動力學研究

1. CeODO2A⁺在 UV 光區有吸收值，藉此觀察不同 pH 值對於 CeODO2A⁺溶液中物種的變化。

2. LnODO2A⁺ (Ln = Eu、Yb)在不同 pH 值下水解 BNPP，監測 400nm 吸光值。

3. 選擇其中反應性好的 pH 值，讓不同濃度的 LnODO2A⁺水解 BNPP，

監測 400nm 吸光值。

B. 實驗環境

LnODO2A⁺ 1~8mM、BNPP 0.1~0.3mM、μ=0.1M、

Buffer=75~100mM，總共 1 ~2ml。離子強度的計算需考慮金屬錯合物 以及緩衝液所佔的比例，金屬錯合物的計算在滴定章節已經敘述過，

這裡在加上緩衝液的離子強度為：�

依照 Henderson-Hasselbalch 方程式 pH = p𝐾_a+ log _HA ^A− 若是 pH9.0 的 CHES 緩衝液，則為

9.0 = 9.3 + log ^A _HA ⁻ → _HA ^A− = 0.501 則緩衝液產生的離子強度為

Buffer × A⁻

HA + A⁻ = 0.075M × 0.501

1.501= 0.00668M 所以要補足的離子強度為

μ = 0.1 − 0.00668 − 0.005 1mM ML 的離子強度 = 0.0881M 換算成體積則為

0.0881M × 1ml(總體積)

2M(TMACl) = 0.04405ml

42

43

在上述的反應式內[LnODO2A⁺]就可以與 k 合起來視為 K_obs，就是對 BNPP 的假一次反應(pseudo-first-order reaction)

III. 結果與討論

[CeODO2A⁺]=1.0 mM，[buffer]=20 mM (TAPS pH 8.0；CHES pH 9.0；CAPS pH 10.0、pH 10.5；

CABS pH 11.0），μ=0.1 M；[Ce³⁺]=1.0mM pH8.0；[ODO2A]=1.0 mM

Wavelength(nm)

200 250 300 350 400

AU

44

[CeODO2A⁺]=1.0 mM，[buffer]=20 mM

（TAPS pH 8.0；CHES pH 9.0；CAPS pH 10.0、pH 10.5；CABS pH 11.0），μ=0.1 M

ODO2A 在這裡的結果與之前實驗室研究的 DO2A 的結果十分 接近，在 294nm (DO2A 是在 291nm)的吸收值上升的跡象穩定。

而 NO2A、ONO2A 則是很快就產生吸收值降低的現象，尤其在高 pH 值的部分，吸光值上升的速度快，但是也很快就產生沉澱並且 連帶吸光值一起下降。而 ODO2A 在經過 20000 秒的反應並無明顯 沉澱產生。在這裡我們簡單的推測，在高 pH 值 ODO2A 與 DO2A 有相當的穩定程度，也比九元環系列的 NO2A、ONO2A 的穩定度 要高。而依照其他配位子的推測，ODO2A 應該也是產生了多核物

Time(s)

0 5000 10000 15000 20000

AU

45

種，但是形成沉澱的速度要比九元環要慢，在結構轉變的速度上 比較慢。

而將前 1000 秒的數據用相對初始速率(Relative Initial Rate) 去計算，並且取對數後對 pH 值作圖(圖 5-3)。

圖 5-3、CeODO2A⁺ 294nm 物種變化相對初始速率圖與 pH 值關係圖

[CeODO2A⁺]=1.0 mM，[buffer]=20 mM

（TAPS pH 8.0；CHES pH 9.0；CAPS pH 10.0、pH 10.5；CABS pH 11.0），μ=0.1 M

這是將反應推測為

Rate = 𝑘 OH^{− x} 取對數後

log Rate = log 𝑘 + x log[OH⁻]

但是實驗結果並如此推測為直線，所以我們進行下一組實驗。

pH

6 7 8 9 10 11 12

Log(Relative Initial Rate) (M s-1 )

-9.8 -9.6 -9.4 -9.2 -9.0 -8.8 -8.6 -8.4

46

3. CeODO2A⁺在 pH 10.5 下的 294nm 吸收值隨時間變化的濃度效應 藉由改變 CeODO2A⁺的濃度，來看在 294nm 吸收的物種是否 隨著濃度上升而產生速率上升(圖 5-4)。觀測 294nm 20000 秒的 結果顯示，不同濃度的速率並無顯著不同。

圖 5-4、不同濃度的 CeODO2A⁺在 pH10.5 時 294nm 吸收值與時間關係圖

[CeODO2A⁺]=0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mM，[buffer]=20 mM（CAPS pH 10.5），μ=0.1 M

若取前 300s 的數據來計算相對初始速率，並取對數與濃度 對數作圖(圖 5-5)，可以套入這個公式

Rate = 𝑘 CeODO2A^{+ x} 取對數 log Rate = log 𝑘 + x log[CeODO2A⁺]

47

圖 5-5、CeODO2A⁺濃度與相對初始速率取對數關係圖

曲線雖有上升的趨勢，但是斜率只有 0.3，而且 1mM 到 2.5mM 這四點幾乎沒有差別，所以在這裡我們不認為 294nm 物 種的生成與原來的 CeODO2A⁺濃度有直接關係。

Log (CeODO2A⁺) (M)

-3.4 -3.2 -3.0 -2.8 -2.6 -2.4

Log (Relative Initial Rate) (M s-1 )

-4.65 -4.60 -4.55 -4.50 -4.45 -4.40 -4.35 -4.30

y = 0.301x - 3.569 R² = 0.890

48

B. LnODO2A⁺(Ln = Eu,Yb)水解 BNPP 反應在不同 pH 之效應

1. EuODO2A⁺ 水解 BNPP 反應在不同 pH 值之效應

我們選取了以 0.5 為間隔的 pH 值去進行反應，得到的吸光值 隨時間的變化，取大約 600s 依照原理去計算反應初始速率。(圖 5-6)。

圖 5-6、EuODO2A⁺水解 BNPP 之初始速率與 pH 值關係圖

[EuODO2A⁺] = 1 mM，[BNPP] = 0.1 mM、[buffer] = 75 mM

（TAPS pH 8.0、pH8.5；CHES pH 9.0、pH 9.5；CAPS pH 10.0、pH 10.5；CABS pH 11.0），μ=0.1 M

EuODO2A⁺的趨勢與其他錯合物類似，到了 pH 10 速率開始有 顯著增長。不過到了 pH 11 時急遽降低，這個結果與 EuNO2A⁺的 情況比較類似。從這個圖導出的 pK_h約在 9.5~10 之間。

而考量到此濃度條件下，切割比較緩慢，測量的數據較低，

誤差稍大。我們將錯合物與 BNPP 濃度各增加兩倍，得到類似的 關係圖。整體來說趨勢也是一樣，在 pH 10 左右速率就往上升， (圖 5-7)。

pH

7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5

Initial Rate (M s-1 )

-1e-9 0 1e-9 2e-9 3e-9 4e-9 5e-9 6e-9 7e-9

49

圖 5-7、較高濃度之 EuODO2A⁺水解 BNPP 之初始速率與 pH 值關係圖

[EuODO2A⁺] = 2 mM，[BNPP] = 0.2 mM、[buffer] = 100 mM

（TAPS pH 8.0、pH8.5；CHES pH 9.0、pH 9.5；CAPS pH 10.0、pH 10.5；CABS pH 11.0），μ=0.1 M

我們將初始速率除以 BNPP 濃度即為假一次速率常數 k_obs，將 k_obs

Initial Rate(M s-1)

0

50

51

2. YbODO2A⁺水解 BNPP 反應在不同 pH 值之效應

選用同樣的 pH 值去切割 BNPP。得到吸光值隨時間變化，取 大約 600s 依照原理去計算反應初始速率(圖 5-10)。

圖 5-10、 YbODO2A⁺水解 BNPP 之初始速率與 pH 值關係圖

[YbODO2A⁺] = 1 mM，[BNPP] = 0.1 mM、[buffer] = 75 mM

（TAPS pH 8.0、pH8.5；CHES pH 9.0、pH 9.5；CAPS pH 10.0、pH 10.5；CABS pH 11.0），μ=0.1 M

圖中 pH10 以上的實驗的誤差較大，這主要是因為在此條件 下 YbODO2A⁺的切割速率更低，以至於 600s 以內時吸收值最高不 過 0.01~0.02，其餘速率慢的滴 pH 值更低，機器的測量誤差影響 就蠻大的。在這裡我們將錯合物及 BNPP 濃度皆提高三倍，假設 反應級數都為一，速率就可提升九倍，吸光值應該可以到 0.1 左 右，曲線會穩定許多(圖 5-11)。

pH

7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5

initial rate(M S-1 )

-4.0e-10 -2.0e-10

0.0 2.0e-10 4.0e-10 6.0e-10 8.0e-10 1.0e-9 1.2e-9 1.4e-9 1.6e-9

52

圖 5-11、較高濃度 YbODO2A⁺水解 BNPP 之初始速率與 pH 值關係圖

[YbODO2A⁺] = 3 mM，[BNPP] = 0.3mM、[buffer] = 100 mM

（TAPS pH 8.0、pH8.5；CHES pH 9.0、pH 9.5；CAPS pH 10.0、pH 10.5；CABS pH 11.0），μ=0.1 M

將濃度提高後，速率大約增加了 9~10 倍，若是 YbODO2A⁺ 級數為 1 左右的話，實驗結果還算與低濃度的一致。但是趨勢也 是一樣。高 pH 值反應速率的提高是我們所預期的，不過 pH 10.5 這組速率突然下降的原因，一時無法解釋。

pH

7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5

initial rate(M S-1 )

0.0 2.0e-9 4.0e-9 6.0e-9 8.0e-9 1.0e-8 1.2e-8

53

C. LnODO2A⁺(Ln = Eu、Yb)在同 pH 值下水解 BNPP 反應，錯合物濃度變化 效應

1. EuODO2A⁺ 濃度效應

從 pH 效應實驗觀察到 EuODO2A⁺在切割 BNPP 上效果要比 YbODO2A⁺要來的優秀，本實驗室也在 DO2A、NO2A 上已經觀察到 這種現象。在 EuODO2A⁺的部分(圖 5-12)，我們選擇反應最快的

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

Absorbance

54

1.83，超過 1 級不及 2 級，依照本實驗室的經驗，應該是由於有 更具反應活性的雙體產生，所以造成反應級數大於 1。除此之外 在高濃度的部分，速率增長有飽和的現象，有可能是因為在此濃 度下，不具有活性或是較低活性的多核體的產生的比例要比更有 活性的雙體多，所造成速率增加的飽和現象。另外一種推測就是 BNPP 被水解後產生的 NPP 與 Nitrophenol 也會回去與 EuODO2A⁺ 結合，這樣會與剩下的 BNPP 產生競爭的效果，當 BNPP 濃度相對 的低的時候，反應就趨緩了，因為 EuODO2A⁺被產物阻擋而失去活 性。

圖 5-13、EuODO2A⁺的級數，直線回歸斜率為 1.833

進一步將初始速率套到假一次速率常數式裡，把初始速率除 以[BNPP]即為 K_obs，再對[EuODO2A⁺]作圖(圖 5-14)。得到的關係圖 近似直線，若用套用到直線方程式來看，是一斜率為 0.154 的直 線。雖然實際反應應該更複雜，但從方程式來看應該不是直線，

而是接近二次式的圖。

𝑘_obs = 𝑘[LnODO2A⁺]^x

Log[EuODO2A⁺] (M)

-3.2 -3.0 -2.8 -2.6 -2.4 -2.2 -2.0

Log Initial Rate (M s-1 )

-9.0 -8.5 -8.0 -7.5 -7.0 -6.5

y = 1.833x - 2.981 R² = 0.952

55

圖 5-14、EuODO2A⁺水解 BNPP 假一次速率常數與濃度關係圖

所以我們將數據套用到另一個單體-雙體反應動力學模型公 式(Monomer-Dimer Reaction Model) (圖 5-15)

2EuODO2A^{+ 𝐾} (EuODO2A^{f +})₂ EuODO2A⁺+ BNPP^𝑘 P ¹ (EuODO2A⁺)₂+ BNPP^𝑘 P ²

Rate = 𝑘₁[EuODO2A⁺] BNPP + 𝑘₂[(EuODO2A⁺)₂][BNPP]

𝐾_f =[(EuODO2A⁺)₂]

[EuODO2A⁺]² 代入上式得到

Rate = 𝑘₁[EuODO2A⁺] BNPP + 𝑘₂𝐾_f EuODO2A^{+ 2}[BNPP]

而𝑘_obs = 𝑘₁[EuODO2A⁺]_T+ 𝑘₂𝐾_f EuODO2A⁺ _T ²

[EuODO2A⁺] (M)

0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010

kobs(s-1 )

0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0012

y = 0.154x -0.0001 R2 = 0.998

56

圖 5-15、將 EuODO2A⁺之 Kobs與濃度關係套入 Monomer-Dimer Reaction Model 所得的結果。

經由軟體計算後，我們得到 k₁ = 1.214 × 10^-9 M^-1s^-1、k₂ = 0.4184 M^-1s^-1、K_f = 372.29M^-1 (R²=0.9977)。從這數據看來，雙體的反應性 要比單體好上很多，而且雙體的比例非常高。但是在 EuDO2A⁺的 狀況，K_f只有 8.2 M^-1，相較之下 EuODO2A⁺形成雙體的傾向非常明 顯，這也許是因為 ODO2A 在構型上比 DO2A 要有彈性所造成傾向 於雙體構型，但是整體上來說速率還是稍低於 EuDO2A⁺。

我們討論另一個動力學模型，將單體與雙體跟 BNPP 結合的 能力考慮進去，套到單體-雙體平衡與受質平衡動力學模型(圖 5-16) (Monomer-Dimer Equilibrium and Complex-Substrate pre-Equilibrium Model)。

EuODO2A⁺+ BNPP^𝐾 EuODO2A^{m 1 +}-BNPP^𝑘 P ^p 2EuODO2A^{+ 𝐾} (EuODO2A^{f +})₂

(EuODO2A⁺)₂+ BNPP^𝐾 (EuODO2A^{m 2 +})₂-BNPP^𝑘 P ^q Rate = 𝑘_p EuODO2A⁺-BNPP + 𝑘_q[(EuODO2A⁺)₂-BNPP]

[EuODO2A⁺](M)

0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010

Kobs(s-1 )

0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0012

57

圖 5-16、將 EuODO2A⁺之 Kobs及濃度關係套入 Monomer-Dimer Equilibrium and Complex-Substrate pre-Equilibrium Model 所得的結果。

經過軟體計算的結果，得到單體雙體與 BNPP 結合常數 K_m1 = 33.39 M^-1、K_m2 = 1761.12 M^-1，以及錯合中間物之一次速率常數 k_p

= 7.99 × 10^-12 s^-1、k_q = 2.4 × 10^-3 s^-1，最後雙體形成常數為 K_f = 12.29 M^-1，R² = 0.9994。從圖看起來，實驗數據比較適用此模型。而從 數據來看，雖然與 BNPP 結合能力雙體要高些，但不會太高，不 過速率常數就還是雙體要比單體高了 3 × 10⁸倍，與前一個模型算 出的速率常數大約一樣(3.45 × 10⁸倍)。在雙體形成常數上，就只 有 12.29 M^-1，比前個模型算出來的 372 M^-1 低很多，但是跟 EuDO2A⁺以此模型所算的雙體形成常數一樣(12 M^-1)，這可能代表 EuODO2A⁺形成雙體的趨勢仍然與 EuDO2A⁺近似，但是雙體的催化 效率比單體好很多是肯定的。

[EuODO2A⁺ ](M)

0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010

Kobs(s-1 )

0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0012

58

2. YbODO2A⁺濃度效應

我們選擇反應最快的 pH 10，用不同濃度的 YbODO2A⁺水解 BNPP，持續觀察了 20000 秒，觀察到反應呈現一個漸漸飽和的情 形，切割速率越來越低，8mM 這組到了 15000 秒已經漸成直線(圖

0 5000 10000 15000 20000

AU

59

圖 5-18、YbODO2A⁺的級數，直線回歸斜率為 1.160

YbODO2A⁺的級數為 1.16，只略大於 1，這可能代表具有較強 反應活性的雙體形成較少，或是雙體活性比較低。我們也將 YbODO2A⁺的數據套入單體-雙體反應動力學模型公式(圖 5-19) (Monomer-Dimer Reaction Model)

圖 5-19、將 YbODO2A⁺之 Kobs與濃度關係套入 Monomer-Dimer Reaction Model 所得的結果。

Log [YbODO2A⁺] (M)

-3.2 -3.0 -2.8 -2.6 -2.4 -2.2 -2.0

Log Initial Rate (M s-1 )

-9.2

0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010

kobs(s-1 )

60

經由軟體計算得到 k₁ = 0.0068 M^-1s^-1、k₂ = 0.035 M^-1s^-1、K_f = 1146.42 M^-1 (R²=0.9998)，雙體形成常數 K_f非常高，但是速率常數只有增加 五倍，與 EuODO2A⁺的結果有所不同，可能是 YbODO2A⁺形成的雙 體活性提升的不多。

而我們同樣套用到另一個單體-雙體平衡與受質平衡動力學 模型 (Monomer-Dimer Equilibrium and Complex-Substrate pre-Equilibrium Model)。 (圖 5-20)

圖 5-20、將 YbODO2A⁺之 Kobs及濃度關係套入 Monomer-Dimer Equilibrium and Complex-Substrate pre-Equilibrium Model 所得的結果。

得到單體雙體與 BNPP 結合常數 K_m1 = 1789.13 M^-1、K_m2 = 84.25 M^-1，以及錯合中間物之一次速率常數 k_p = 1.65 × 10^-14 s^-1、k_q = 0.0811 s^-1，最後雙體形成常數為 K_f = 4.57 M^-1，R² = 0.99997。這個 結果比較矛盾，因為單體與 BNPP 的結合常數如此高，但反應速 率又很低；而雙體的結合度低，但是反應速率又高。而雙體形成 常數只有 4.5 M^-1，這讓我們懷疑雙體的形成是否存在，而雙體的 活性究竟是高還是低。

[YbODO2A⁺](M)

0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010

kobs(s-1 )

0.0 2.0e-5 4.0e-5 6.0e-5 8.0e-5 1.0e-4 1.2e-4 1.4e-4 1.6e-4

61

(Monomer-Dimer Reaction Model)

Scheme 2

(Monomer-Dimer Equilibrium and Complex-Substrate pre-Equilibrium Model) 2LnL^{+ 𝐾} (LnL^{f +})₂

62

多體的快速產生，以至於高活性雙體實際反應的時間很少，這情 形在 EuNO2A⁺也有見到。在 pH 效應的實驗中，pH 11 的反應在 1000s 就已經平衡不再繼續水解。需要更複雜的方程式來解釋。

而我們也應該多增加幾組 pH 值來進行水解 BNPP 的反應，以便更 清楚的觀察到更精確的 LnODO2A⁺ 各個 pK_h值。

而 YbODO2A⁺的部分，數值與實際情形不太符合，YbODO2A⁺ 在之前的研究認為，與十二元環錯合時，由於 Yb³⁺較小，錯合時 比較深入環穴，容易造成只有形成兩個配位水的空間，若形成雙 體則會失去活性。而在 YbODO2A⁺的情形，YbODO2A⁺可能也是有 無活性雙體與高活性雙體的平衡，只是組成比例與 EuODO2A⁺有很 大不同，傾向於無活性雙體。我們可以詴著多用幾種介於 Eu³⁺以 及 Yb³⁺的鑭系金屬，觀察是否有某種趨勢，以便裡出其中的物質 組成情形。

63

第六章、結論與未來展望

I. 整體而言，總鹼度是 DO2A > ODO2A，而 pK_h也是 DO2A > ODO2A，

穩定常數也是 DO2A > ODO2A。在動力學上，EuODO2A⁺的雙體水解 BNPP 速率要比單體快，而整體速率比 EuDO2A⁺慢。

II. 設計一個優良的人工水解酶需要良好的配位子配合適當的金屬離 子，理論上來說路易士酸性越強的金屬切割效率越好，但是若與配位子

II. 設計一個優良的人工水解酶需要良好的配位子配合適當的金屬離 子，理論上來說路易士酸性越強的金屬切割效率越好，但是若與配位子

在文檔中 大環配位子ODO2A之穩定常數研究與其鑭系金屬錯合物之水解磷酸酯鍵效力 (頁 47-0)