第一節 補骨脂純化物中對 MC3T3-E1 細胞的 ALP 活性及細胞存活之影響
本實驗利用造骨細胞分化早期的指標 ALP 活性來做以下的研究。圖一 A 所示為補骨脂純化物在 MC3T3-E1 細胞對於 ALP 活性的影響。細胞分 別處理四個補骨脂純化物 NBIF、psoralidin、psoralen、isopsoralen （濃度 1、
5、10、20μM；以 PBS 做為控制組）共同培養三天後，測試 ALP 活性。
實驗結果顯示細胞只有在處理 NBIF 能顯著地增加 ALP 活性，而
psoralidin、psoralen、isopsoralen 則無顯著增加。此外，細胞處理 NBIF 顯 著地促進 ALP 活性呈劑量相關的關係，並且 10μM NBIF 達到最大促進 作用。
利用 MTT assay 偵測細胞存活率，釐清四個補骨脂純化物對於
MC3T3-E1 細胞是否有毒性，結果顯示，處理四個補骨脂純化物（濃度 1、
5、10、20 μM）的組別，與 PBS 組相比並無明顯差異，故四個補骨脂純化 物於所有使用濃度下並無細胞毒性（圖一 B）。綜合以上所述，本研究以 NBIF 10μM 繼續做更進一步的探討。
第二節 探討 Estrogen receptor 和 PI3K/Akt 訊息 路徑在 NBIF 刺激造骨細胞分化中所扮演的角色
已知造骨細胞的分化跟成熟與 estrogen receptor、PI3K/Akt 訊息傳遞路 徑有密切相關（Tang et al., 2007; Xin et al., 2010）。因此利用 ICI 182,780
（estrogen receptor inhibitor）、wortmannin （PI3K inhibitor）來釐清 NBIF 刺 激 ALP 活性中， estrogen receptor 與 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑是否參與其 中。實驗方法同 ALP activity assay。細胞預處理 ICI 182,780 （1、5、10μM）
（圖二 A）或 wortmannin （0.5、1、3μM）（圖二 B）一小時後，再處理 NBIF al., 2007; Windischhofer et al., 2002）。因此本實驗利用 SB203580 （p38 inhibitor）、PD98059（ERK inhibitor）、SP600125（JNK inhibitor）來釐清 MPAKs 是否參與 NBIF 所誘導之 ALP 活性。以不同濃度的 SB203580 （1、3、
10μM）（圖三 A）、PD98059（1、3、10μM）（圖三 B）、SP600125（1、3、
10μM）（圖三 C）預處理一小時，再處理 NBIF 10 μM，共同培養三天後測 試 ALP 活性。結果顯示，NBIF 10 μM 所增加的 ALP 活性僅在 SB203580 1 μM 濃度下顯著地被抑制；而 PD98059、SP600125 則無顯著影響 ALP 的
活性。這暗示 NBIF 除了可能經由 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑之外，還有可能
第五節 NBIF 增加 p38 及 Akt 磷酸化
由於 Akt 為 PI3K 下游蛋白，可藉由活化 Akt 間接得知 PI3K 的活 性。 故本實驗利用 phosphor- p38 及 phosphor- Akt 之抗體來進行 Westerrn blot 分析，來測定 p38 及 Akt 被活化的程度。如圖七，給予 NBIF 30 分鐘 後 MC3T3-E1 細胞會因為 NBIF 的刺激而明顯增加 p38 及 Akt 的磷酸 化。這暗示 NBIF 可誘導 MC3T3-E1 細胞之 p38 及 Akt 活化。
第六節 NBIF 在 MC3T3-E1 細胞對造骨細胞相關 基因表現的影響
由上述實驗已知 NBIF 會刺激 MC3T3-E1 細胞分化、礦化以及其相關 訊息傳遞之路徑。一般而言，骨細胞生長分化會因受到轉錄因子（Runx2、
OSX）的調控分泌骨基質， 例如：BSP、OCN、BMP-2 等，故本實驗將細 胞與 NBIF 共同培養 2 天，利用 RT-PCR 方式來偵查不同基因的表現：
Runx2、OSX、BSP、OCN、BMP-2 之 mRNA，以 GAPDH 之 mRNA 作 對照組。由圖八 A 及圖八 B 可得知 MC3T3-E1 細胞受到 NBIF 刺激會隨著 濃度增加轉錄因子 OSX 及 Runx2 mRNA 的表現。另外，由圖八 C 及圖八 D 可得知 MC3T3-E1 細胞受到 NBIF 刺激會隨著濃度增加骨基質 BSP 及 OCN mRNA 的表現。然而骨細胞生長分化不可或缺的骨生成蛋白 BMP-2
（圖八 E）也同樣受到 NBIF 刺激而有濃度相關的增加 mRNA 表現。
第七節 p38 及 PI3K/Akt 訊息路徑參與 NBIF 誘導造 骨細胞相關基因的表現
另外，本實驗利用 SB203580 及 wortmannin 來釐清 p38MAPK、
PI3K/Akt 是否參與 NBIF 所誘導造骨細胞相關基因的表現。因此將
SB203580 及 wortmannin 分別加入細胞中預處理一小時後與 NBIF 共同培 養 2 天。如上述，利用 RT-PCR 方式來偵查不同基因的表現，結果如圖九、
十，當存在著抑制劑 SB203580 及 wortmannin 時皆會隨抑制劑的濃度增加 而抑制 NBIF 所增加的 Runx2、OSX、BSP、OCN、BMP-2 基因的表現。這 些結果顯示在 MC3T3-E1 細胞中， NBIF 增加 Runx2、OSX、BSP、OCN、
BMP-2 基因表現受到 Akt 及 p38 的調控。