第一章 序論
三、 LRH-1 的結構與調控
LRH-1 由 NR5A2 基因所轉錄，此基因位於染色體 1 號的 q32.11。LRH-1 是一 種轉錄因子，為孤兒受器，並和 SF-1 (來自 NR5A1 基因) 共同分屬於細胞核受器
家族的 5A 分支 [17]。不同於許多細胞核受器會以同型二聚體或異型二聚體的形
式和DNA 結合，LRH-1 是以單體的形式結合於目標基因的啟動子，其保守序列為
5’-YCAAGGYCR-3’ [30-32]。先前 Sablin 的研究指出 [33]，在沒有受器存在的情 況下 LRH-1 仍可維持活化狀態的構型，有持續活化的轉錄活性；而 Krylova 的研 究說明磷酯肌醇 (phosphatidyl inositols) 可做為配體調控 LRH-1 的轉錄活性 [34]。
LRH-1 為細胞核受器，有保守的蛋白結構 (圖一)，包括 A/B 結構域，此區域 有最多變的大小及序列；高度保守的DNA 結合域 (DNA-binding domain，DBD，
又稱C 結構域)，由兩個鋅指 (zinc finger) 構成，是最為保守的區域，負責和 DNA 上的保守序列結合；配體結合域 (ligand-binding domain，LBD，又稱 E 結構域)，
此區由 12 個保守的 α 螺旋 (α-helix) 組成，包含依賴配體的 activation function-2 (AF-2)，可和輔活化物 (coactivator) 進行交互作用；以及 D 結構域，作為連接 C 結構域及E 結構域的樞紐，結構靈活。此外，LRH-1 所屬的 NR5A 家族，在 C 結 構域的C 端另有作為此家族特徵的序列，Ftz-F1 box，從果蠅至人類高度相似，為 高度保守的序列 [17]。
2. LRH-1 的異構物
至今已發現五種LRH-1 蛋白異構物，如圖一。最長的異構物為 LRH-1v1；第 二種為缺失exon 2 的 hLRH-1，影響 A/B 結構域；第三種異構物 LRH-1v2 同時缺 失exon 2 及 exon 5，影響 A/B、D 及 E 結構域，無轉錄活性。三者是由選擇性剪 接 (alternative splicing) 形成 [17]。Thiruchelvam 等人於乳癌細胞株 MCF7 又發現 了另外兩種LRH-1 蛋白異構物 [35]，命名為 LRH-1v4 及 LRH-1v5。作者發現兩者 皆僅改變A/B 結構域，且 LRH-1v4 的轉錄起始位置 (transcription start site，TSS) 位於intron 1，LRH-1v5 的 TSS 則位於 intron 2。因兩者之 cDNA 皆包括 intron 序 列，說明 LRH-1v4 及 LRH-1v5 可能是由不同於 LRH-1v1 的啟動子所調控，其中 LRH-1v4 為乳癌細胞主要表現的異構物。除此之外，Kawabe 的團隊證明 LRH-1v4 會表現於KGN (人類卵巢顆粒細胞株) [36]。
Zhang 等人證明 LRH-1v1 的啟動子於肝臟有強烈的轉錄活性 [37]，包括許多 肝臟特有的轉錄因子結合序列，如 hepatocyte nuclear factor 1 (HNF1)、hepatocyte nuclear factor 3 (HNF3，尤其是 HNF3β)。Annicotte 等人則在 LRH-1v1 的啟動子序 列上發現ERα 的結合位 [38]，調控 LRH-1 表現。Kawabe 的團隊指出 LRH-1v4 啟 動子上具有SF-1 及 GC box 的結合位 [36]，且 LRH-1v4 的啟動子於 KGN 有高轉 錄活性，但不表現於HepG2 (人類肝癌細胞株)，說明 LRH-1 可利用不同的啟動子 展現組織特異性。
3. 轉譯後修飾 (post-translational modifications)
至今有許多研究已證明 LRH-1 的活性可經由接上磷酸根、泛素 (ubiquitin)、
small ubiquitin-like modifier (SUMO) 等轉譯後修飾而改變 [39]。將 LRH-1 之 D 結 構域上的絲氨酸238 及絲氨酸 243 磷酸化可提高 LRH-1 的轉錄效率 [40]。Ubiquitin-proteasome system (UPS) 可藉由蛋白酶體 ([40]。Ubiquitin-proteasome) 降解以特定形式之泛素長 鏈標記的蛋白質 [41]；其中 cullin 4 (CUL4) 是 cullin 家族的一員，和 regulator of cullins 1 (ROC1)、DNA damage binding-protein 1 (DDB1) 及能辨認特定目標的 CUL4-DDB1 associated factors (DCAFs) 組成泛蛋白連接酶 (ubiquitin-protein ligase，
E3)，標定目標蛋白 [42]。DNA damage-binding protein 2 (DDB2) 能作為 DCAF 辨 認LRH-1，導致 LRH-1 降解以調控其穩定性 [43]。當 LRH-1 和 SUMO 共價連結，
會造成 LRH-1 累積於細胞核內的 promyelocytic leukemia protein nuclear bodies (PML-NBs)，阻斷 LRH-1 的轉錄活性 [44, 45]。另外，SUMO 化的 LRH-1 會影響 聚集過來之輔助調節因子，改變LRH-1 的調控模式 [46]。
4. 輔助調節因子 (co-regulators)
到目前為止已發現許多具有組織特異性的輔活化物 (coactivator) 及輔抑制物 (corepressor) 可 調 控 LRH-1 的 轉 錄 活 性 [39] 。 Safi 的 團 隊 證 明 peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α) 可作為 LRH-1 的輔活化物 [47]，於前脂肪細胞和 LRH-1 的 AF-2 結合並促進 aromatase 表現，亦可於卵巢顯 著增強LRH-1 及 SF-1 的轉錄，參與調控類固醇生成相關的基因。此外，Yazawa 的 團隊還發現PGC-1α 增加 LRH-1 及 SF-1 轉錄活性的現象會被 dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1 (Dax-1) 抑制 [48]。PGC-1α 亦和 LRH-1 調控肝臟的膽酸恆定有關，促進 LRH-1 對 CYP7A1 的 基因表現；此現象會受到SHP 的負向控制，抑制 PGC-1α 聚集於 CYP7A1 的啟動 子序列上 [49]。
Dax-1 為非典型的細胞核受器，可和 LRH-1 的 E 結構域結合 [50]。主要表現
於性腺及胚胎幹細胞 (embryonic stem cell，ES cell) [39]。Dax-1 於人類的卵巢顆粒 細胞 (ovarian granulosa cell) 會抑制 LRH-1 調控 HSD3B2 [25]。Ahn 等人證明給予 小鼠的萊氏細胞 (Leydig cell) 胰島素 (insulin) 可刺激 Dax-1 表現 [51]，再透過 Dax-1 抑制 LRH-1 的作用，降低 LRH-1 所調控的類固醇生成。另外在乳癌細胞株 MCF7 中，受配體活化的雄性素受器 (androgen receptor，AR) 可直接促進 Dax-1 表 現，進而抑制LRH-1 對 aromatase 的調控以減少雌性素的生成，減緩癌細胞的增生 [52]。在胚胎發育的層面，Kelly 的團隊證實 Dax-1 會表現於小鼠的胚胎幹細胞 (mouse embryonic stem cell，mES cell) [53]。和 steroid receptor RNA activator (SRA) (為一種長鏈非編碼核糖核酸 (long noncoding RNA，lncNRA)，可作為細胞核受器 的輔活化物) 共同促進 LRH-1 對 octamer-binding transcription factor 4 (Oct4) 的轉 錄調控，維持mES cell 的多能性 (pluripotency) [54]。
SHP 和 Dax-1 一樣為非典型的細胞核受器，在肝臟及腸道中會大量表現，負 責調控膽酸合成及膽固醇的恆定，可結合於LRH-1 的 AF-2 [39]。膽酸合成的回饋 抑制由FXR (作為膽酸受器)、LRH-1 及 SHP 共同完成。受膽酸活化的 FXR 可佔 據SHP 啟動子序列上之 inverted repeat-1 (IR-1) 及 LRH-1 結合位 (不依賴 LRH-1)，
促進SHP 表現。SHP 除了抑制 LRH-1 對 CYP7A1 的調控，同時亦進行自身的回 饋抑制 [55, 56]。小鼠及人類的 SHP 皆可和其他輔活化物競爭 LRH-1 的 AF-2 結 合位，像是p160 及 PGC-1α；且 SHP 的 C 端結構具有自主抑制的特性，可在不影 響結合的情況下直接抑制 LRH-1 之轉錄活性 [57]。此外 Zhang 等人的研究發現 SHP 參與細胞增生相關的調控 [58]，SHP–/–小鼠的肝細胞會強烈的增生，過度表現 SHP 可回復此現象。進一步他們證明其機制為 SHP 抑制 LRH-1 的轉錄活性來降低 cyclin D1 表現，說明 SHP 具有抑制腫瘤生長的功能。He 的研究顯示 SHP 於肝細 胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC) 會因啟動子被高度甲基化而大幅降低 [59]，
應證SHP 於癌症發展的抑制作用。
已知雄性素對卵巢功能的調控扮演重要角色 [60]。Wu 等人以大鼠的初代顆粒
細胞 (primary granulosa cell) 為研究對象 [61, 62]，發現睪固酮 (testosterone) 和 AR 結合後會促使 AR 直接連結至 LRH-1 啟動子，誘發 LRH-1 及下游 aromatase、
CYP11A1 表現。睪固酮可經 5α 還原酶 (5α-reductase) 轉化成更強效的雄性素，二 氫睪固酮 (dihydrotestosterone，DHT)；經 aromatase 轉化成雌性素，作者證明此現 象並非由轉化成的DHT 或雌性素導致。此外 DHT 不會促進 LRH-1 表現，反而會 抑制睪固酮提高 LRH-1 表現的作用。因睪固酮可提高 aryl hydrocarbon receptor (AHR) 表現，誘導 AHR 和 AR 形成複合體以促進 LRH-1 的轉錄，說明此差異是 由於聚集不同的輔助調節因子所致。
四、 LRH-1 於癌症的作用
LRH-1 和癌症有密切的關係，像是增強癌細胞的增生及進程，於多種癌症扮 演重要角色 [63]。LRH-1 高度表現於控制細胞增生及更新之腸隱窩 (intestinal crypts)，促進 cyclin E1 表現；此調控可被 β 鏈蛋白 (β-catenin) 加強，且 LRH-1 作 為β-catenin 的輔助活化物，會參與調控 cyclin D1，促使腸道上皮細胞增生 [64]。
將LRH-1 進行基因靜默 (gene silencing) 會由於細胞週期之 G0/G1階段的延長而減 少細胞增生 [65]，故 LRH-1 被認為和結腸癌的形成有關 [66]。Benod 的團隊證明 LRH-1 在胰臟癌細胞中的表現量是正常細胞的 30 倍 [67]，阻斷 LRH-1 會降低和
細胞生長、增生及分化相關的LRH-1 目標基因表現，並顯著抑制癌細胞增生，說
明LRH-1 參與胰臟癌的進程。若於胰臟癌細胞中過度表現 LRH-1，則會大幅提高
癌細胞轉移、侵入的情況，顯示LRH-1 可增強癌細胞的侵略性 [68, 69]。另外，近 期的研究發現LRH-1 於去勢療法無效前列腺癌 (castration-resistant prostate cancer，
CRPC) 可提高類固醇生成相關酵素的轉錄活性，促進雄性素的合成以活化 AR 的 訊息傳遞路徑 [70]。
約75%的乳癌細胞為 ER+ [71]，可執行雌性素相關反應，對乳癌細胞的生長非 常重要 [72]。LRH-1 的目標基因 aromatase，因其將雄性素轉化為雌性素的特性，
於乳癌細胞中扮演重要角色。正常的脂肪組織使用promoter I.4 低表現 aromatase；
但在乳癌及周邊的脂肪組織中LRH-1 大量表現並提高 promoter II 的轉錄活性，使 aromatase 的表現以乳癌細胞為中心向外側的脂肪組織遞減 [28]。過去研究顯示 LRH-1 為 ERα 的目標基因 [38]，而 LRH-1 亦可聚集於 ERα 的啟動子，調控 ERα 表現 [35]。此外，LRH-1 可佔據 ERα 的結合位，促進 ERα 的目標基因表現 [72]；
Chand 的團隊亦證實 LRH-1 可和 ERα 共同結合於 ERα 結合位 [73]，促進 ERα 的 目標基因表現，像是growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1)。作者 證明 LRH-1 於 MCF7 可結合至 GREB1 啟動子上的三個 ERα 結合位，協助調控 GREB1 以促進乳癌細胞增生，證明 LRH-1 可於乳癌細胞和 ERα 合作，強化雌性 素相關的反應。除了促進乳癌細胞的增生及疾病進程，LRH-1 還會參與上皮細胞 間質轉化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)，誘發乳癌的移動及侵入，且同 時出現於MCF7 (屬於 ER+)、MDA-MB-231 (屬於 ER－) 及 MCF-10A (正常乳腺細 胞)，說明此作用並非依賴於雌性素 [63]。
LRH-1 於 肝 臟 除 了 參與 膽 固醇 、膽 酸的 恆定 外 ，亦 可調 控葡 萄糖 激酶 (glucokinase，GCK)，於葡萄糖及脂肪代謝扮演重要角色 [74]。然而癌化之細胞不 論於有氧或無氧的環境，皆減緩有氧代謝的運作，轉而進行糖解作用 (glycolysis)，
此 即 著 名 之 瓦 氏 效 應 (Warburg effect) [75] 。 此 時 細 胞 可 透 過 代 謝 麩 醯 胺 酸 (glutamine) 產 生 α 酮 戊 二 酸 (α-ketoglutarate ， α-KG) ， 再 進 入 三 羧 酸 循 環 (tricarboxylic acid cycle，TCA cycle) 補足能量及細胞生合成的需求 [76, 77]。Xu 等 人透過肝細胞專一性剔除 LRH-1 (Lrh-1hep–/– mice) 之小鼠肝癌模式，發現 LRH-1 可促進glutaminase 2 (GLS2) 表現 [78]，參與麩醯胺酸的代謝；且此調控和 GCK 的活化路徑無關。LRH-1–GLS2 路徑可進而活化 mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1)，促進細胞的增生。證明 LRH-1 於肝癌細胞亦和能量代謝有 關，並藉由調控麩醯胺酸代謝參與肝臟之腫瘤生成。
五、 研究目的
LRH-1 於細胞代謝的層面扮演重要的角色 [74]，可於肝臟表現全長的異構物 (LRH-1v1) [43]。過去有文獻指出 LRH-1 會表現於乳癌細胞 [28, 79]，且於乳癌細 胞主要表現的異構物 (LRH-1v4) 可能是由不同的啟動子所調控 [35]，但其詳細的
調控機制尚未清楚。本篇研究想探討LRH-1 於乳癌細胞的轉錄調控，及其在麩醯
胺酸代謝可能扮演的角色。
研究目標如下：
1. 分析 LRH-1 於乳癌細胞的表現型式 2. 研究 LRH-1 於乳癌細胞表現的調控機制
3. 探討 LRH-1 於乳癌細胞是否參與麩醯胺酸代謝的調控
第二章 材料與方法
一、 細胞培養 1. HepG2 細胞株
人類肝癌細胞株。細胞培養液為 MEM (Minimum Essential Media) (Thermo Fisher Scientific)，含有 10% fetal bovine serum (FBS) (Biological Industries)、100 U/mL penicillin、100 μg/mL streptomycin (Thermo Fisher Scientific)、1% sodium pyruvate (Thermo Fisher Scientific) 及 1% MEM non-essential amino acid (Thermo Fisher Scientific)，培養於 37℃、5% CO2細胞培養箱。
2. MCF7 細胞株
人類乳腺癌細胞株。細胞培養液為DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (Thermo Fisher Scientific) ， 含 有 10% FBS 、 100 U/mL penicillin 、 100 μg/mL streptomycin 及 1% sodium pyruvate，培養於 37℃、5% CO2細胞培養箱。
進行給予17β-estradiol (E2) 的實驗之前，細胞培養 3 天於 phenol red-free DMEM (Thermo Fisher Scientific)，含有 5% charcoal-stripped FBS (由國立台灣大學醫學院 生理學研究所蘇慧敏老師提供)、100 U/mL penicillin、100 μg/mL streptomycin 及 1%
sodium pyruvate。給予前列腺素 E2 (prostaglandin E2，PGE2) 的實驗，則事先將細 胞培養於不含10% FBS 的培養液中 24 小時。
3. T47D 細胞株
人類乳腺癌細胞株。細胞培養液為DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific)，含有 10% FBS 及 100 U/mL penicillin、100 μg/mL streptomycin，培養於 37℃、5% CO2
細胞培養箱。
4. MDA-MB-231 細胞株
人類乳腺癌細胞株。共使用兩種細胞培養液：第一種細胞培養液為 L-15
(Corning)，含有 10% FBS、100 U/mL penicillin、100 μg/mL streptomycin 及 1% sodium pyruvate，培養於 37℃、0% CO2細胞培養箱；第二種細胞培養液為DMEM，含有 10% FBS、100 U/mL penicillin、100 μg/mL streptomycin 及 1% sodium pyruvate，培 養於37℃、5% CO2細胞培養箱。
給予前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2) 的實驗之前，事先將細胞培養於不
給予前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2) 的實驗之前，事先將細胞培養於不