一、 LRH-1 於乳癌細胞的表現
首先我分析LRH-1 於乳癌細胞的表現，包括乳管 A 型 (luminal A) 的 MCF7 與T47D，及三陰性 (claudin-low) 的 MDA-MB-231，以人類肝癌細胞株 HepG2 做 比較。使用Santa Cruz 販賣之 LRH-1 抗體 (L-15) 偵測的結果如圖二 A 所示，於 HepG2 可觀察到 62 kDa 的訊號，T47D 及 MCF7 則表現強烈的 53 kDa 訊號。由於 Santa Cruz 停售 L-15，測試許多其他廠牌的抗體後，以 proteintech 生產的 LRH-1 抗體進行實驗，在這些細胞株可於62、53 及 40 kDa 偵測到訊號。62 kDa 的條帶 於HepG2 及 MCF7 較強，53 kDa 的條帶則以 MDA-MB-231 最為強烈，MCF7 次 之。為了確認proteintech 之 LRH-1 抗體的專一性，將帶有 FLAG 標記的人類及小 鼠LRH-1 全長蛋白質體分別轉染至 HEK293T 細胞，結果如圖二 B。proteintech 之 LRH-1 抗體可於 65 kDa 的位置偵測到條帶，且在相同位置上有強烈的 FLAG 訊 號，說明此抗體確實可辨認LRH-1。由於以 L-15 分析 HepG2 的結果和過去本實驗 室以 L-15 偵測 HepG2 表現 LRH-1 的結果相似 [43]，因此 62 kDa 的條帶應該是 LRH-1v1；而考量分子量大小及誤差，我們推測 53 kDa 的條帶可能是 LRH-1v4。
為了分析LRH-1 不同異構物的 mRNA 表現量，我設計三對引子進行 real-time RT-PCR，如圖三 A。擷取 LRH-1v1 之 5’非轉譯區 (5’-untranslated region，5’-UTR) 及exon 1 的序列，用於偵測 LRH-1v1。擷取 LRH-1v4 之 5’-UTR 的序列 (相當於 LRH-1v1 的 intron 1) 搭配 exon 2 的序列，可專一性的辨認 LRH-1v4。另外，以 exon 5 為目標設計一對引子 (LRH-1e5) 以偵測 LRH-1 的總量。結果如圖三 B，以 HepG2 的表現量為基準，發現 MCF7 的 LRH-1v1 表現量很低，但 LRH-1v4 較高。
T47D 之 LRH-1v1 的表現量同樣較 HepG2 低，LRH-1v4 則顯著高於 HepG2。而 MDA-MB-231 的 LRH-1v1 及 LRH-1v4 都顯著較 HepG2 低，甚至幾乎沒有表現
LRH-1v1。若改以 LRH-1v4 為準，比較各細胞中不同異構物的表現 (如圖三 C)，
顯示HepG2 的 LRH-1v1 表現量比 LRH-1v4 高，MCF7、T47D 及 MDA-MB-231 的 LRH-1v1 表現則皆較 LRH-1v4 低，其中 MCF7 及 MDA-MB-231 的 LRH-1v1 表現 量都顯著低於LRH-1v4。
為確認上述結果，我選用三種 LRH-1 之 shRNA (其辨認位置如圖四 A) 抑制 LRH-1 表現。MCF7 的結果如圖四 B 顯示，經三種 shLRH-1 感染後 LRH-1v1 及 LRH-1v4 的 mRNA 表現皆顯著降低，以 LRH-1v4 的效果較明顯，mRNA 的表現 皆降低7 成。MDA-MB-231 的結果如圖四 C，shLRH-1(D) 及 shLRH-1(E) 皆顯著 抑制LRH-1v4 表現，但對 LRH-1v1 沒有影響，而 shLRH-1(A) 於 MDA-MB-231 並 無抑制效果。此外，分析MCF7 感染 shLRH-1 後的蛋白質表現，如圖五 A，62 kDa 及53 kDa 的條帶訊號都明顯降低，以 shLRH-1(E) 的抑制作用較好。於 MDA-MB-231 的結果則如圖五 B 所示，62 kDa 的訊號無明顯改變，但 53 kDa 的量明顯減少，
特別是 shLRH-1(E) 的抑制效果最突出。由於 mRNA 和蛋白質的結果相符，說明 了53 kDa 為 LRH-1v4 的可能性。
根據以上的結果，LRH-1 於 HepG2 及乳癌細胞不論是 mRNA 或是蛋白質層
面，都有不同的表現型式。且蛋白質的表現量和mRNA 的表現情況並不一定吻合，
像是 MDA-MB-231 之 LRH-1 蛋白質表現強烈，mRNA 卻很低，此差異可能是因
不同細胞株之mRNA 及蛋白質穩定性的差異導致。
二、 LRH-1 啟動子 II 於乳癌細胞表現轉錄活性
先前的研究證實 LRH-1v4 是由不同的啟動子調控 [36]。將調控 LRH-1v1 及 LRH-1v4 之啟動子各擷取 2.7k 鹼基序列，分別命名為啟動子 I 及啟動子 II (圖六 A)，比較兩者於 HepG2 及三株乳癌細胞的活性。如圖六 B 所示，啟動子 I 於 HepG2
表現很高強度的活性，但啟動子II 幾乎沒有活性。相反的，啟動子 I 於三株乳癌細
胞皆不表現活性，MCF7 及 T47D 甚至出現顯著降低的現象，反而是啟動子 II 都出
現顯著的活性，以MCF7 及 MDA-MB-231 的活性較強 (圖六 C、D、E)。由上述 實驗結果說明HepG2 能以啟動子 I 調控 LRH-1v1，而乳癌細胞可能以啟動子 II 調 控LRH-1v4 表現。
接下來我想找分出調控啟動子II 的關鍵區域，便將 2.7k 鹼基序列裁短成 1k、
0.5k 及 0.2k，檢測各長度啟動子表現的活性及差異。結果顯示最短的 0.2k 的啟動 子II 即可於三株乳癌細胞表現顯著的活性，以 MDA-MB-231 最強。如圖七所示，
當長度自1k 延長至 2.7k 後活性反而降低，說明 1k 至 2.7k 之間的區域可能具有抑
制性調控的序列。以上結果顯示0.2k 的啟動子 II 上具有可調控三株乳癌細胞表現
LRH-1v4 的重要序列。
三、 Sp1 參與 LRH-1 之調控
下一步我想找出 0.2k 啟動子 II 上重要的調控序列，利用線上軟體 PROMO-ALGGEN 分析後發現三個轉錄因子的關鍵結合位，分別是位於 -59 至 -53 的細胞 核受器常見之結合序列AGGTCA，以 nuclear receptor (NR) 命名；位於 -37 至 -31 的specificity protein 1 (Sp1)，以及位於 +12 至 +20 的 specificity protein 3 (Sp3)。
將三者的關鍵序列進行單突變、雙重突變及三重突變的排列組合，突變設計如圖八 A，檢測各突變對 MCF7 及 MDA-MB-231 啟動子 II 活性之影響。MCF7 的結果如 圖八B 所示，所有突變組合中僅 Sp1 單突變、雙重突變之 NR+Sp1 及 Sp1+Sp3，
以及三重突變才出現活性顯著降低的現象，降低的幅度皆大約6 成左右，而 NR 或
Sp3 的突變皆不影響活性。MDA-MB-231 的結果和 MCF7 相似，僅含有 Sp1 突變 的情況才顯著降低活性，且降低程度達7 成 (圖八 C)，顯示 Sp1 的結合序列參與 調控啟動子II 的活性。
為釐清此序列是否由Sp1 活化，我使用 Sp1 的抑制劑 mithramycin A (MithA) 處理 MCF7 及 MDA-MB-231 24 小時，分析對啟動子活性的影響。結果如圖九 A 顯示，MCF7 之啟動子 II 在處理 MithA 24 小時後活性降低；同樣的情況亦出現於
MDA-MB-231 (圖九 B)。此外我檢測 MithA 對 LRH-1 之 mRNA 表現的影響，根據 先前的研究，MithA 可降低 MCF7 表現二氫葉酸還原酶 (dihydrofolate reductase，
DHFR)，故以此作為 MithA 的正控制 [81]。MCF7 的結果顯示 MithA 確實顯著降 低 DHFR 的表現，與先前研究的結果類似。而 MithA 也顯著抑制了 LRH-1v1 及 LRH-1v4 之 mRNA 表現量，對 LRH-1v4 的抑制效果較明顯 (圖十 A)。MDA-MB-231 僅 LRH-1v4 受到 MithA 的影響而顯著降低其 mRNA 表現量，抑制程度不如 MCF7 強 (圖十 B)。上述結果說明 Sp1 可能有參與調控此結合序列，影響 LRH-1v4 的表現。
四、 E2 及 PGE2於乳癌細胞對LRH-1 表現的影響
接著我想探究在乳癌細胞調控LRH-1 基因表現可能的機制。過去文獻指出雌
激素 (17β-estradiol，E2) 於 MCF7 可活化 LRH-1 之啟動子 I，亦刺激 LRH-1v4 及 LRH-1v5 表現 [35, 38]。將 MCF7 處理 8 或 24 小時 10 nM E2，以 pS2 作為正控制 (已知 pS2 為 ER 的目標基因 [82]) 分析 LRH-1v1 及 LRH-1v4 的 mRNA 表現。實 驗結果如圖十一A，pS2 的 mRNA 表現於 8 或 24 小時的刺激皆顯著增加，證明 E2 的作用正常。而LRH-1v1 及 LRH-1v4 之 mRNA 表現僅於 24 小時 E2 處理有上升
的趨勢，但幅度不大且未達顯著差異。此外，偵測 24 小時 E2 處理下的啟動子活
性 (圖十一 B)，發現 E2 對 2.7k 啟動子 I 無影響，反而會顯著降低 2.7k 啟動子 II 之活性。
此外，另有文獻指出LRH-1 於乳癌細胞可受到 PGE2誘發 [79, 83]。因 PGE2
可透過活化cAMP、PKA、CREB，直接調控 aromatase (CYP19A1 基因) 表現 [84, 85]，故以其作為 PGE2處理的正控制。MCF7 的結果如圖十二 A 所示，處理 1 或 10 μM PGE2 24 小時後，對 CYP19A1 及 LRH-1v4 之 mRNA 表現無明顯影響，僅 LRH-1v1 的表現有些微降低。而 MDA-MB-231 接受 1 或 10 μM PGE2 24 小時的刺 激會使CYP19A1 表現增加，但對 LRH-1v1 及 LRH-1v4 的表現則沒有明顯效果，
如圖十二B。
五、 LRH-1 於乳癌細胞對麩醯胺酸代謝的影響
過去於小鼠模式發現LRH-1 於肝癌細胞可促進 GLS2 表現，參與麩醯胺酸代 謝 [78]。因此我想檢測 LRH-1 是否亦參與乳癌細胞代謝麩醯胺酸。以 shRNA 抑 制 LRH-1 的作用，分析 MCF7 及 MDA-MB-231 中和麩醯胺酸代謝相關的基因如 solute carrier family 1 member 5 (SLC1A5) 、 glutaminase (GLS) 、 glutamate dehydrogenase 1 (GLUD1) 及 glutamine synthetase (GLUL) 的表現；於麩醯胺酸代 謝路徑之作用詳見於附圖一。同時亦檢測和葡萄糖、脂質代謝有關的轉錄因子 carbohydrate-response element-binding protein (ChREBP)，先前研究指出 ChREBP 可
透過抑制p53，促進糖解作用並調控癌細胞增生，且於將代謝方式改以糖解作用為
主的Warburg effect 扮演重要角色 [86]。結果指出，MCF7 表現之 GLS、GLUD1 及 ChREBP 皆受到 shLRH-1(D) 的影響而顯著降低，shLRH-1(E) 亦顯著抑制 GLS 表
現，對其他基因則無明顯影響 (圖十三 A)。MDA-MB-231 的數據如圖十三 B，顯 示shLRH-1(D) 及 shLRh-1(E) 皆顯著降低這些基因的表現。以上結果統整於表七。
此實驗結果說明，LRH-1 可能會影響乳癌細胞代謝麩醯胺酸的路徑，且對 MDA-MB-231 的作用較 MCF7 更為明顯。