補骨脂活性成份 Neobavaisoflavone 促進造骨細胞分化及礦化之機轉研究

(1)

補骨脂活性成份 Neobavaisoflavone 促進造骨細胞分化及礦化之機轉研究

Effect of Neobavaisoflavone on the Cell Differentiation and Mineralization of MC3T3-E1 Preosteoblasts：Evaluating its Mechanisms of action

研究生：吳欣諭（Wu Hsin-Yu）

指導教授：邱文慧（Chiou Wen-Fei）教授魏百祿（Wei Bai-Luh）教授

國立台東大學生命科學研究所

碩士論文

Department of Life Science National Taitung University

Master Thesis

中華民國一百年一月 January 2011

(2)

(3)

(4)

謝誌

時光飛逝，歲月如梭，這次終於也輪到我寫謝誌了，一轉眼兩年半就這麼過去了。雖然很開心完成碩班學位，但是這也代表將要畢業，帶著萬般不捨離開你們。謝謝這些日子來大家的幫忙與照顧，因為有你們才會有這本論文，真的是感激不盡。

首先誠摯的感謝兩位指導老師：邱文慧老師與魏百祿老師，謝謝邱老師願意收留我，也很有耐心的與我討論實驗上的問題，更是不厭其煩的指正我的報告。謝謝魏老師在課業上的指教以及生活上的關心。特別感謝陽明大學廖志飛老師細心的糾正我論文上諸多的錯誤。衷心的謝謝三位老師對論文上的指導。

謝謝實驗室的每一個人，感謝姿君學姐、慧珠學姐在實驗上還有生活瑣事的關心以及建議。感謝宇柔學姐教會我許多為人處事的道理，感謝文澤離職前還要帶我做實驗，感謝晞璿、慶芸、揆廷對於實驗上的幫助，感謝品文總是貼心為我們默默的做了很多事，感謝小鈺、怡如總是很活潑的炒熱實驗室的氣氛，謝謝大家這些日子的陪伴讓實驗室總是充滿歡笑。感謝惠嵐姐辛苦的為我們辦理文件還有三不五時要被我們問東問西，同學們以婷、彥廷、

泯任、慧婷、貢丸、聖恩，還有可愛的室友欣盈學姐、介文學姐、美雲，這一路走來謝謝有你們，讓我碩班生活不孤單。

感謝秀珍學姐的湯粉，佳蓉學姐總是給我最貼心的鼓勵，感謝孜育學姐在我初到台東時給我的照顧與關心。素玲、慧軒、洛佑、佩螢、怡惠，還有所有幫助過我的人，以及嘉藥 Q902 所有老師學長姐們，謝謝你們的照顧及關心。

還有謝謝我最特別的銘宏學長，從耐心的帶我做實驗一直被我問問題，

到現在……你知道我要說甚麼的。

最後，謝謝一直默默支持我的家人，你們讓我在生活上沒有後顧之憂的完成學業，真的覺得當你們的孩子好幸福，我好愛你們，謹以此論文獻給你們，謝謝你們。

(5)

摘要

補骨脂（Psoralea corylifolia L.）為一已知傳統中藥，已被用來補骨、

壯陽或是治療骨折。研究顯示補骨脂粗萃取物不僅會刺激造骨細胞分化，也可改善去卵巢鼠的骨質疏鬆。Neobavaisoflavone（NBIF）、Psoralidin、

Psoralen、及Isopsoralen 是由補骨脂所分離出來的 4 個純化物，但其在造骨細胞的活性作用尚未釐清。因此，本論文利用前驅造骨細胞株 MC3T3-E1 做更進一步探討，進行篩選試驗中，我們發現 NBIF 具有最強的活性，可以刺激細胞分化時 ALP 活性的增加。本研究結果顯示 NBIF 呈濃度相關的增加 ALP 活性及礦化作用。而給予 p38 MAPK 抑制劑 SB203580 和

phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/Akt 抑制劑 wortmannin 亦顯著抑制 NBIF 所誘導之 ALP 活性，而 extracellular signal-regulated protein kinases

（ERK）抑制劑 PD98059、c-Jun NH2 terminal kinases（JNK）抑制劑 SP600125 及 estrogen receptors 抑制劑 ICI 182,780 則不影響 ALP 活性。

NBIF 亦可以增加 p38 MAPK 和 PI3K/Akt 磷酸化。另外，NBIF 甚至增加造骨轉錄因子 runt-related transcription factor 2、osterix，骨基質 osteonectin、

bone sialoprotein 和骨形成蛋白 bone morphogenetic protein-2 mRNA 表現的產生，而這些現象皆會被 p38 MAPK 抑制劑和 PI3K/Akt 抑制劑所阻斷。

因此 NBIF 增加造骨細胞分化的機轉可能與 p38 MAPK 和 PI3K/Akt 訊號路徑相關。

(8)

Abstract

Psoralea corylifolia（Leguminosae） a well-known traditional Chinese medicine,which has been applied as a restorative or an aphrodisiac agent and

commonly used as a remedy for bone fracture.The extract of P. corylifolia has been reported to not only stimulate osteoblast differentiation in vitro, but also ameliorate experimental osteoporpsis in ovariectomized rats. Four compounds

〔neobavaisoflavone (NBIF), psoralidin, psoralen and isopsoralen〕were isolated from P. corylifolia. Whether they are the active component contributed to the anabolic effect of P. corylifolia on bone remains unclear. By using the MC3T3-E1 preosteoblasts, the preliminary results showed that NBIF displayed the most potent effect to enhance the cell differentiation as measured by increase in alkaline

phosphatase (ALP) activity. The present results showed that NBIF significantly and concentration-dependently increased ALP activity and mineralization. Pre-treament with p38 inhibitor SB203580 and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt

inhibitor wortmannin all significantly repressed NBIF-induced ALP activity. On the other handcontrary, pre-treament with extracellular signal-regulated protein kinases (ERK) inhibitor PD98059, c-Jun NH2 terminal kinases (JNK) inhibitor SP600125 and estrogen receptors inhibitor ICI 182,780 all failed to affect NBIF-induced ALP activity. By using Western blot analysis, the results showed that NBIF significantly increased the phosphorylations of p38 MAPK and Akt (the down stream target of PI3K). Furthermore, NBIF up-regulated the mRNA expression of the transcription factor runt-related transcription factor 2 and osterix as well as the bone matrix proteins osteonectin , bone sialoprotein and bone morphogenetic protein-2. Such phenomenon was markedly repressed in the presence of SB203580 and wortmannin.

In conclusion, the results obtained here indicated that activation of p38 MAPK and PI3K pathways may contribute to the osteogenetic effect of NBIF.

(9)

縮寫表

ALP：Alkaline phosphatase

BMP：Bone morphogenetic protein BSP：Bone sialoprotein

ERK：extracellular signal-regulated protein kinases ERs：estrogen receptors

JNK：c-Jun NH2 terminal kinases

MAPK：Mitogen-activated protein kinase NBIF：Neobavaisoflavone

OB：Osteoblast OC：Osteoclast OCN：Osteonectin OPN：Osteopontin OSX：Osterix

PI3K：Phosphatidylinositol 3-kinase PNPP：ρ-Nitrophenylphosphate

RT-PCR：Reverse transcription-polymerase chain reaction Runx2：Runt-related transcription factor 2

TGF-β：Transforming growth factor beta

(10)

第一章緒論

(11)

第一節前言

隨著日新月異的科技，醫療水準的提高，各國人民的平均壽命顯著增加，老年人口因而日益劇增，導致越多的老年人飽受骨質疏鬆的痛苦。另外有研究指出，停經後的婦女，因為雌激素減少，導致骨量流失速度加速。大部分的人們，都著重在急性病的治療與慢性病的防治，往往忽略了骨質疏鬆這個隱形的殺手，不懂的保護骨骼。近年來研究骨質疏鬆這個課題也慢慢的受到關注。骨質疏鬆是屬於全身性的骨骼疾病，簡言之它就是骨骼的生長減少，因為骨蝕損與骨形成沒有達到平衡的狀態，骨骼大規模減少而造成的疾病。

第二節文獻回顧

一、骨質疏鬆症（Osteoporosis）

在醫學發達的今天，人類平均壽命增加驅使走向高齡化社會，也產生許多的老人病，骨質疏鬆症（osteoporosis）就是其中一種（Vondracek &

Linnebur, 2009）。骨質疏鬆症分為原發性與次發性兩種。原發性骨質疏鬆症族群主要為老人與停經後婦女，其共同原因皆以骨質代謝率增加，造骨細胞功能老化，導致骨質來不及回補，造成骨密度下降而使骨質減少。骨質快速流失下無法及時回補，無法達到平衡便引發骨質疏鬆症。

世界衛生組織（WHO）於 1994 年公佈成年人骨質疏鬆症的定義為『一種因骨量減少或骨密度降低而使骨骼微細結構發生破壞的疾病，惡化的結果將導致骨骼脆弱，並使骨折的危險性明顯增高』。美國國家衛生院（NIH）

(12)

最新的定義則強調骨質疏鬆症為『一種因骨骼強度減弱致使個人增加骨折危險性的疾病』。骨骼強度（bone strength）則包含骨密度（bone density）及骨骼品質（bone quality）；涵蓋骨骼結構（architecture）、骨骼代謝轉換

（ turnover ）、結構損傷堆積（ damage accumulation ）及礦物化過程

（mineralization）。（中華民國骨質疏鬆學會）

二、骨質疏鬆症的種類

第一型骨質疏鬆症，又名停經後骨質疏鬆症。是由於女性荷爾蒙減少所造成最常見的骨質流失疾病。在停經後的十五到二十年間，最容易發生骨折。

第二型骨質疏鬆症，又名老型骨質疏鬆症。隨著年齡的增長，骨質疏鬆更嚴重的一種退化性疾病。而不論何種性別都有可能罹患此類的骨質疏鬆。

第三型骨質疏鬆症，又名藥物性骨質疏鬆症。是近年來才被醫學界分出來的，例如：類固醇製劑（corticosteroids）這一類的藥物容易造成骨質嚴重流失，也同第二型骨質疏鬆，會不論性別的發生在患者身上。

第四型骨質疏鬆症。不同於前三型的是，並非透過適當的治療或是改變生活型態，就可以減緩骨質疏鬆的發生。第四型骨質疏鬆症多為難以治癒的疾病，例如：風濕性關節炎（rheumatoid arthritis）或為內在發炎性疾病引發的病症。

(13)

三、骨骼重塑

骨骼是人體重要的器官，依型態不同具有:保護臟器（如:肋骨）、承重與支撐作用（如:大腿骨）、維持體型（如:肩胛骨）、完成各種各樣的運動（如:

各部位關節）的功能。

一般情況下，人體的骨骼伴隨著人出生直到老死，因此是必須經常汰舊換新保持正常結構，以維持良好的功能。這工作主要是由骨骼內造骨細胞或稱成骨細胞（osteoblast, OB）與蝕骨細胞或稱破骨細胞（osteoclast, OC）

兩大骨細胞來執行。當有老化或破損的骨質產生時，初期由蝕骨細胞開始，

蝕骨細胞會製造酸性環境使骨質溶解，讓骨頭中的鈣質流出，藉此分解舊的骨組織，這個清除動作稱為骨蝕損（bone resorption），緊接著造骨細胞進駐，造骨細胞會製造鹼性環境以利其生長，並分泌骨基質（osteoid）以及進行礦化作用（mineralization）形成新的骨質，完成骨形成作用（bone formation）。整個過程稱骨重塑週期（bone remodeling cycle）。骨重塑扮演重要的角色，使骨頭可以新陳代謝，在我們的一生中都會進行這樣的過程，使我們的骨質總量得以維持。

四、造骨細胞生長與分化

造骨細胞來源為骨髓中之 stromal cell precursors，其功能是合成、分泌膞原，形成骨基質；參與破骨細胞性骨吸收的調控作用；維持骨的代謝平衡。

特點為：①分泌鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、造骨形成蛋白

（bone morphogenetic protein-2, BMP-2）、第ㄧ型膞原（type I collagen），

及其他基質蛋白（matrix proteins），如：骨鈣素（osteonectin, OCN）、骨

(14)

橋蛋白（osteopontin, OPN）、骨骼涎蛋白（bone sialoprotein, BSP）（Yamaguchi et al., 2000）；②受到多種激素及生長因子影響（例如：PTH、PGE₂、TGF-β、

1,25(OH)₂D₃ ）的影響（Zhang et al., 2009）。此外造骨細胞也能合成及分泌 一些生長因子，包括 IGFs、TGF-β 及 endothelin-1 等（Chiao et al., 2000；

Harris et al., 1994）。造骨細胞也參與骨質之礦化過程（Manolagas & Jilka, 1995），它分泌之 ALP 可與 1,25(OH)₂D₃（活性維生素D）相互使 Ca⁺⁺與 PO₄^-3形成 amorphous calcium phosphate 及其後之calcium hydroxyapatite

（Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂）（Daculsi, 1998）。此外它分泌之 matrix proteins（90%

以上為 type I collagen 及其它 non-collagenous 蛋白如 OCN ，OPN 等）

（Zhang et al., 2009）對骨礦化過程也扮有重要角色。另外，也可經由不同分 化途徑刺激分化成不同的細胞，例如：軟骨細胞（chondrocytes）、脂肪細胞

（adipocytes）以及造骨細胞等（Deng et al., 2008）。

五、骨質生成的指標

鹼性磷酸酶的出現被認為是造骨細胞的主要標誌，對骨基質礦化過程非常重要（Robison, 1923）。血液中的鹼性磷酸酶可來自造骨細胞、肝臟、

腸道、腎臟和胎盤等細胞，骨特異性之鹼性磷酸酶為造骨細胞所有，並大量存在於造骨細胞。而鹼性磷酸酶的活性也可顯示出造骨細胞製造膞原蛋白的能力，因此骨生成的定量分析中，骨特異性鹼性磷酸酶可作為較準確的骨質生成指標，它是一個大約 65 kDa 大小的醣蛋白，具有極強攜帶鈣離子的能力。

骨鈣素：是骨骼內非膞原蛋白中含量最多的一種，亦稱為 bone gla

(15)

protein （BGP），由造骨細胞所合成，因在進入骨基質時，部分片段被釋放到血液中，故可作為一種骨質生成的指標，具協調造骨細胞活化之功能，並且可調控造骨細胞礦化與成熟階段。而 OCN 也受到維生素 K 的調控，若維生素 K 不足會降低 OCN 活化的程度，無法轉變為活化型態的骨蛋白質 VitaminK-dependent carboxylation protein （Hauschka et al., 1989），很有可 能引發骨質疏鬆症。

第一型膞原蛋白：為骨骼中最主要的蛋白質，也為骨基質中最主要的成分，分子量大約是 95 kDa，含一千多個胺基酸，佔有機骨基質中的 90％，

膞原纖維提供礦物質晶體（mineral crystals）沉積的位置與新生骨質的生長方向，具有調節礦物質沉積之功能，第一型膞原蛋白可影響造骨細胞的表現，也可以促進骨細胞的增殖與分化，故可視為造骨細胞生長階段的一個表現因子。

骨骼涎蛋白：位於骨骼、齒質、齒堊質及部分肥大軟骨細胞中。BSP 是一種高度磷酸化糖蛋白（sulphated and glycosylated phosphoprotein）（Chen et al.,1991），並含有 50％的碳水化合物，幾乎都出現在骨骼形成初期的礦

物質化的結締組織中。在發育中的骨骼內，BSP 會與礦化的過程同步出現。

BSP 具有使細胞附著以及媒介基質進行礦化的功能。

六、造骨細胞生成之訊息傳遞路徑

骨形成蛋白（BMPs）由造骨細胞所分泌，有超過 20 個成員，屬於 transforming growth factor beta （TGF-β） superfamily 的一員，起初發現有獨特的能力（Urist, 1965; Reddi, 1994），可誘導還沒分化的間葉幹細胞分化

(16)

成軟骨細胞及造骨細胞。 BMP 亦可促進骨形成以及骨重塑。 BMPs 中，

BMP-4 可以誘導造骨細胞分化，以及促進 BMP-6 合成。 BMP-6 則是在早期造骨細胞分化，促使 glucocorticoid （腎上腺皮質素，又稱糖皮質激素）誘導造骨細胞成熟及分化。簡言之， BMPs 具有骨形成和重塑的功能，在造骨細胞中扮演很重要的角色。而 BMPs 也調控下游的訊息調控蛋白

Smad1/5/8 ，使之形成一複合體，進而到核內活化特定基因，進行轉錄作用以調節下游的訊息傳遞因子（Sykaras & Opperman, 2003）。

而 mitogen-activated protein kinase（MAPK）為細胞訊息傳遞的重要路徑之一，負責細胞生長和分化等功能。MAPK 的主要成員包含

ex t r a ce l l u l ar s i g n al - reg ulated pr otein kinas e s（ERK）1/2 、 p38 、以及 c-Jun NH2 terminal kinases （JNK）等。有報導指出當 MAPK 被磷酸化能誘導骨細胞 的分化作用。而 ERK1/2 、 p38 也被報導參與造骨細胞的分化（Kuo et al., 2005）。

另外， PI3K/Akt 訊息傳遞路徑調節了細胞增生、生長，防止凋亡，提高生存率並刺激血管生成等多種細胞反應。也有證據指出當 ALP 活性因為 被 BMP-2 誘導而增加是需要 PI3K 以及其下游 Akt 的活化（Fong, et al., 2008; Hung et al., 2007; Wu et al., 2008）。

造骨細胞生長分化中不能缺少與造骨細胞有關轉錄因子的調控，例如：runt-related transcription factor 2（Runx2）、osterix （OSX）、Dlx5、Msx2 為 BMPs的下游因子（附圖一），這些轉錄因子獨自或互相調控地刺激 type I collagen 、 fibronectin（纖維黏蛋白）、 ALP 、 OCN 等成骨細胞分化標記 基因（Chiou et al., 2006）。

(17)

Runx 轉錄因子家族編碼三個不同的基因產物：Runx1（Pebp2aB / Cbfa2 / AmL1）、 Runx2 的（Pebp2aA / Cbfa1 / AmL3）和 Runx3（Pebp2aC / Cbfa3 / AmL2），在正常細胞生長和腫瘤形成扮演舉足輕重的角色。Runx1 在造血幹細胞扮演著重要的角色。Runx3 已被證明是一個腫瘤抑制基因產物，可抑 制胃癌。Runx2 是成骨轉錄所需的一個重要調控因子（Lee et al., 2002），

可快速調控 TGF-β 和 BMP-2 ，進而活化下游標的物 Smads 。而且 Runx2 被報導會影響 OCN、ALP 及 type I collagen 等基因的表現（Lee et al., 2010），並在肥大軟骨細胞分化扮演重要角色（Nakashima et al., 2002）。

OSX 亦為成骨轉錄所需的一個重要調控因子。被發現是一個新的含鋅 手指（zinc finger）的轉錄因子（Nakashima et al., 2002），主要作用在造骨細胞分化末端。而 Runx2 以及 OSX 的 mRNA 表現都與 BMP-2有關（Ryoo et al., 2006）。

雌激素（estrogens）的生理作用不僅有發生在女性，男性亦有作用。雌激素與調控卵巢、胎盤、睾丸、前列腺、脂肪組織、腻、肝、乳腺、肌肉、

血管內皮細胞以及骨骼等有相關。雌激素也調控著骨的成熟及平衡的狀態。

而這些調控分別是受到雌激素受體（estrogen receptors；ERs）中的 ERα 和 ERβ 所調控（Nilsson & Gustafsson, 2011）。

七、臨床上骨質疏鬆之治療

荷爾蒙補充治療（hormone replacement therapy；HRT）：有很多研究指出，服用荷爾蒙補充療法確實可以改善骨質疏鬆的情形，但長期使用卻會出現副作用，如子宮出血、體重增加、乳房脹痛、子宮內膜癌、乳癌（Torgerson

(18)

& Bell-Syer, 2001）。

雙磷酸鹽類藥物（bisphosphonates）：可抑制骨蝕損、增加骨質及減少骨質疏鬆的發生率，副作用是可能會造成消化道疾病，如吞嚥上的困難、食 道癌、食道潰瘍或胃潰瘍（Ruggiero et al.,2004）。

選擇性雌激素受體調節（selective estrogen receptor modulators ,SERMs

；raloxifene）：不但有助於提升骨質密度，還能降低罹患乳癌的風險。其副作用為熱潮紅、噁心、深層靜脈栓塞、中風、腿部痙攣、腫脹、感冒樣症狀

（Horowitz, 1993）。

抑鈣素（calcitonin）：是一種天然的激素，具有鈣質調節與骨骼新陳代謝的作用。能夠減低骨骼中鈣質流失，增加骨質。有鼻用型和注射型，其副作用為：鼻用劑型：流鼻水、頭痛、背痛、流鼻血；注射劑型：過敏反應、

臉部和手部潮紅、頻尿、噁心、皮膟過敏（Wallach et al.,1993）。

由於這些治療骨質疏鬆症的藥物皆具有不同的副作用，且多為抑制蝕骨細胞活性，鮮少是促進造骨細胞活性，故希望從傳統的中草藥中，找到有效治療骨質疏鬆的藥物，以利患者服用後減少副作用的困擾，進而增加造骨細胞活性，而達到預防及治療骨質疏鬆的效果。

八、補骨脂 (Psoralea corylifolia L.)

中藥補骨脂為豆科補骨脂屬植物（Psoralea corylifolia L.）之乾燥成熟果 實，別名破故子、破故紙、黑胡紙、天豆、胡韭子、胡紙花，常用來治療腎陽虛造成的陽痿、遺精、遺尿、小便頻繁、膝蓋痠痛、慢性泄瀉、氣喘等症。

其有擴張冠狀動脈、興奮心臟的作用，能補腎陽、通氣血、畏寒、四肢冰冷、

(19)

興奮子宮平滑肌、收縮子宮、助於治療源於腎虛血瘀的功能失調性子宮出血。此外，其亦適用於脾甚不足的小兒頻尿、及腎虛寒引起的足跟疼痛、便秘等。而目前藥理作用有：對心血管系統作用、促進皮膟色素增生、抗腫瘤作用、對生殖系統的影響（勝昌藥誌，1996）。

主要成分包含：香豆素（coumarins）、補骨脂內酯（psoralen）、異補骨脂內酯（isopsoralen）、補骨脂素（psoralidin）、補骨脂甲素（corylifolin）、

補骨脂乙素（corylifolinin）、巴庫查耳酮（bakuchalcone）、異新巴法查耳酮（iosneobavachlcone）、補骨脂酚（bakuchiol）、補骨脂異黃酮（corylin）、

新補骨脂異黃酮（neobavaisoflavone）等。

Psoralidin 屬於 coumestan 類化合物，曾被報導過在雄激素非依賴性前列腺癌細胞（PC-3 和 DU-145）透過抑制 Akt 磷酸化，而促使 PC-3 和 DU-145 走向細胞凋亡；反之在正常前列腺上皮細胞株則無明顯細胞毒性

（Kumar et al., 2009）。而在小鼠腹腔內的巨噬細胞中，甲醇萃取的 psoralidin 可抑制 LPS 所誘導之 NO 產生（Matsuda et al., 2009）。

Psoralen 及 isopsoralen 為coumarins（香豆素）類化合物。psoralen被指出在動物實驗紐西蘭兔（New Zealand White rabbit）中，被指出對於局部性的新骨生成具有強烈的效果並且含有 psoralen 的膞原基質具有發展成為骨移植材體使用的潛能（Wong & Rabie, 2011）。另外，psoralen 與 isopsoralen 則有選擇性的在人類口腔癌細胞株（KBv200）及人類白血病細胞（K562 和 K562/ADM）中具細胞毒性，而對人類牙周韌帶細胞（HPDL）則不具顯著 的毒性（Wang et al., 2009）。

(20)

NBIF 為 isoflavones （異黃酮）類化合物。被報導出在小鼠腹腔內的巨 噬細胞中，甲醇萃取的 NBIF 亦可抑制 LPS 所誘導之 NO 產生（Matsuda et al., 2009）。而在子宮頸癌細胞株（HeLa）和乳腺癌細胞株（MCF-7）對於 雌激素受體則有非典型的選擇作用（Xin et al., 2010）；NBIF 也被指出會誘 導 HeLa 細胞走向凋亡（Bronikowska et al., 2010）。另外，甲醇萃取出的 NBIF 被發現可以抑制血小板的凝集（Tsai et al., 1996）。

第三節研究目的

雌激素的調控在停經後婦女所引起的骨質疏鬆也佔有重要的地位，由於大豆異黃酮有類雌激素作用有文獻指出大豆蛋白可以防止骨質流失，大豆異黃酮可以刺激造骨細胞中蛋白合成及鹼性磷酸酶的表現。此外，異黃酮也可以預防去卵巢鼠骨密度的流失（Horiuchi , 2005）。目前傳統中藥補骨脂在傳統用法多用於治療氣虛、骨折；補骨脂粗抽物被發現不僅會刺激造骨細胞分化增加 ALP 活性，也可改善去卵巢鼠引起的骨質疏鬆。而補骨脂純化物 psoralidin 與 NBIF 分別被發現對癌症細胞株的細胞毒性，且可以抑制 NO 生成。Psoralen 則在活體上有促進骨形成作用，而 psoralen 與 isopsoralen 也被報導具有抗腫瘤作用。目前尚無針對補骨脂純化物 NBIF、isopsoralen 及 psoralidin 在造骨細胞方面的研究，雖然 psoralen 已被證實在活體上有促進骨形成作用，然而在不同模式下 psoralen 是否仍具有相同的作用。故本實驗培養造骨細胞株 MC3T3-E1 細胞，處理不同劑量補骨脂純化物觀察細胞毒性，並探討是否會促進造骨細胞的分化和礦化及其可能的機轉。

(21)

附圖一、BMP- 2 誘導成骨細胞分化之相關傳遞路徑。（Ryoo et al., 2006）

TGF-β：Transforming growth factor beta BMP：Bone morphogenetic protein OCN：Osteonectin

BSP：Bone sialoprotein Col-I ：Collage I

OSX：Osterix

Runx2：Runt-related transcription factor 2 FN ： fibronectin

(22)

NBIF Psoralen

Psoralidin Isopsoralen

附圖二、Neobavaisoflavone（NBIF）、Psoralidin、Psoralen、及 Isopsoralen 的化學構造

(23)

第二章實驗材料與方法

(24)

第一節實驗材料

一、實驗藥品與試劑

α-MEM：Minimum Essential Medium Alpha Medium (Invitrogen Corporation, USA)

AMP：2-Amino-2-methyl-1-propanol (Sigma, USA) Agarose LE (USB, USA)

ARS：Alizarin Red S (Sigma, USA)

BSA：Bovine serum albumin (Sigma, USA) Bio-Rad protein assay dye (Bio-Rad, USA) EtBr：Ethdium bromide

DMSO：Dimethyl sulfoxide (Sigma, USA)

FBS：Foetal bovine serum (Biological industries, Israel) Glycerol 2-Phosphate (Wako, Japan)

GoTaq^®Flexi DNA Polymerase (Promega, USA)

Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, USA) ICI 182,780 (Sigma, USA)

KCl：Potassium chloride (J.T. Baker, USA) L-Ascorbic acid (Sigma, USA)

Methanol (Echo, Taiwan)

MgCl2：Magnesium chloride (USB, USA)

MTT：3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (Sigma,

(25)

USA)

NaCl：Sodium chloride (Amersham Life Science, USA) NaF：Sodium fluoride (Sigma, USA)

NaHCO₃：Sodium hydrogen carbonate (J.T. Baker, USA) Na₃VO₄：Sodium orthoranadate (Sigma, USA)

NP-40：Nonidet P-40 Igepal Ca-630 (Sigma, USA)

Pen-Strep Sol. ：penicillin-streptomycin solution (Biological industries, Israel) PD98059 (Sigma, USA)

Ponceau S (Sigma, USA)

PNPP：ρ-Nitrophenylphosphate (Sigma, USA) SB203580 (Calbiochem, USA)

SDS：Sodium dodecyl sulfate (USB, USA) SP600125 (Calbiochem, USA)

TEG：Trypsin／EDTA solution 10X (Biochom, Germany) Tris (Bio-Rad, USA)

TRIzol reagent (Invitrogen, USA) Tween-20 (Sigma, USA)

Wortmannin (Calbiochem, USA)

抗體

Anti-rabbit IgG (Cell Signaling, USA)

Akt MAP kinase antibody (Cell Signaling, USA)

(26)

Phospho-Akt MAP kinase antibody (Cell Signaling, USA) p38 MAP kinase antibody (Cell Signaling, USA)

Phospho-p38 MAPK kinase Antibody (Cell Signaling, USA)

Primer

GAPDH (Invitrogen, USA) Runx2 (Invitrogen, USA) OSX (Invitrogen, USA) BSP (Purigo biotech, Taiwan) BMP-2 (Invitrogen, USA) OCN (Invitrogen, USA)

Buffer 配製 PBS

NaCl 8 g

Na₂HPO₄1.16 g KH₂PO₄ 0.2 g KCl 0.2 g H2O 1 L

TBS（5X）

NaCl 80 g

(27)

KCl 4 g

Tris-base 30 g H₂O 1 L

TAE（50X）

Tris-base 242 g

Glacial acetic acid 57.1 mL 0.05M EDTA 0.1 L

H₂O 1 L

Tris-Glycine SDS Running Buffer (10X) Tris-base 29g

Glycine 144g SDS 10g H₂O 1 L

Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) Tris-base 36.4 g

Glycine 180 g H2O 1 L

(28)

二、儀器設備與耗材

24 well cell culture cluster (Costar, USA) 96 well cell culture cluster (Costar, USA) Autoclave (Tomin, Taiwan)

Centrifuge (Kubota 1720, Kubota 5800, Japan) CO2 incubator (造鑫, Taiwan)

ELISA reader (Bio-Tek Instrument, USA) Laminar flow hood (造鑫, Taiwan)

NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, USA)

PES bottle top filter, 500mL (NALGENE filtration Products, USA) PCR electrophoresis chamber (Advance, Japan)

pH meter (Jenco, Microcomputer pH-vision 6071, Taiwan)

SDS-PAGE electrophoresis chamber (Novel Experimental Techology, USA) Tissue culture dishes, 100×20 mm (Cellstar, USA)

Tissue culture dishes, 35×10 mm (Falcon, USA) Water bath (Yihdern, Taiwan)

Orbital shaker (Stat Fax 2200,豐技生技, Taiwan)

三、補骨脂純化物之製備

NBIF、psoralidin、psoralen、isopsoralen 是由補骨脂（Psoralea corylifolia L.）乾燥成熟果實萃取出之純化物（附圖二），由中國醫藥研究所董明兆老

(29)

師實驗室提供。皆以 DMSO 溶解配成 100 mM stock solution，保存於 -20℃

備用。實驗前 NBIF 及 psoralen 以 50％ DMSO 稀釋成 10 mM，

psoralidin、isopsoralen 以 75％ DMSO 稀釋成 10 mM，psoralidin 以 25％

DMSO 稀釋成 1 mM。最後再以 PBS 連續稀釋成 200、100、50、10 μM 濃度使用。

100 mM 10 mM 1mM 0.1 mM NBIF 100％ DMSO 50％ DMSO PBS PBS psoralidin 100％ DMSO 75％ DMSO 25％ DMSO PBS psoralen 100％ DMSO 50％ DMSO PBS PBS isopsoralen 100％ DMSO 75％ DMSO PBS PBS

第二節實驗方法

一、細胞培養

使用小鼠造骨細胞株 MC3T3-E1，為陽明大學口腔生物研究所陳恆理老師實驗室提供。培養在 α-minimum essential medium（α-MEM）中，含有 10% fetal bovine serum（FBS），置於維持 37℃、5% CO2 的條件下的細胞培養恆溫箱中。待細胞長滿，以 PBS 溶液清洗細胞兩次，隨後抽乾，加入 1 mL 1X TEG 置入培養箱中約 5-10 分鐘，再加入 2 mL α-MEM ，反覆沖洗將細胞輕輕洗下，置於離心管中離心，離心條件為 20000 ×g，4℃，7 分鐘。

離心完成後去除上清液，加入 α- MEM 將細胞拍散依實驗設計進行細胞繼代培養。

(30)

二、細胞存活率測試

活細胞粒線體之去氫酵素如延胡索酸去氫酵素（succinic acid dehydrogenase），可將黃綠色 3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl

tetrazolium bromide（MTT）還原成 fomazan 呈藍紫色之結晶，以 DMSO 溶解，於 570 nm 下測定其吸光值，吸光值越大表示活的細胞數越多。

將 MC3T3-E1 細胞（1.5×10⁴cells/well）培養在 96 well細胞盤，24 小時後分別以不同濃度藥物處理。72 小時後取出，加入 1% DMEM （100 μL）

以及 5 mg/mL MTT 溶液（10 μL），置於培養箱中，經過 2 小時作用時間，

取出抽掉上清液後，加入 100% DMSO（200 μL），震盪均勻後使用分光光度計於 570 nm 下測定其吸光值。

三、鹼性磷酸酶活性 (ALP activity)測試

ALP 為早期出現的生化指標，常被用來辨別藥物是否促進造骨細胞的分化作用。由於在鹼性環境下單酯磷酸（monoester phosphate）能被 ALP 水解，故加入單酯磷酸受質 ρ-Nitrophenylphosphate（PNPP）， ALP會將其轉換為 phosphate 與 ρ-Nitrophenyl，於405 nm下測定其吸光值，吸光值越大表示 ALP 活性越高。

將 1.5×10⁴細胞種在 96 well 細胞培養盤，24 小時後分別加入 1、5、10、

15、20 μM 的 NBIF 以及 PBS 取代 NBIF（作為控制組）。72 小時後取出，

以 PBS 清洗，再加入 0.01% SDS（100 μL/well）於迴轉式恆溫振盪器在室

(31)

溫下震盪 40 分鐘，先取 10 μL/well 待測物至新的 96 well 加入 Bio-red protein assay dye，以使用分光光度計於 595 nm 下測定其吸光值，以 bovine serum protein（BSA）作為標準品以計算蛋白質濃度，定量所使用的濃度為 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/ml，利用標準曲線計算出樣品蛋白質含量，即可定量蛋白質。剩餘的 90 μL 加入 PNPP（ρ-Nitrophenylphosphate）

溶液，避光放置 30 分鐘後，使用分光光度計於 405 nm 下測定其吸光值計算後便可得到 ALP 活性。

PNPP 溶液之製備：2-amino-2-methyl-1-propanol （AMP）與 40 mM MgCl₂ 各取 500 μL 溶於 10 mL H₂O 並調整 pH 值為 10，此為 AMP 溶液。將 4- Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate 粉末溶於 AMP 溶液，配置成 9 mM 之 PNPP 溶液。

PNPP 標準液之製備：p-Nitrophenol standard solution 溶於 0.02 N 的 NaOH 以連續稀釋的方式，配置成 7.8125～250 μM 不同濃度的 PNPP 標準液。利用標準曲線計算出樣品 PNPP 含量，即可計算 PNPP 的濃度，濃度越高表示 ALP 活性越高。以下為計算 ALP 的方法：

ALP 活性=PNPP / protein / time （μM PNPP/mg protein/hr）

四、礦化骨節（bone nodule）分析

將 10⁴細胞種在 24 wells 細胞培養盤，6 天後分別更換培養液，給予含 5％ FBS、50 μg/mL ascorbic acid 及 10 mM β-glycerophosphate 的 α-MEM，並加入 1、5、10、15 μM 的 NBIF 或 PBS (作為控制組)。置於維持 37℃、5％ CO₂的條件下細胞培養恆溫箱中 14 天，每 3 至 7 天更

(32)

換培養液及添加藥物。

將 Alizarin Red S 粉末溶於 RO 水，以 NH₄OH 調整至 pH 4.0～4.1，

配置成 40 mM ARS 染劑，存放於 4℃備用。

經 14 天與藥物共同處理培養後，去除上清液，以 PBS 清洗 1～2 次，

加入 75％冰酒精 1 小時以固定之。再以 RO 水清洗 1 次，放入烘箱烘乾。待 plate 完全乾燥（可存放於室溫保存），每個 well 加入 500 μL ARS 染劑染色 5 分鐘後，以吸取方式去除 ARS 染劑，再以 PBS 清洗多餘染劑，清洗後去除 PBS，放入烘箱烘乾。乾燥後即可觀察並拍照。每個 well 加入 1 mL 0.1 N NaOH 以溶解染色後的沉澱物，以 548 nm測吸光值。

五、Western Blot 分析

取 40 μg 的蛋白質樣本，加入等量的 Laemmli sample buffer， 95℃煮沸 5 分鐘後，冷卻，再將蛋白質樣本加入電泳膞片的每個梳孔中，膞體使用 8 % 的（Sodium Dodecyl-Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis）SDS-PAGE gel，電壓 50 V，觀察 maker 展開後，將電壓調至 100 V，以 maker 觀察電泳中蛋白質位置，適當位置時停止電泳，並進行蛋白質樣本的轉漬。將 NC membrane 先以 transfer buffer 浸潤去極化，連同兩張 3M paper 放入 transfer buffer 中浸濕。由下往上依序的重疊順序為 3M paper → NC membrane → SDS-PAGE gel → 3M paper，並使用玻棒趕走其中的氣泡，再放入轉漬槽中，

以 200 mA 轉漬兩小時。NC membrane 以 5 ％ non-fat milk ∕ TBST blocking buffer 作用 1 小時，去除 blocking buffer，加入 specific antibodies

（p38、phospho-p38、Akt、phospho-Akt）作用 2 小時，以 TBST wash 三

(33)

次，加入 anti-mouse IgG conjugated alkaline phosphatase 或 anti-rabbit IgG conjugated alkaline phosphatase 或 anti-goat IgG conjugated alkaline

phosphatase 作用 1.5 小時，以 TBST 清洗三次後，用 Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP Substrate 呈色。於暗房感光顯影，再以自動洗片機洗片。

六、萃取 tatal RNA

將 2.5×10⁵細胞種至 6 公分培養皿，培養 1 天後，換成不含 FBS 的 α-MEM 。以 PBS 清洗一次，去除上清液，加入不含 FBS 的 α-MEM 與藥物，分別培養不同時間點。

以 PBS 清洗一次，完全去除上清液，加入 1 mL Trizol。室溫培養 5 分鐘後，加入 200 μL chlorlform，輕輕搖晃 15 秒，靜置 3 分鐘。以 20000 ×g，

4℃的條件離心 15 分鐘，離心後小心吸取分層的上清液至新的微量離心管，

並加入 500 mL isopropanol，靜置 10 分鐘後離心 20000 ×g，4℃，15 分鐘，

去除上清液加入 1 mL 75％酒精，震盪均勻將 RNA pellet 清洗乾淨，以 6000 ×g，4℃的條件離心 10 分鐘，相同條件再加入 1 mL 75％酒精再離心一次。離心完成後，去除液體部分，待 RNA pellet 風乾。加入 50 μL DEPC 水。以 260 nm 測吸光值以便於計算產物濃度。

(34)

七、Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 分析

將對於與造骨細胞功能有關的蛋白質 BMP-2、OCN、BSP （invitrogen），以及與造骨轉錄作用有關的 Runx2、OSX（invitrogen）進行分析，而以 GAPDH 作為對照組。

取 5 μg total RNA 進行聚合酶連鎖反應，反應條件為：

GAPDH：

（sense）5′-TGAAGGTCGGTGTGAACGGA

（antisense）5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCA 94℃ for 5 sec（initial denaturation）

94℃ for 30 sec（denaturation）

58℃for 1min（annealing）

72℃for 1.5 min（extension）for 30 cycles 72℃for 10 min（final extension）

Runx2：

（sense）5′-GTGGCCTTCAAGGTTGTAG

（antisense）5′-GGGTAAGACTGGTCATAGG 95℃ for 10 min（initial denaturation）

72℃for 1 min（extension）for 25 cycles

(35)

72℃for 10 min（final extension）

OSX：

（sense）5′-CCCTTCTCAAGCACCAATG

（antisense）5′- GCCTTGGGCTTATAGACATC 95℃ for 10 min（initial denaturation）

72℃for 1 min（extension）for 25 cycles 72℃for 10 min（final extension）

BSP：

（sense）5′-CTGTAGCACCATTCCACACT

（antisense）5′-ATGGCCTGTGCTTTCTCGAT 95℃ for 10 min（initial denaturation）

BMP-2：

（sense）5′-GTTCCCTACAGGGAGAACACC

(36)

（antisense）5′-GCCTGCGGTACAGATCTAGC 95℃ for 10 min（initial denaturation）

60℃for 40 sec（annealing）

OCN：

（sense）5′-CTCTGTCTCTCTGACCTCACAG

（antisense）5′- GGAGCTGCTGTGACATCCATAC 94℃ for 3 min（initial denaturation）

58℃for 30 sec（annealing）

反應結束後以 2％ agarose gel 進行電泳，再以 ethdium bromide （0.5 mg/mL）進行染色 15 分鐘，水洗 5 分鐘。於紫外光燈箱觀察 mRNA 是否與 maker 位置相符。最後以影像分析儀分析並拍照。再進行定量分析。

(37)

第三節統計分析

實驗數據以 SigmaPlot 10.0 統計軟體中的 Student’s t-test 來評估組間有 無統計上的明顯差異，以平均值 ± 標準誤差（mean ± SE）表示。當 p 值 小於 0.05 時被認為有統計上的差異。

(38)

第三章結果

(39)

第一節補骨脂純化物中對 MC3T3-E1 細胞的 ALP 活性及細胞存活之影響

本實驗利用造骨細胞分化早期的指標 ALP 活性來做以下的研究。圖一 A 所示為補骨脂純化物在 MC3T3-E1 細胞對於 ALP 活性的影響。細胞分別處理四個補骨脂純化物 NBIF、psoralidin、psoralen、isopsoralen （濃度 1、

5、10、20μM；以 PBS 做為控制組）共同培養三天後，測試 ALP 活性。

實驗結果顯示細胞只有在處理 NBIF 能顯著地增加 ALP 活性，而

psoralidin、psoralen、isopsoralen 則無顯著增加。此外，細胞處理 NBIF 顯著地促進 ALP 活性呈劑量相關的關係，並且 10μM NBIF 達到最大促進作用。

利用 MTT assay 偵測細胞存活率，釐清四個補骨脂純化物對於

MC3T3-E1 細胞是否有毒性，結果顯示，處理四個補骨脂純化物（濃度 1、

5、10、20 μM）的組別，與 PBS 組相比並無明顯差異，故四個補骨脂純化物於所有使用濃度下並無細胞毒性（圖一 B）。綜合以上所述，本研究以 NBIF 10μM 繼續做更進一步的探討。

第二節探討 Estrogen receptor 和 PI3K/Akt 訊息路徑在 NBIF 刺激造骨細胞分化中所扮演的角色

已知造骨細胞的分化跟成熟與 estrogen receptor、PI3K/Akt 訊息傳遞路 徑有密切相關（Tang et al., 2007; Xin et al., 2010）。因此利用 ICI 182,780

(40)

（estrogen receptor inhibitor）、wortmannin （PI3K inhibitor）來釐清 NBIF 刺激 ALP 活性中， estrogen receptor 與 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑是否參與其中。實驗方法同 ALP activity assay。細胞預處理 ICI 182,780 （1、5、10μM）

（圖二 A）或 wortmannin （0.5、1、3μM）（圖二 B）一小時後，再處理 NBIF 10 μM，共同培養三天後測試 ALP 活性。結果顯示，NBIF 10 μM 確實會增加 MC3T3-E1 細胞的 ALP 活性，而 NBIF 所增加的 ALP 活性也隨著 wortmannin 濃度的增加而顯著被抑制。雖然 ICI 182,780 在 10 μM 可抑制 NBIF 所增加的 ALP 活性，但其抑制的 ALP 活性可能是 ICI 182,780 影響細胞存活率而導致的。這暗示著 NBIF 刺激造骨細胞分化作用可能會經由 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑的調控。

第三節探討 MAPKs 在 NBIF 刺激造骨細胞分化中所扮演的角色

在造骨細胞分化過程中，亦有相關文獻指出 MAPKs 參與其中（Tang et al., 2007; Windischhofer et al., 2002）。因此本實驗利用 SB203580 （p38 inhibitor）、PD98059（ERK inhibitor）、SP600125（JNK inhibitor）來釐清 MPAKs 是否參與 NBIF 所誘導之 ALP 活性。以不同濃度的 SB203580 （1、3、

10μM）（圖三 A）、PD98059（1、3、10μM）（圖三 B）、SP600125（1、3、

10μM）（圖三 C）預處理一小時，再處理 NBIF 10 μM，共同培養三天後測試 ALP 活性。結果顯示，NBIF 10 μM 所增加的 ALP 活性僅在 SB203580 1 μM 濃度下顯著地被抑制；而 PD98059、SP600125 則無顯著影響 ALP 的

(41)

活性。這暗示 NBIF 除了可能經由 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑之外，還有可能經由促使 p38MAPK 活化，而影響造骨細胞分化。

第四節探討 p38 MAPK、PI3K/Akt 在 NBIF 刺激造骨細胞礦化所扮演的角色

上述結果發現 NBIF 可以增加 ALP 活性，接下來欲更加確定 NBIF 是否促進造骨細胞 MC3T3-E1 的活性。我們以造骨晚期之礦化作用作更進一步確認。將細胞培養 6 天後再與不同濃度（1、5、10、20μM）之 NBIF 共同培養 14 天，當造骨細胞受到刺激會誘發礦物質沉澱，可用 ARS 染色法將沉澱物進行染色，顏色越深代表礦化程度越好。圖四為 NBIF 對

MC3T3-E1 細胞礦化的表現，當加入 NBIF 1μM 時即可誘發大量鈣離子沉澱，在 10μM 的效果更為明顯，顯示 NBIF 會誘發 MC3T3-E1 細胞的礦化作用。之前本論文證實 NBIF 會刺激 MC3T3-E1 細胞分化使 ALP 活性增加，可能經由 p38 MAPK、PI3K/Akt 訊息傳遞路徑的調控；由於 NBIF 亦會誘發 MC3T3-E1 細胞的礦化作用，因此想釐清 NBIF 刺激 MC3T3-E1 細胞礦化作用是否經由 p38 MAPK、PI3K/Akt 訊息傳遞路徑。實驗方法同上述 ARS 染色法，將細胞培養 6 天後再與 NBIF 及（圖五）SB203580 （0.5、

1μM）、（圖六） wortmannin （1、3μM）共同培養 14 天，由圖可見 SB203580 及 wortmannin 皆會抑制 NBIF 所增加的礦化作用，這暗示 NBIF 對於 MC3T3-E1 細胞形成礦化骨結節可能受到 p38 MAPK、PI3K/Akt 訊息傳遞路徑調控。

(42)

第五節 NBIF 增加 p38 及 Akt 磷酸化

由於 Akt 為 PI3K 下游蛋白，可藉由活化 Akt 間接得知 PI3K 的活 性。故本實驗利用 phosphor- p38 及 phosphor- Akt 之抗體來進行 Westerrn blot 分析，來測定 p38 及 Akt 被活化的程度。如圖七，給予 NBIF 30 分鐘後 MC3T3-E1 細胞會因為 NBIF 的刺激而明顯增加 p38 及 Akt 的磷酸化。這暗示 NBIF 可誘導 MC3T3-E1 細胞之 p38 及 Akt 活化。

第六節 NBIF 在 MC3T3-E1 細胞對造骨細胞相關基因表現的影響

由上述實驗已知 NBIF 會刺激 MC3T3-E1 細胞分化、礦化以及其相關訊息傳遞之路徑。一般而言，骨細胞生長分化會因受到轉錄因子（Runx2、

OSX）的調控分泌骨基質，例如：BSP、OCN、BMP-2 等，故本實驗將細胞與 NBIF 共同培養 2 天，利用 RT-PCR 方式來偵查不同基因的表現：

Runx2、OSX、BSP、OCN、BMP-2 之 mRNA，以 GAPDH 之 mRNA 作對照組。由圖八 A 及圖八 B 可得知 MC3T3-E1 細胞受到 NBIF 刺激會隨著濃度增加轉錄因子 OSX 及 Runx2 mRNA 的表現。另外，由圖八 C 及圖八 D 可得知 MC3T3-E1 細胞受到 NBIF 刺激會隨著濃度增加骨基質 BSP 及 OCN mRNA 的表現。然而骨細胞生長分化不可或缺的骨生成蛋白 BMP-2

（圖八 E）也同樣受到 NBIF 刺激而有濃度相關的增加 mRNA 表現。

(43)

第七節 p38 及 PI3K/Akt 訊息路徑參與 NBIF 誘導造骨細胞相關基因的表現

另外，本實驗利用 SB203580 及 wortmannin 來釐清 p38MAPK、

PI3K/Akt 是否參與 NBIF 所誘導造骨細胞相關基因的表現。因此將

SB203580 及 wortmannin 分別加入細胞中預處理一小時後與 NBIF 共同培養 2 天。如上述，利用 RT-PCR 方式來偵查不同基因的表現，結果如圖九、

十，當存在著抑制劑 SB203580 及 wortmannin 時皆會隨抑制劑的濃度增加而抑制 NBIF 所增加的 Runx2、OSX、BSP、OCN、BMP-2 基因的表現。這些結果顯示在 MC3T3-E1 細胞中， NBIF 增加 Runx2、OSX、BSP、OCN、

BMP-2 基因表現受到 Akt 及 p38 的調控。

(44)

第四章討論

(45)

補骨脂為一已知傳統中藥，早期補骨脂萃取物已經被做為治療骨折

（Lim et al., 2009）的藥物，除此之外也有滋陰補陽的效用。本實驗使用中 醫所董明兆老師實驗室所萃取出的四個化合物；NBIF 為 isoflavones （異黃酮）類化合物，psoralidin 則為 coumestan 類化合物，psoralen 、isopsoralen 皆為 coumarins （香豆素）類化合物。Isoflavones、coumestan、coumarins 被指出可能有 phytoestrogen （植物性雌激素）作用。植物性雌激素可與受體結合，進行雙向調節，平衡雌激素作用。近年來對植物性雌激素的研究，尤其是異黃酮，的確可以取代部分傳統荷爾蒙（Glazier & Bowman, 2001），增 強組織的健康，以及防止一些常見的疾病，如控制停經後（Faure et al., 2002）

症狀、預防骨質疏鬆（Alexandersen et al., 2001）、降低心血管（冠狀動脈）

疾病（Wong et al., 1998），減少乳癌（Yamamoto et al., 2003）等。文獻指出 這些補骨脂化合物具有抗癌、抗發炎活性或是造骨新生的活性（Chiou et al., 2011; Wang et al., 2009; Xin et al., 2010）。目前已有補骨脂（Psoralea

corylifolia L.）粗抽物對於造骨方面的研究，也有部分對於 NBIF 的報導，

然而在 NBIF 對於刺激造骨細胞分化或礦化訊息傳遞路徑未有更深入的探討。因此，本論文利用造骨前驅細胞株 MC3T3-E1 細胞來分析 NBIF 對於造骨細胞的活性。

鹼性磷酸酶（ALP）為骨細胞分化早期的指標（Robison, 1923），當實驗結果能提高 ALP 活性，則表示可能促進造骨細胞分化。雖然 psoralidin、

psoralen、isopsoralen 被報導具有抗癌、抗發炎活性或是造骨新生的活性，

(46)

但僅有（5-20μM）NBIF 具有顯著增加 ALP 活性的能力，而在 20μM 濃度下也不具明顯細胞毒性。

造骨細胞分化過程中的三個基本過程：細胞增生（proliferation）、骨基質成熟（matrix maturation）與礦化（mineralization）（Aubin et al.,1995）。

因此利用 ARS 染色法觀察 NBIF 在不同濃度下，對於造骨細胞株

MC3T3-E1 細胞的礦物質化結節的表現，實驗證明 NBIF 在 1μM 的濃度下即能明顯增加礦化作用的能力。暗示著 NBIF 具有增加造骨細胞分化以及促使鈣離子沉澱，增加礦化作用的能力。這些結果表明 NBIF 在造骨細胞分化過程中，除了會刺激前期分化，也會促進後期礦化作用，使其能夠順利分化至骨細胞階段。

Xiao 等人在 2004 年報導，刺激造骨細胞分化主要是透過增加 OCN、

BMP-2、BSP 等骨基質的表現，幫助骨細胞走向成熟分化的階段。由本研究的實驗結果可知，經過處理 NBIF 有濃度相關的增加 OCN、BMP-2 及 BSP 這些骨基質的 mRNA 表現。因此推測，NBIF 透過增加骨基質 OCN、BMP-2 及 BSP 的分泌，刺激造骨細胞成熟分化。

MAPKs 為（絲胺酸/蘇胺酸）serine/threonine kinase 家族的一員，在細胞中扮演非常重要的腳色，參與調控細胞的生理作用，包括細胞增生、分化、

發炎反應及凋亡。許多天然物，如： osthole 等，被報導會透過誘導 p38 MAPK 訊息傳遞路徑，誘發造骨細胞分化（Chiou et al., 2010; Kuo et al., 2005）。目 前的結果表明，處理 NBIF 會誘導 MC3T3-E1 細胞 p38 磷酸化。給予 p38

(47)

抑制劑也會顯著抑制 NBIF 所誘發的 ALP 活性及礦化作用。而處理 ERK 及 JNK 抑制劑卻無法顯著抑制 NBIF 所誘導的 ALP 活性。這暗示著 MC3T3-E1 受到 NBIF 刺激所增加的 ALP 活性及礦化作用可能是透過 p38 MAPK 訊息傳遞路徑，而與 ERK MAPK 及 JNK MAPK 無直接關係。

PI3K 在細胞訊息傳遞內會引導細胞生長、調節細胞骨架的結構和抑制細胞凋亡（Toker & Cantley, 1997）。有文獻指出透過 PI3K/Akt 訊息傳遞路 徑會增加 BMP-2 的表現（Wu et al., 2008），本實驗結果發現給予 PI3K/Akt 抑制劑會抑制 NBIF 誘導的 ALP 活性及礦化作用，而 NBIF 也顯著的增加 Akt 的磷酸化。這暗示著 MC3T3-E1 受到 NBIF 刺激影響分化及成熟可能是透過 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑。

轉錄因子 Runx2 是造骨細胞分化的主要關鍵，在造骨細胞分化扮演重要的角色，當纖維原細胞生長因子（FGF-2），胰島素生長因子（IGF-1）

或者不同的細胞外基質蛋白質對造骨細胞的刺激，Runx2 會被活化並且會從 細胞質轉移到細胞核中調控造骨的基因表現（Chiou et al., 2010）。根據實驗 結果發現，處理 NBIF 有濃度相關增加 Runx2 的 mRNA 表現。另外，OSX 為另一轉錄重要基因，被發現會透過 BMP-2 增加小鼠軟骨細胞表現（Tu et al., 2006）。本實驗結果顯示 NBIF 也會隨濃度升高增加 OSX 的 mRNA

表現。這暗示 NBIF 是透過增加轉錄因子 Runx2 及 OSX 的表現，促進造骨細胞成熟及分化。而給予 p38 或 PI3K/Akt 抑制劑也會分別抑制 NBIF 所增加的 Runx2 及 OSX 表現。這顯示 NBIF 可能透過 p38 MAPK 或

(48)

PI3K/Akt 訊息傳遞路徑調控 Runx2 及 OSX 基因表現。

NBIF 刺激 MC3T3-E1 細胞增加骨基質 OCN 及 BSP、 BMP-2 的 mRNA 表現會被 p38 或 PI3K/Akt 抑制劑分別抑制。這暗示 NBIF 增加骨基質 OCN 及 BSP、 BMP-2 的表現可能經由 p38 MAPK 或 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑。

綜合上述討論，NBIF 在細胞實驗中已發現可以促進 ALP 活性以及礦化作用，刺激轉錄因子 Runx2 及 OSX 的表現，甚至刺激骨細胞分泌骨基質 OCN、BSP 及 BMP-2。而這些可能都是因為 NBIF 活化 p38 MAPK 或 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑，誘導造骨細胞走向成熟分化的階段。

(49)

第五章結論

(50)

本研究證明在 MC3T3-E1 細胞中，NBIF 呈濃度關性地促進造骨細胞分化及礦化作用；此外，推測 NBIF 對於造骨細胞的成熟作用與活化

p38MAPKs 以及 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑有關，並可能進一步增加造骨相關轉錄因子 Runx2、OSX 的表現及 BMP-2 的產生。因此，這些結果支持 NBIF 也許有利於促進骨生成作用；然而 p38MAPKs 及 PI3K/Akt 二者之間的訊息傳遞路徑是否彼此具有交互作用還需要更進一步地研究。

(51)

第六章參考文獻

(52)

Alexandersen, P., Toussaint, A., Christiansen, C., Devogelaer, J., Roux, C., Fechtenbaum, J. (2001). Ipriflavone in the treatment of postmenopausal osteoporosis: a randomized controlled trial. Journal of the American Medical Association, 285(11), 1482-1488.

Aubin, J., Liu, F., Malaval, L., Gupta, A. (1995). Osteoblast and chondroblast differentiation. Bone, 17(2), S77-S83.

Bronikowska, J.,Szliszka, E.,Czuba, ZP.,Zwolinski, D.,Szmydki, D.,Krol, W.(2010).

The combination of TRAIL and isoflavones enhances apoptosis in cancer cells.

Molecules, 15(3), 2000-2015.

Chen, J., Shapiro, H., Wrana, J., Reimers, S., Heersche, J., Sodek, J. (1991).

Localization of bone sialoprotein (BSP) expression to sites of mineralized tissue formation in fetal rat tissues by in situ hybridization. Matrix (Stuttgart,

Germany), 11(2), 133-143.

Chiao, J., Moonga, B., Yang, Y., Kancherla, R., Mittelman, A., Wu-Wong, J. (2000).

Endothelin-1 from prostate cancer cells is enhanced by bone contact which blocks osteoclastic bone resorption. British Journal of Ccancer, 83(3), 360-365.

Chiou, W.F., Don, M.J., Liao, J.F., Wei, B.L. (2011). 8-Prenylkaempferol accelerates osteoblast maturation through bone morphogenetic protein-2/p38 pathway to activate Runx2 transcription. Life Sciences. (DOI:10.1016/ j.lfs. 2010.12.009) Chiou, W.F., Don, M.J., Liao, J.F., Wei, B.L. (2011). Psoralidin inhibits psoralidin

inhibits LPS-induced iNOS expression via repressing Syk-mediated activation of PI3K-IKK-IκB signaling pathways . European Journal of Pharmacology, 650(1), 102-109.

Daculsi, G. (1998). Biphasic calcium phosphate concept applied to artificial bone, implant coating and injectable bone substitute. Biomaterials, 19(16), 1473-1478.

Deng, Z., Sharff, K., Tang, N., Song, W., Luo, J., Luo, X. (2008). Regulation of osteogenic differentiation during skeletal development. Front Biosci, 13(1),

(53)

2001-2021.

Faure, E., Chantre, P., & Mares, P. (2002). Effects of a standardized soy extract on hot flushes: a multicenter, double-blind, randomized, placebo-controlled study.

Menopause, 9(5), 329-334.

Fong, Y.C., Li, T.M., Wu, C.M., Hsu, S.F., Kao, S.T., Chen, R.J. (2008). BMP-2 increases migration of human chondrosarcoma cells via PI3K/Akt pathway.

Journal of Cellular Physiology, 217(3), 846-855.

Glazier, M., Bowman, M. (2001). A review of the evidence for the use of

phytoestrogens as a replacement for traditional estrogen replacement therapy.

Archives of Internal Medicine, 161(9), 1161-1172.

Harris, S., Bonewald, L., Harris, M., Sabatini, M., Dallas, S., Feng, J. (1994). Effects of transforming growth factor beta on bone nodule formation and expression of bone morphogenetic protein 2, osteocalcin, osteopontin, alkaline phosphatase, and type I collagen mRNA in long-term cultures of fetal rat calvarial osteoblasts.

Journal of bone and mineral research, 9(6), 855-863.

Hauschka, P., Lian, J., Cole, D., Gundberg, C. (1989). Osteocalcin and matrix Gla protein: vitamin K-dependent proteins in bone.American Physiological Society 69,990-1047.

Horowitz, M. (1993). Cytokines and estrogen in bone: anti-osteoporotic effects. Science, 260(5108), 626-627.

Horiuchi T.(2005). Soy protein intake and bone mineral density.Clinical Calcium, 15(9) 1507- 1513.

Hung, S., Pochampally, R., Chen, S., Hsu, S., Prockop, D. (2007). Angiogenic effects of human multipotent stromal cell conditioned medium activate the PI3K-Akt pathway in hypoxic endothelial cells to inhibit apoptosis, increase survival, and stimulate angiogenesis. Stem Cells, 25(9), 2363-2370.

(54)

Kumar, R.,Srinivasan, S.,Koduru, S.,Pahari, P.,Rohr, J.,Kyprianou, N.,Damodaran, C.,(2009).Psoralidin, an herbal molecule, inhibits phosphatidylinositol

3-kinase-mediated Akt signaling in androgen-independent prostate cancer cells.

Cancer Prevention Research, 2(3),234-243.

Kuo, P., Hsu, Y., Chang, C., Chang, J. (2005). Osthole-mediated cell differentiation through bone morphogenetic protein-2/p38 and extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway in human osteoblast cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 314(3), 1290-1299.

Lee, J., Libermann, T., Cho, J. (2010).The synergistic regulatory effect of Runx2 and MEF transcription factors on osteoblast differentiation markers. Journal of Periodontal & Implant Science, 40(1),39-44.

Lee, K., Hong, S., & Bae, S. (2002). Both the Smad and p38 MAPK pathways play a crucial role in Runx2 expression following induction by transforming growth factor-beta and bone morphogenetic protein. Oncogene, 21(47), 7156-7163.

Lim, S.H., Ha, T.Y., Kim, S.R., Ahn, J., Park, H. J., Kim, S. (2009). Ethanol extract of Psoralea corylifolia L. and its main constituent, bakuchiol, reduce bone loss in ovariectomised Sprague Dawley rats. British Journal of Nutrition, 101(07), 1031-1039.

Manolagas, S., Jilka, R. (1995). Bone marrow, cytokines, and bone

remodeling-emerging insights into the pathophysiology of osteoporosis. New England Journal of Medicine, 332(5), 305-311.

Matsuda, H., Kiyohara, S., Sugimoto, S., Ando, S., Nakamura, S., Yoshikawa, M.

(2009). Bioactive constituents from Chinese natural medicines. XXXIII.

Inhibitors from the seeds of Psoralea corylifolia on production of nitric oxide in lipopolysaccharide-activated macrophages. Biological & Pharmaceutical

Bulletin, 32(1), 147-149.

Nakashima, K., Zhou, X., Kunkel, G., Zhang, Z., Deng, J., Behringer, R. (2002). The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast

(55)

differentiation and bone formation. Cell, 108(1), 17-29.

Nilsson, S., Gustafsson, J. A. (2011). Estrogen Receptors: Therapies Targeted to Receptor Subtypes. Clinical Pharmacology & Therapeutics, 89(1), 44-55.

Robison, R. (1924). The Possible significance of hexosephosphoric esters in ossification.

Biochemical Journal, 18(3-4), 740-754.

Ruggiero, S., Mehrotra, B., Rosenberg, T., Engroff, S. (2004). Osteonecrosis of the jaws associated with the use of bisphosphonates: a review of 63 cases. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 62(5), 527-534.

Ryoo, H., Lee, M., Kim, Y. (2006). Critical molecular switches involved in

BMP-2-induced osteogenic differentiation of mesenchymal cells. Gene, 366(1), 51-57.

Sykaras, N., Opperman, L. (2003). Bone morphogenetic proteins (BMPs): how do they function and what can they offer the clinician? Journal of Oral Science, 45(2), 57-74.

Tang, S.-Y., Xie, H., Yuan, L.-Q., Luo, X.-H., Huang, J., Cui, R.-R., et al. (2007).

Apelin stimulates proliferation and suppresses apoptosis of mouse osteoblastic cell line MC3T3-E1 via JNK and PI3-K/Akt signaling pathways. Peptides, 28(3), 708-718.

Toker, A., Cantley, L. (1997). Signalling through the lipid products of phosphoinositide-3-OH kinase. Nature, 387(6634), 673-676.

Torgerson, D., Bell-Syer, S. (2001). Hormone replacement therapy and prevention of vertebral fractures: a meta-analysis of randomised trials. BMC Musculoskeletal Disorders, 2(1), 7-10.

Tsai, WJ.,Hsin, WC.,Chen, CC.(1996) Antiplatelet flavonoids from Seeds of Psoralea corylifolia. ACS Publications, 59 (7), 671–672.

Tu, Q., Valverde, P., Chen, J. (2006). Osterix enhances proliferation and osteogenic potential of bone marrow stromal cells. Biochemical and Biophysical Research

(56)

Communications, 341(4), 1257-1265.

Wallach, S., Farley, J., Baylink, D., Brenner-Gati, L. (1993). Effects of calcitonin on bone quality and osteoblastic function. Calcified Tissue International, 52(5), 335-339.

Wang, Y., Hong, C., Zhou, C., Xu, D., Qu, H., Cheng, Y. (2009). Screening antitumor compounds psoralen and isopsoralen from Psoralea corylifolia L. seeds.

Evidence-based Complementary and Alternative Medicine.

(doi:10.1093/ecam/nen087)

Windischhofer, W., Zach, D., Fauler, G., Raspotnig, G., Köfeler, H., Leis, H. J. (2002).

Involvement of Rho and p38 MAPK in endothelin-1-induced expression of PGHS-2 mRNA in osteoblast-like cells. Journal of Bone and Mineral Research, 17(10), 1774-1784.

Wong, R. W. K., Rabie, A. B. M. (2011). Effect of psoralen on bone formation. Journal of Orthopaedic Research, 29(2), 158-164.

Wong, W., Smith, E., Stuff, J., Hachey, D., Heird, W., Pownell, H. (1998).

Cholesterol-lowering effect of soy protein in normocholesterolemic and hypercholesterolemic men. American Journal of Clinical Nutrition, 68(6), 1385S-1389S.

Wu, J., Fong, Y., Tsai, H., Chen, Y., Tsuzuki, M., Tang, C. (2008). Naringin-induced bone morphogenetic protein-2 expression via PI3K, Akt, c-Fos/c-Jun and AP-1 pathway in osteoblasts. European Journal of Pharmacology, 588(2-3), 333-341.

Xin, D., Wang, H., Yang, J., Su, Y. F., Fan, G. W., Wang, Y. F. (2010). Phytoestrogens from Psoralea corylifolia reveal estrogen receptor-subtype selectivity.

Phytomedicine, 17(2), 126-131.

Yamaguchi, A., Komori, T., Suda, T. (2000). Regulation of osteoblast differentiation mediated by bone morphogenetic proteins, hedgehogs, and Cbfa1. Endocrine reviews, 21(4), 393.

(57)

Yamamoto, S., Sobue, T., Kobayashi, M., Sasaki, S., Tsugane, S. (2003). Soy, isoflavones, and breast cancer risk in Japan. JNCI Cancer Spectrum, 95(12), 906-913.

Zhang, X., Dowd, D., Moore, M., Kranenburg, T., Meester-Smoor, M., Zwarthoff, E., et al. (2009). Meningioma 1 (MN1) is required for appropriate osteoblast

proliferation, motility, differentiation and function. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18174-18183.

(58)

圖一、NBIF (A) Psoralidin (B) Psoralen (C) 與 Isopsoralen (D) 對 MC3T3-E1 前驅造骨細胞分化及對細胞存活率之影響

將 MC3T3-E1 (1.5×10⁴ cells/well）細胞培養於 96 wells plate 1天後，由 Psoralea corylifolia L 純化分離之四個化合物以不同濃度（1、5、10、20 μM）

的方式，共同培養，3天後，偵測（A）ALP 活性及（B）細胞存活率。結 果以平均值 ± 標準誤差值表示（n＝4）。^＊, p＜0.05；^＊＊, p＜0.01，表示與 control 組（未經藥物處理）比較的結果。

A.

B.

補骨脂活性成份 Neobavaisoflavone 促進造骨細胞分化及礦化之機轉研究