質體

1. pcDNA3-FLAG

帶有FLAG 標籤之載體。

2. pFLGA-hLRH-1

由巨細胞病毒 (cytomegalovirus，CMV) 啟動子驅動，表現帶有 FLAG 標籤之 人類LRH-1 全長蛋白 [43]。

3. pFLAG-mLRH-1

由巨細胞病毒 (cytomegalovirus，CMV) 啟動子驅動，表現帶有 FLAG 標籤之 小鼠LRH-1 全長蛋白 [80]。

4. pGL3[Luc⁺]-Basic

帶有螢火蟲冷光酶 (Photinus pyralis) 標籤之載體。

5. pGL4.10[Luc2]-Basic

帶有螢火蟲冷光酶 (Photinus pyralis) 標籤之載體，由國立台灣大學醫學院第 一共同研究室生醫資源中心提供。

6. phLRH-1pI 2.7k-Luc

取人類NR5A2 基因前方約 2700 個鹼基序列作為啟動子，構築於 pGL3[Luc⁺ ]-Basic 上，由本實驗室楊豐名學長建構。

7. phLRH-1pII 2.7k-Luc

此質體委託國立台灣大學醫學院第一共同研究室生醫資源中心建構。擷取人類 NR5A2 基因之 intron 1 上約 2700 個鹼基序列，以 NheI-HindIII 嵌入

pGL4.10[Luc2]-Basic 中。

8. phLRH-1pII 1k-Luc

以 phLRH-1pII 2.7k-Luc 為模板，藉由聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction，PCR) 放大 NR5A2 基因之 intron 1 約 1000 個鹼基序列，將此 PCR 產物和 TA 載體 (RBC Bioscience) 連接。經過定序確認序列後，以 NheI-HindIII 切下並接 合於pGL4.10[Luc2]-Basic 之 NheI-HindIII 位置。

PCR 使用之配對引子：

Primer Sequence

Forward 5’-TTCCgctagcTCTATGAGTGAG-3’ * Reverse 5’-GATTGCCaagcttATCCGTG-3’ ^#

*小寫字母為 NheI 的辨認序列。

#小寫字母為HindIII 的辨認序列。

9. phLRH-1pII 0.5k-Luc

以phLRH-1pII 2.7k-Luc 為模板，由 PCR 反應放大 NR5A2 基因之 intron 1 約 500 個鹼基序列，將此 PCR 產物和 TA 載體連接。經過定序確認序列後，以 NheI-HindIII 切下並接合於 pGL4.10[Luc2]-Basic 之 NheI-NheI-HindIII 位置。

PCR 使用之配對引子：

Primer Sequence

Forward 5’- ATGGgctagcTTACCTCCTTCT-3’ * Reverse 5’-GATTGCCaagcttATCCGTG-3’ ^#

*小寫字母為 NheI 的辨認序列。

#小寫字母為HindIII 的辨認序列。

10. phLRH-1pII 0.2k-Luc

以phLRH-1pII 2.7k-Luc 為模板，由 PCR 反應放大 NR5A2 基因之 intron 1 約 200 個鹼基序列，將此 PCR 產物和 TA 載體連接。經過定序確認序列後，以 NheI-HindIII 切下並接合於 pGL4.10[Luc2]-Basic 之 NheI-NheI-HindIII 位置。

PCR 使用之配對引子：

Primer Sequence

Forward 5’- TACTAgctagcGGCAATAGCAG-3’ * Reverse 5’-GATTGCCaagcttATCCGTG-3’ ^#

*小寫字母為 NheI 的辨認序列。

#小寫字母為HindIII 的辨認序列。

11. phLRH-1pII mNR-Luc

以phLRH-1pII 0.5k-Luc 為模板，將啟動子 II 上 nuclear receptor (NR) 結合序列

AGGTCA 進行突變。

PCR 使用之配對引子：

Primer Sequence

Forward 5’-CCTCCTTTTTTAACCCcGAaaTCCTCCTCGCAGCTTGG-3’

Reverse 5’-CCAAGCTGCGAGGAGGAttTCgGGGTTAAAAAAGGAGG-3’

12. phLRH-1pII mSp1-Luc

以phLRH-1pII 0.5k-Luc 為模板，將啟動子 II 上 specificity protein 1 (Sp1) 的關 鍵序列進行突變。

PCR 使用之配對引子：

Primer Sequence

Forward 5’-CTCCTCGCAGCTTGGGaatGGCTCCGGAGCTGCGAGAC-3’

Reverse 5’-GTCTCGCAGCTCCGGAGCCattCCCAAGCTGCGAGGAG-3’

13. phLRH-1pII mSp3-Luc

以phLRH-1pII 0.5k-Luc 為模板，將啟動子 II 上 specificity protein 3 (Sp3) 的關 鍵序列進行突變。

PCR 使用之配對引子：

Primer Sequence

Forward 5’-CAGAGGTCCTGCCCGGCAattCCGAGGAGGCGGAGGCAC-3’

Reverse 5’-GTGCCTCCGCCTCCTCGGaatTGCCGGGCAGGACCTCTG-3’

14. phLRH-1pII mNR+Sp1-Luc

以phLRH-1pII mSp1-Luc 為模板，將啟動子 II 上 NR 結合序列 AGGTCA 進行 突變；使用之PCR 配對引子同 phLRH-1pII mNR-Luc。

15. phLRH-1pII mNR+Sp3-Luc

以phLRH-1pII mSp3-Luc 為模板，將啟動子 II 上 NR 結合序列 AGGTCA 進行

突變；使用之PCR 配對引子同 phLRH-1pII mNR-Luc。

16. phLRH-1pII mSp1+Sp3-Luc

以phLRH-1pII mSp3-Luc 為模板，將啟動子 II 上 Sp1 的關鍵序列進行突變；

使用之PCR 配對引子同 phLRH-1pII mSp1-Luc。

17. phLRH-1pII mN+1+3-Luc

以phLRH-1pII mSp1+Sp3-Luc 為模板，將啟動子 II 上 NR 結合序列 AGGTCA 進行突變；使用之PCR 配對引子同 phLRH-1pII mNR-Luc。

18. pGL4.74[hRLuc/TK]

啟動子為皰疹病毒胸腺嘧啶激酶 (herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK)，表現水母冷光酶 (Renilla reniformis) (Promega)。