I. 整體而言,總鹼度是 DO2A > ODO2A,而 pKh也是 DO2A > ODO2A,
穩定常數也是 DO2A > ODO2A。在動力學上,EuODO2A+的雙體水解 BNPP 速率要比單體快,而整體速率比 EuDO2A+慢。
II. 設計一個優良的人工水解酶需要良好的配位子配合適當的金屬離 子,理論上來說路易士酸性越強的金屬切割效率越好,但是若與配位子 錯合後的情況就會變得複雜。離子的大小與配位子的相關位置,會進而 影響到配位水的數量。即便 LnODO2A+與 LnDO2A+一樣擁有 2~3 個配位 水,但是在水溶液中形成雙體的趨勢就不同,而雙體的活性更是影響反 應速率的極大因素,而更進一步形成的多體的低活性也是必須避免的。
III. 鑭系金屬由於配位數高,在水溶液中的物種組成本來就比較複雜。
在最近發表的鑭系金屬離子水解 BNPP 反應,利用加入簡單的負離子化 合物 4-ICA(4-imidazolecarbocylic)來穩定鑭系金屬離子的雙體化36。而未 來我們也可以詴著加入另外的穩定劑來抑制我們的大環錯合物多體的 產生,而將平衡趨於雙體的產生。從這點來看,也許構型較具有彈性的 LnODO2A+比起 LnDO2A+有更快的速度來形成有活性的雙體。
IV. 除了控制雙體的產生以外,我們也可詴著自己合成雙體。目前本實 驗室也進行了 DO2A 及 NO2A 的雙體合成,但是架橋的分子必須多加選 擇,在 NO2A 的雙體合成中使用了帶有苯基的分子,希望能更將雙體結 構穩固,但是近來研究發現會將鑭系金屬錯合穩定常數降低太多,所以 必須選用其他的架橋分子。此外要能將金屬離子之間保持適當距離,讓 配位水能夠互相幫忙穩定受質而不會自己結合讓活性降低,也是研究的 重點。
64
V. 在結構的研究上,我們也希望能夠將多體結構結晶出來,以證實我 們的推論。而從結構上我們更能了解錯合物形成多體的關鍵處,並且對 症下藥,以改進人工水解酶的效率。
65
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附錄一、NMR 13 C 圖譜
68
附錄二、2D-NMR gHETCOR 圖譜
69
附錄三、ESI + MASS 圖譜
70
附錄四、LnODO2A
+滴定曲線
mol of TMAOH / mol of ODO2A
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
0 2 4 6 8 10 12
LUODO2A YbODO2A TmODO2A ErODO2A HoODO2A DyODO2A TbODO2A GdODO2A EuODO2A SmODO2A NdODO2A PrODO2A CeODO2A LaODO2A ODO2A
71
附錄五、LnODO2A
+水解 BNPP 之 pH 效應
EuODO2A+水解 BNPP 之 pH 效應,400nm 吸收值與時間關係圖
[EuODO2A+] = 1 mM,[BNPP] = 0.1 mM、[buffer] = 75 mM
(TAPS pH 8.0、pH8.5;CHES pH 9.0、pH 9.5;CAPS pH 10.0、pH 10.5;CABS pH 11.0),μ=0.1 M
較高濃度 EuODO2A+水解 BNPP 之 pH 效應,400nm 吸收值與時間關係圖
[EuODO2A+] = 2 mM,[BNPP] = 0.2 mM、[buffer] = 75 mM
(TAPS pH 8.0、pH8.5;CHES pH 9.0、pH 9.5;CAPS pH 10.0、pH 10.5;CABS pH 11.0),μ=0.1 M
Time(s)
0 5000 10000 15000 20000
Absorbance
0 2000 4000 6000
AU
72
YbODO2A+水解 BNPP 之 pH 效應,400nm 吸收值與時間關係圖
[YbODO2A+] = 1 mM,[BNPP] = 0.1 mM、[buffer] = 75 mM
(TAPS pH 8.0、pH8.5;CHES pH 9.0、pH 9.5;CAPS pH 10.0、pH 10.5;CABS pH 11.0),μ=0.1 M
較高濃度 YbODO2A+水解 BNPP 之 pH 效應,400nm 吸收值與時間關係圖
[YbODO2A+] = 3 mM,[BNPP] = 0.3 mM、[buffer] = 75 mM
(TAPS pH 8.0、pH8.5;CHES pH 9.0、pH 9.5;CAPS pH 10.0、pH 10.5;CABS pH 11.0),μ=0.1 M Time(s)
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000
AU
0 5000 10000 15000 20000