ) Scan ES+
1.51e7
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0 100
0924SrtW_ALD 159 (10.891) Sb (3,40.00 ) Scan ES+
9.29e6
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0 100
0924SrtW_ALD 145 (9.932) Sb (3,40.00 ) Scan ES+
5.80e6
688.2780.0794.6811.2892.0 991.3
圖 3-6：Abz_LPETG_Dnp 被 Sortase A 分解的 LC/MS 圖譜
3-2-2 水解活性與比較
固定Abz-LPETG-Dnp 濃度為 50 μM, Sortase A 野生株與突變株的濃度為均為 4 μM，由
螢光光譜儀的測量由加入酵素開始，可得到螢光值與反應時間的關係圖，如圖 3-7。（螢光
量值對時間的紀錄值，如附錄三）由圖中可見Sortase A 野生株與突變株在 120 秒內螢光值 漸漸平緩，以SrtPro（藍色線）與 D165A（粉紅色線）反應最快，SrtW（黃色線）次之，
K196T（綠色線）最差，對照組（紫色線）無酵素作用，故螢光量值未有顯著的增加。
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0 20 40 60 80 100 120
(sec)
SrtPro D165A SrtW K196T blank
圖 3-7：Sortase A 野生株與突變株水解 Abz-LPETG-Dnp 的螢光值對時間關係圖
取3～13 秒的數值作水解反應初速率的比較圖如下圖 3-8，由圖中可得到反應初速率的 斜率SrtPro 為 68.986、D165A 為 55.418、SrtW 為 21.997、K196T 為 18.665，而對照組的斜 率為2.856（野生株與突變株線型如圖例所示）。可知對Abz-LPETG-Dnp 水解反應初速率的 大小依次為SrtPro、D165A、SrtW、K196T。
y = 68.986x + 830.99
GGGGGK-FITC 荷質比為 411 的訊號（帶 2 個正電），Abz-LPETGGGGGK-FITC 質荷比為 691 訊號（帶 2 個正電），如圖 3-9。0924SrtW_reac
Time 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00
%
0 100
0924SrtW_reac Scan ES+
TIC
20.21 29.45 31.10 33.91
33.09 2.81
2.12
0924SrtW_reac
m/z
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0 100
0924SrtW_reac 211 (14.453) Sb (3,40.00 ) Scan ES+
1.21e7
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0 100
0924SrtW_reac 220 (15.070) Scan ES+
1.67e7
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0 100
0924SrtW_reac 190 (13.015) Sb (3,40.00 ) Scan ES+
1.39e7
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0 100
0924SrtW_reac 206 (14.111) Sb (3,40.00 ) Scan ES+
4.64e6
圖 3-9：Sortase A 野生型對Abz_LPETG_Dnp 與 GGGGGKFITC 的反應質譜圖
對質荷比691 訊號的分子作 MSMS 分析，得到大量的荷質比 233.1、390.2、574.9、759.3 碎片，如圖3-10。
srtW-691MSMS
m/z 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0 100
2012120605 294 (10.339) Cm (293:296) Daughters of 691ES+
3.11e5
199.1 821.4 923.6992.3
圖 3-10：生成物荷質比691 訊號的MSMS 分析 Abz-LPETGGGGGK-FITC 被 Sortase A 合成。
表 3-3：Abz_LPETGGGGGKFITC 訊號的 MSMS 分析表
MS 中的荷質比 胜肽片斷的推測 胜肽片斷的理論值分子量
227.2 PE 226
233.1 Abz-L 232
328 PET 327
390.2 FITC 390
461.9 LPET 460
560.3 Abz-LPET 560.3
574.9 PETGGGGGK-FITC 1146
619.3 Abz-LPETG 617
691.5 Abz-LPETGGGGGK-FITC 1379
759.3 PETGGGGGK 756
821.4 GGGGGK-FITC 820
923.6 TGGGGGK-FITC 921
992.3 Abz-LPETGGGGGK 989
3-2-4 接合活性的比較
Abz-LPETGGGGGK-FITC 為接合生成物，故取其中 FITC 片斷 390 的訊號峰值作為 Abz-LPETGGGGGK-FITC 的參照片斷，作 MRM 分析，如圖 3-11。在 10.39 分時檢測到 Abz-LPETGGGGGK-FITC 的產物，其 MRM 圖譜面積積分值表示產量，此面積之荷質比訊
號單純為691，表示此其產量的計算不受其它物質的干擾。
圖 3-11：Abz-LPETGGGGGK-FITC 的 MRM 分析
每隔5 分鐘所取得的 MRM 圖譜面積積分值如表 3-4(各時間點的 MRM 圖譜見附錄四)
表 3-4：每隔 5 分鐘的 Abz-LPETGGGGGK-FITC 之 MRM 面積積分值
time(min) 0 5 10 15 20 25 30 35
SrtPro 3500 13348 19205 24671 31497 40319 44820 48597 D165A 2186 12029 15367 20792 26666 34726 38345 41400 SrtW 2533 8621 14496 19839 23694 34546 35922 40010 K196T 2735 4761 9962 15316 24594 27408 35631 33243
依此表作時間對MRM 面積的關係圖，如圖 3-12。可見以 SrtPro 的接合反應最佳，D165 次之，K196T 最差。
0
斜率SrtPro 為 1358.5、D165A 為 1179.8、SrtW 為 1151.5、K196T 為 1133（各酵素的線型 如圖例所示），可知對 Abz-LPETG-Dnp 與 GGGGGFITC 的接合反應初速率的大小依次為 SrtPro、D165A、SrtW、K196T。3-2-5 野生株與突變株的活性比較討論
以SrtW 的水解初速率與水解接合初速率為基準值，可得突變株的反應初速率倍數關
係，如下表3-5，令 SrtW 的水解倍數與接合倍數為 1；SrtPro 的水解倍數為 3.14, 接合倍數 為1.18；D165A 的水解倍數為 2.52, 接合倍數為 1.02；K196T 的水解倍數為 0.85, 接合倍 數為0.98。
表 3-5：野生株與突變株的活性比較表
種類 水解反應初速率 水解倍數 接合反應初速率 接合倍數
SrtPro 68.986 3.14 1358.5 1.18 D165A 55.418 2.52 1179.8 1.02
SrtW 21.997 1.00 1151.5 1.00
K196T 18.665 0.85 1133 0.98
比較水解倍數，可知對Abz-LPETG-Dnp 的水解活性大小依次為 SrtPro、D165A、Srt W、
K196T。由接合反應初速率的接合倍數，可知對 Abz-LPETG-Dnp 與 GGGGGFITC 的接合 活性大小，依次為SrtPro、D165A、SrtW、K196T。
而D165A 的水解倍數為 2.52，接合倍數為 1.02，顯示此突變有利於 LPETG 的水解反 應，但對GGGGG 端的接合反應並無有效的改善。K196T 的水解倍數為 0.85，接合倍數為 0.98，顯示此突變雖不利於 LPETG 的水解反應，但接合反應倍數與野生株相近，故 K196T 的突變有利於GGGGGK－FITC 的結合。而 SrtPro 的水解倍數為 3.14，較 D165A 的水解倍 數2.52 為大，故推測 P94S 與 D160N 的突變點，也有利於 LPETG 的水解反應速率。
綜合以上討論P94S、D160N、D165A 能增快水解速率，有利於 LP 殘基的結合，K196T 則有利於GGGGG 殘基的結合。其中 D160N、D165A 位於 β6/β7 的螺旋上，K196T 位於 β7/β8 的螺旋上，與文獻探討中β6/β7 區域與辨認 LPXTG 中的 LP 殘基有關(35-37) ，β7/β8 區域 與GGG 的辨認有關(35, 38)的敘述相符。
在Chen, et al.(2011)的研究中(46)指出 LPETG 被 SrtPro 催化的 Kcat（最大催化速率）
為4.8、SrtW 的 Kcat 為 1.5、D165A 的 Kcat 為 2.4、K196T 的 Kcat 為 1.2，令 SrtW 的催化 速率為基準值1,則 SrtPro 的催化倍數為 3.2、D165A 的催化倍數為 1.6、K196T 的催化倍數 為0.8。以此數據與本研究相比，其相對誤差可見 SrtPro 為-1.9％、K196T 為 6.3％，如下 表3-6。而 D165A 的相對誤差雖為 57.5％，但仍證明 D165A 的突變有助於水解反應初速率 的增加。故本研究實驗結果與之相符。
表 3-6：Sortase A 水解反應研究結果之相對誤差
種類 水解倍數
（本研究）
最大催化速率
（Irwin Chen）
催化倍數
（Irwin Chen）
相對誤差％
[＝（水解倍數－催化倍 數）/催化倍數＊100％]
SrtPro 3.14 4.8 3.2 -1.9
D165A 2.52 2.4 1.6 57.5
SrtW 1 1.5 1 0
K196T 0.85 1.2 0.8 6.3
3-3 Sortase A 四點突變株之應用
在石英晶體微量天平（QCM）上修飾 LPETGLPETG 的胜肽段(53)，藉著 SrtPro 將 GGGGGK
－FITC 接合在 LPET 上，可在顯微鏡中看見有接上 GGGGGK－FITC 的區域呈現綠色螢光。
圖 3-14：SrtPro 在 QCM 上的應用示意圖
取SrtPro 濃度 50μM，GGGGGK－FITC 濃度 500μM，作用在修飾LPETGLPETG 的QCM 上反應12 小時，得到的顯微照片如下圖 3-15。可知當一端受質為固定端時，SrtPro 仍保有