1-1 蛋白質接合酵素簡介
蛋白質接合酵素可將不同的胜肽段或不同功能的蛋白質與以接合後，形成新的多功能
性蛋白質（或稱嵌合蛋白），可應用在蛋白質的研究、生化檢測或醫療上藥物傳送系統的研
究等。
以化學操作方式將不同蛋白質接合的多種方法被發表出來，如Dawson 在 2000 年提到 以化學合成方法連接不同的胜肽或蛋白質(1)、根據不同策略利用內含子做蛋白質的接合 (2)、以半胱氨酸或其它胺基酸的特殊殘基之親合性來接合(3)。但這些接合方式需要高度的 操作技術，而且容易被非相關的胺基酸殘基或蛋白質阻擋接合位置，而影響蛋白質的接合。
在生物化學操作上最常表現嵌合蛋白的方法，是設計融合的基因序列，再表現出嵌合 蛋白。但此方法常因融合基因中的組成基因序列各有其適合的表現系統與條件，故易遇到 嵌合蛋白質不易表現、大量表現但表現在涵包體、或表現在溶解態卻因折疊不正確而無活 性的狀況出現(4)。
為避免融合基因的表現限制，在其組成基因中各加入特殊蛋白質序列的基因，讓組成 基因能在原本的表現系統與條件中表現且保持原正確的構形，再透過蛋白質間特殊的序列
（N 端為 LPETG，C 端為 GGGGG），讓轉譯後的蛋白質經酵素Sortases 作用而互相連接以 形成新的嵌合蛋白質(5, 6)。
Sortases 是在革蘭氏陽性菌中發現的半胱氨酸轉移胜肽酶，依其辨認序列的同源性及 功能性可分為四種類型，分別為Sortase A、SortaseB 、SortaseC 、SortaseD，如下圖 1-1(7, 8)。Sortase A 透過 LPXTG（Leucine-Proline-X-Threonine-Glycine; X 為任意胺基酸）的特殊 序列，能催化表面蛋白與細菌細胞壁的共價連結，此反應與細菌粘附、免疫反應、細菌感 染，或噬菌體結合的受體功能有關(9)。Sortase B 透過 NPQTN 的特殊序列，讓細菌能獲得
鐵離子(10)。Sortase C 透過 LPXTG 的特殊序列催化細菌表面鞭毛的形成(11)。Sortase D 透 過LPNTA 的特殊序列與孢子的形成有關(9, 12)。
圖 1-1：Sortases 種類示意圖 (9)
Sortases 藉著辨認特殊序列，催化不同胜肽或蛋白質連結的特性，為多功能崁合蛋白 的合成提供一個有別於化學合成或生物化學上表現融合基因的方法。其中Sortase A 被廣泛 的研究，應用在不同功能蛋白的連接上。
1-2 Sortase A 的功能
在革蘭氏陽性菌上Sortase 扮演重要的角色，若缺少了 sortases 的作用，則細菌將喪失 感染的能力，如金黃色葡萄球菌若無sortase A 的作用，則不會成為動物的感染源(13)。
在革蘭氏陽性菌中，Sortase A 其 N 端在細胞膜內，其 C 端在細胞壁中，能辨認細菌
表面蛋白或訊號胜肽中LPXTG 的特殊序列（X 為任意胺基酸），讓表面蛋白與與細菌的細
胞壁肽聚糖的GGGGG 序列以共價鍵接合(12, 14)。
以圖1-2 Sortase A 功能示意圖來介紹攜帶 LPXTG 的胜肽段如何被 Sortase A 連結在細 胞壁上。
圖 1-2：Sortase A 功能示意圖 (12)
在細胞質中的訊號胜肽會與 LPXTG 序列先合成一個聚合胜肽如圖 1-2 中的“P1”。其 中包含 N 端的訊號胜肽和 C 端的 LPXTG 序列。訊號序列透過 Sec protein translocation system(15) 使得聚合胜肽從細胞質中被導出“P2”。聚合胜肽被細胞分泌導出時其 C 端仍保 留疏水且帶正電的LPXTG 特殊序列。Sortase A 是附著在細胞膜上的轉移胜肽酶，藉由酶 上的半胱胺酸(cysteine)活性部位，將 LPXTG 中蘇胺酸（threonine; T）與甘胺酸（glycine; G）
的鍵結分離後，半胱胺酸與蘇胺酸間產生醯鍵形成“聚合胜肽－酵素”的醯基中間產物“A
Ⅰ”。而細胞膜上的前導物 LipidⅡ中有五個聚合的甘胺酸，甘胺酸上的胺基會攻擊半胱胺
酸與蘇胺酸間的醯鍵，使得甘胺酸與蘇胺酸重新連結，讓訊號胜肽藉由LPXT－GGGGG 的
橋樑與LipidⅡ相連接形成新的前導物“P3”。“P3”再連接到細胞壁上，生成錨固在細胞壁上 的表面蛋白“M”。
利用 Sortase 的特性，在不同功能的胜肽或蛋白質中，以基因工程分別在 N 端加入 LPXTG 序列與 C 端加入 GGGGG 序列，就可將兩種不同的胜肽或蛋白質連接，形成新的 胜肽或嵌合蛋白(14, 16, 17)。其接合受質非常廣泛如螢光蛋白(18, 19)、胜肽核甘酸(20)、糖 蛋白連結(21)、聚合物(22)、固態物質(23, 24)、脂質(25, 26)、微小粒子(27)等。
其應用方法，如利用 Sortase A 接合不同的抗體在特定載體上作探針進行免疫檢查
(28)、製造傳遞蛋白(29)或標示特定領域以利核磁共振的觀察(30)等，顯示 Sortase A 的催化 加成反應有廣泛的應用性(31, 32)，促使吾人對利用 Sortase A 生產嵌合蛋白的優化條件有更 深入的探討與研究。
1-3 Sortase A 活性區域的結構
Sortase A 有 206 個胺基酸，其 N 端在細胞質中可將 Sortase A 錨固在細胞膜，而 C 端 的部份在細胞壁中是催化反應的區域(13, 14)。
將缺少 N 端的 24 個胺基酸（Sortase A△N24）或 59 個胺基酸的基因重組 Sortase A
（ Sortase A△N59）被證實能在大腸桿菌之水溶狀態細胞質液中大量表現(16, 33, 34)，且讓 具有LPXTG 序列（X 可以是任意胺基酸）與 GGGGG 的胜肽段相互連結(35)。
圖 1-3：Sortase A△N59 的結構 (35)
Sortase A△N59結構如圖1-3，其核心主要有 8 段 β 折板，一個 α 螺旋與 2 個連結 β 折 板的3 折螺旋（β3/β4 與 β6/β7）。其中 β4、β7、β8 形成一個疏水性的孔洞，而連結 β6、β7 的螺旋線段具有彈性，使得sortase 能像捕手手套一樣能在活性條件下改變結構捉住受質。
-4 Sortase A 的活性部位與作用機制
（Leucine-Proline-Glutamate -Threonine-Glycine）
相結合時其電性分佈圖如下圖1-4(35)。
1
1-4-1 Sortase A 辨認受質的活性部位
Sortase A△N59與胺基酸序列LPETG
圖 1-4 :Sortase AΔN59 的電性分佈圖 (35)
圖中深綠色部份為疏水區、紫色為極性的殘基，青色為正電區域，紅色是酸性殘基。
因LPETG 序列具疏水性且帶正電，故會與 Sortase A△N59結構中的β4、β7、β8 形成的疏 水性
ortase A△N59相親合後，各活性部位殘基與LPETG 作用的 X-ray 晶體結 構如下圖1-5 (16)。
孔洞相親合。
當LPETG 與 S
圖 1-5:Srt A N59△ 活性部位結合LPETG 的 X-ray 晶體結構圖 (16)
和 Gln-172 則無被發現與催化作用有關(16)。
7/β8 (綠)區域與 GGG 的辨認有關(35, 38)。
在圖1-5 中，當 LPETG（黃色）被束縛在活性部位時，各 β 折板上活性部位與 LPETG 有如下作用：β3/β4 (藍)區域與鈣離子的結合有關(36)。β6/β7（紅）區域與辨認 LPXTG 中 的LP 殘基有關(35-37)，其中 Val-168 和 Leu-169 被認為是重要的識別殘基、Glu-171 為鈣 離子結合後的作用有關，而Gly-167、 Asp-170
β
1-4-2 鈣離子對 Sortase A 的影響
當β3/β4 區域上的殘基 Glu-105, Glu-108, Asp-112, and Asn-114 與鈣離子結合時，會透 過鈣離子拉住β6/β7 區域上的 Glu-171，如圖 1-6，讓原本具有彈性的 β6/β7 區域改變成有 次序的構形(36)。
圖 1-6：鈣離子對 Sortase A 作用示意圖 (36)
而β6/β7 區域改變成有次序的構形時，有助於辨認 LPXTG 序列，如圖 1-7。當 LPXTG 與Sortase A 結合後，β7 上的 Cys184 能裂解 LPXTG 序列中的蘇胺酸（threonine; T）與甘 胺酸（glycine; G）。
圖 1-7：鈣離子結合對 β6/β7 區域的影響示意圖 (36)
1-4-3 Sortase A 與受質反應的作用機制
當LPXTG 與 Sortase 疏水性孔洞相親合時，亮胺酸 L 與脯胺酸 P 被 β6/β7 區域辨認，
且分佈在Sortase A 疏水孔洞中的三個重要活性部位：分別為在 β7 上的 C184、在 β8 上的 R197 與在 β4 上的 H120，開始對蘇胺酸 T 與甘胺酸 G 作用(39) ，其作用示意圖如圖 1-8。
半胱胺酸Cys184 的氫硫鍵會對 LPXTG 序列中蘇胺酸 Threonine 上碳鏈上的羰基產生親核 攻擊，在酵素與受質間形成硫脂鍵（thioester），羰基與氧的共價鍵電子被擠壓至氧上，Arg197 的氨基因帶正電，提供庫倫吸引力吸住電子電，但因氧原子的陰電性大於氨基，故電子再 回振到羰基上形成碳氧原子間的共價鍵，此時為滿足八隅體的穩定，碳原子與氮原子間的 鍵結被切斷，電子轉移到 His120 殘基，His120 釋出氫離子，進而產生“LPXT－酵素”的中 間物(40, 41)。
圖 1-8：“LPXT－酵素”中間物的形成示意圖 (40)
當“LPXT－酵素”中間物遇到五甘胺酸（pentaglycine）時，甘胺酸上的氨基對 “LPET
－酵素”中間物產生親核性攻擊，使“LPXT－酵素”中間物的蘇胺酸 T 與五甘胺酸的 G 產生 醯胺鍵（amide bond）的連結，形成 LPXT－GGGGG 的生成物。而 Sortase A 再度被釋放於 溶液中，進行下一個循環的反應(42)，如圖 1-9。
圖 1-9：Sortase A 的水解與接合機制示意圖 (42)
1-4-4 溫度對 Sortase A 的影響
根據 Matthew L. Bentley 等人的研究(16)，Sortase A 及其突變株在 37℃下在水解 Abz-LPETGG-DNP 的活性如表 1-1。
表 1-1：Sortase A 及其突變株的活性檢測 (16)
以Circular Dichroism (CD) Spectroscopy 波長 216 nm 檢測其二級結構，發現旋光度與 溫度的關係如圖1-10 。
圖 1-10：Circular Dichroism (CD) Spectroscopy (16)
其結構改變的臨界溫度最低在56 ℃以上，如表 1-2。由此推測 Sortase A 及其突變株 在10 ℃至 50 ℃以下的實驗操作中能維持原有的活性(43)。
表 1-2：Sortase A 野生株與突變株結構改變的臨界溫度 (16)
1-5 Sortase A 之活性檢定
Sortase A 同時具有水解反應與接合反應的特性，根據研究(44)指出，Sortase A 的反應 依循“乒乓機制” (ping-pong mechanism) (45)。即 Sortase A 與 LPETG 先形成醯基脢 (acyl-enzyme)中間物後，GGGGGC 才會產生親核攻擊，最後形成 LPET－GGGGGC 的產物。
故 其 活 性 檢 定 分 兩 階 段 , 首 先 利 用 自 消 螢 光 胜 肽 o-aminobenzoyl- Leucine-Proline-Glutamate-Threonine- Glycine-2,4-dinitrophenyl（以下簡稱 Abz-LPETG-Dnp）
來檢測Sortase A 的水解活性並用 Liquid Chromatograph/Mass Spectrometer (LC/MS)驗證其 反應物與生成物分子量的訊號。
圖 1-11：Abz-LPETG-Dnp 之結構式
再 取 胜 肽 段 Glycine-Glycine- Glycine- Glycine- Glycine-Lysine- Fluorescein isothiocyanate （以下簡稱 GGGGGK-FITC）與 Abz-LPETG-Dnp 反應，Sortase A 會將 G-Dnp 從 Abz-LPETG-Dnp 切開，再將 Abz-LPET 轉移接合到 GGGGGK-FITC 上，最後形成 Abz-LPETGGGGGK-FITC。以 LC/MS 檢測生成物 Abz-LPETGGGGGK-FITC 的分子量訊 號，並分析其訊號量值來了解Sortase A 的接合反應。
圖 1-12：GGGGGK-FITC 結構圖
1-6 研究目的
有研究指出在Sortase A 的三個螺旋上有四個胺基酸的突變點會影響其接合效率(46)。
這四個突變點分別為在β2/β3 縲旋上的 P94，在 β6/β7 的連接縲旋上的 D160 和 D165，與在 C 端的 β7/β8 連接縲旋上的 K196。這些位置都在 Sortase A 的表面，且靠近 LPXTG 結合位 的疏水孔洞，如圖1-13。
圖 1-13：Sortase A 定點突變位置圖 (46)
在研究中(46)指出 β2/β3 縲旋上的第 94 個胺基酸由脯胺酸（Proline，P）突變成絲胺 酸（Serine，S），簡稱P94S；在 β6/β7 縲旋上的第 160 個胺基酸由天冬胺酸（Aspartic acid，
D）突變成天冬醯胺（Asparagine，N），簡稱 D160N；第 165 個胺基酸由天冬胺酸突變成丙 胺酸（Alanine），簡稱 D165A；在 β7/β8 縲旋上的第 196 個胺基酸由賴胺酸（Lysine，K）
突變成蘇胺酸（Threonine，T），簡稱 K196T，被證實能增進 Sortase A 的效率(46)，應是此 四個突變造成縲旋圈的構型改變，使 sortase 能更容易與受質結合。其中 P94S、D160N、
D165A 與在 LPXT 上的結合有關；K196T 與 GGGGG－胜肽的接合有關。
本研究期望在Sortase A 的野生株（簡稱 SrtW）上進行四個點突變 P94S、D160N、D165A 與 K196T。取得四點突變株（簡稱 SrtPro）後，進行突變酵素的催化反應研究，期待在室 溫的環境中找出能提高蛋白質接合效率的突變型酵素，以應用在嵌合蛋白的接合中。