本篇利用脂族羥基酸修飾的金屬氧化物層析法(aliphatic hydroxyl acid-modified metal oxide chromatography, HAMMOC)純化磷酸化胜肽並搭 配 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 分 析 技 術 (liquid chromatography tandem mass 酸化位點)，並以 label-free 進行控制組與刺激組之相對定量分析，挑選 114 個差異表現的磷酸化蛋白質。
結果顯示選用 HAMMOC 搭配 LC-MS/MS 適合深入研究磷酸化蛋白質 體學的定性和定量分析。期望未來能以 HAMMOC 純化方法搭配同重元素 相對與絕對定量標定(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)進行相對定量分析，並挑選出具有差異表現的磷酸化蛋白質，以探 討相關生物資訊。
50
附圖
圖 1、磷酸化與去磷酸化(Phosphorylation-Dephosphorylation)循環
圖 2、O-phosphates 之磷酸化
O-phosphates 是修飾在絲胺酸(serine, Ser)、蘇胺酸(threonine, Thr)或酪胺酸 (tyrosine, Tyr)位置，各別簡稱為 pS、pT 與 pY。
51
圖 3、常見分析磷酸化蛋白質方式
首先將蛋白質從細胞或組織中萃取出來，選擇合適的水解酵素將蛋白質水 解成胜肽，接著藉由純化技術分離磷酸化胜肽與非磷酸化胜肽，最後將磷 酸化胜肽送入質譜儀分析，鑑定磷酸化位點，更可以進一步了解相關的生 物資訊分析。
52
圖 4、純化磷酸化蛋白質與磷酸化胜肽示意圖
現今成功開發純化方法分為兩群，即化學衍生法及親和性層析法，化學衍生法又可分為β-elimination 與 PAC，而親和性層 析法也可分為免疫沉澱法、固定相金屬親和層析法、金屬氧化物親和層析法與固定相金屬親和層析連續洗脫法。
53
圖 5、以 β-elimination 純化磷酸化胜肽
以磷酸化絲胺酸(pS)為例，藉由 β-elimination 將磷酸化絲胺酸(pS)衍生化，
採用 Michael addition 方法將生物素(biotin tag)標記於脫去磷酸基團的胜肽 上，透過含有親和素(avidin)的層析管柱純化已脫去磷酸基團的磷酸化蛋白 質或磷酸化胜肽。
54
圖 6、以 Phosphoramidate Chemistry (PAC)純化磷酸化胜肽
以磷酸化絲胺酸(pS)為例，先藉由碳二亞胺濃縮反應使得半胱胺酸(cysteine) 修飾在磷酸基團上，修飾上半胱胺酸的磷酸化胜肽會以共價鍵與碘乙酰胺 樹脂鍵結，最後以酸液洗滌釋放已修飾的磷酸化胜肽。
55
圖 7、固定相金屬親和層析法(IMAC)示意圖
(A) 將樣品加入已平衡好的 IMAC 管柱中。(B) 加入洗液，以去除非特異性鍵結，磷酸化胜肽仍與 IMAC beads 鍵結。
(C) 加入洗脫液體，將磷酸化胜肽洗脫而出。
56
圖 8、固定相金屬親和層析法(IMAC)之螯合基
(A) 三螯合基 iminodiacetic acid (IDA)(B) 四螯合基 nitrilotriacetic acid (NTA)
圖 9、含有羧基(-COOH)側鏈的胺基酸
(A)天冬胺酸(aspartic acid, Asp, D)(B)麩胺酸(glutamic acid, Glu, E)
57
圖 10、去胺基化(Deamidation)
去胺基化反應屬於與 glycine (Gly)有關的自發反應，以 asparagine (Asn)為 例，因 Gly 中的胺基容易使 Asn 中的自由胺基斷鑑形成含氮的五環結構，
但仍會共振成 aspartic acid (Asp)或 isoaspartic acid。
58
圖 11、金屬氧化物親和層析法(MOAC)示意圖
(A) 將樣品裝入已平衡好的 MOAC 管柱中。(B) 加入洗液，以去除非特異性鍵結，磷酸化胜肽仍與 TiO2 beads 鍵結。
(C) 加入洗脫液體，將磷酸化胜肽洗脫而出。
59
圖 12、在金屬氧化物親和層析法中常用之脂族羥基酸
(A) 2,5-DHB(B) benzoic acid (C) salicylic acid (D) phthalic acid (E) 乳酸(lactic acid)
60
圖 13、以脂族羥基酸修飾的金屬氧化物層析法(HAMMOC)純化磷酸 化胜肽之作用機制
(A) 先加入乳酸(lactic acid)與二氧化鈦鍵結。
(B) 加入樣品，磷酸化胜肽取代乳酸與二氧化鈦鍵結，而非磷酸化胜肽無。
(C) 加入洗液將非磷酸化胜肽洗出。
(D) 加入洗脫液體(piperidine)將磷酸化胜肽洗脫而出。
61
圖 14、等電點聚焦(OFFGEL)流程圖
(A)放置 IPG 膠條並與樣品槽扣緊，添加 rehydration solution 覆蓋 IPG 膠條。
(B)吸取等量樣品加入樣品槽後，蓋上密封條避免樣品揮發。
(C)施加高電壓讓樣品在膠條間移動，移到各自等電點位置上停留。
(D)分離後之樣品存於緩衝液內，便於取出做後續實驗。
62
(A)
(B)
圖 15、離子交換層析法(IEX)鍵結示意圖
(A) 強陽離子交換層析法(strong cation exchange chromatography, SCX) (B) 強陰離子交換層析法(strong anion exchange chromatography, SAX)
63
(A)
(B)
圖 16、親水性作用層析法與靜電排斥親水性作用層析法鍵結示意圖
(A) 親 水 性 作 用 層 析 法 (hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)(B) 靜 電 排 斥 親 水 性 作 用 層 析 法 (electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography, ERLIC)
64
圖 17、電噴灑游離法(Electrospray Ionization, ESI)機制圖
65
圖 18、LTQ XL 裝置圖
分析物經由電噴灑離子化後，送入四極桿與八極桿並集中通過，離子到達線性離子阱分析，在線性離子阱旁有兩個偵測器 使得偵測更加靈敏。
66
圖 19、LTQ Orbitrap XL 裝置圖
分析物經由電噴灑離子化後，送入四極桿與八極桿並集中通過，離子到達線性離子阱進行 CID 碰撞，碎片離子於 C-Trap 聚集，並最後於 orbitrap 進行質量分析與偵測。
67
圖 20、質譜中胜肽離子碎片形式
圖中胺端(N-terminal)之碎片分別為 a、b、c 三類，碳端(C-terminal)之碎片分別為 x、y、z 三類，數字則表示胺基酸的順序。
68
圖 21、質譜掃描模式
(A)產物離子掃描(product ions scanning) (B)前驅離子掃描(precursor ions scanning) (C)中性丟失掃描(neutral loss scanning)
69
(A)
(B)
(C)
圖 22、以 Mascot 搜尋結果之範例
(A)在 MS 圖譜中，以絲胺酸(Ser)為例其含兩個磷酸修飾可偵測到多 80 Da×2=160 Da 的訊號。(B)在 MS2圖譜中，在 serine 位點有磷酸修飾，而 threonine 則無磷酸修飾。(C) GTGQsSDDsSDIWDDTALIK 此胜肽序列的各 個碎片離子訊號。
70
圖 23、各種裂解模式圖譜示意圖
74以 IQAAApSPPANATAASDTNAGDR 為 例 ， (A) 為 碰 撞 誘 導 裂 解 (collision-induced dissociation, CID)之 MS2圖譜；(B)為碰撞誘導裂解(CID) 之 MS3圖譜；(C)為碰撞誘導裂解(CID)之 MSA (multistage activation)圖譜；
(D)為高能量碰撞裂解(high-energy collision dissociation, HCD)之 MS2圖譜；
(E)為電子轉移裂解(electron transfer dissociation, ETD)之二價前驅離子 MS2 圖譜；(F)為電子轉移裂解(ETD)之三價前驅離子 MS2圖譜。
71
圖 24、Neutral loss MS
3(NL-MS
3)及 Multistage Activation (MSA)模式
以檢視質譜掃描(survey scan)偵測到磷酸胜肽，(A)選前驅離子進行 CID 碰撞，在 MS2 圖譜中有強訊號的中性丟失鋒 ([M+2H-H3PO4]2+)，(B)再選中性丟失產物離子進行 CID 碰撞，在 NL-MS3圖譜得磷酸胜肽序列訊號；或(C)直接選出前驅離 子並連續對前驅離子與中性丟失產物離子進行 CID 碰撞，即在同一張圖譜得到 MS2(虛線)與 NL-MS3(實線)所有碎片訊號。
72
圖 25、pY-immonium ion 形成
因高能量碰撞裂解(high-energy collision dissociation, HCD)碰撞特性使磷酸 化酪胺酸(pY)容易斷裂，而偵測到 216 Da 的 pY-immonium ion。
73
圖 26、以 Gel-Free 之定量方法分類
第一類是代謝物標記(metabolic labeling)；第二類是化學同位素標記(chemical stable isotope labeling)，其中化學同位素標記 又可細分兩種；第三類是無標記定量(label-free quantitation)。
74
圖 27、同重元素相對與絕對定量標定(iTRAQ)試劑結構
(A)此試劑分成三個基團，有數個同位素使質量不同的報導基團(reporter group)，分子量為 114-117；使標記總質量相同的平衡基團(balance group)，
分子量為 31-28；與胜肽上的自由胺基鍵結的 NHS-反應基團(reactive group)。
(B)試劑上標定不同同位素導致報導基團與平衡基團的分子量差異。
75
圖 28、同重元素相對與絕對定量標定(iTRAQ)流程圖
先將各個樣品各別標記上試劑，並將所有樣品混合均勻，最後再送入串聯式質譜儀進行分析。
76
圖 29、無標記定量方法(Label-Free Quantitation)
樣品經蛋白酶水解，送入串聯式質譜分析，以在 MS 圖譜中的譜峰強度、
面積或 MS/MS 圖譜張數(spectral counting)，進行不同樣品間某蛋白質的 相對含量。
77
圖 30、不同策略之實驗總流程圖
因樣品中在細胞裂解液含有抑制劑會影響後續實驗，將樣品分別經過離 心過濾法以及丙酮沉澱法進行蛋白質去鹽，各取毫克含量將蛋白質水解 成較小片段的胜肽以利質譜分析，經由 HAMMOC 純化磷酸化胜肽，並 以三種分離方法降低樣品複雜度，分別是 sIEF、SCX、HILIC，最後再 送入液相串聯式質譜偵測並進行數據分析，以此比較不同去鹽以及不同 分離策略對於磷酸化胜肽鑑定之影響。此外研究中也各取 200 微克的控 制組與刺激組樣品分別經由 HAMMOC 純化與液相串聯式質譜分析後，
以無標記定量方法(label-free)進行控制組與刺激組之相對定量分析。
78
圖 31、脂多醣(Lipopolysaccharide, LPS)結構
包含 O-antigenic polysaccharide、core oligosaccharide 及 lipid A 三部分。
79
圖 32、Toll-like receptor (TLR)4 signaling pathway
87LPS 會先與 LBP (
LPS-binding protein
)結合，再透過 CD14/TLR4/MD2 接受器(receptor)辨識，產生一系列的訊息傳遞，其可從細胞膜依序傳送 至細胞質與細胞核，促使細胞產生細胞激素(cytokines)，更可進一步誘導 發炎反應。圖 33、小鼠巨噬細胞株(RAW264.7)培養流程圖
由 ITRI 提供。80
圖 34、牛血清白蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖
配置 BSA 各濃度之標準液，藉由可見光譜盤式分析儀偵測其 O.D. 595 nm 吸收值，再將所得數據以 Microsoft Excel 軟體繪製出吸收值對濃度之 校正曲線。此曲線應用於小鼠巨噬細胞(RAW264.7)裂解液蛋白質濃度測 定。
圖 35、牛血清白蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖
配置 BSA 各濃度之標準液，藉由可見光譜盤式分析儀偵測其 O.D. 595 nm 吸收值，再將所得數據以 Microsoft Excel 軟體繪製出吸收值對濃度之 校正曲線。此曲線應用於兩種不同去鹽後小鼠巨噬細胞(RAW264.7)蛋白
81
(A)
(B)
圖 36、等電點聚焦分級儀(OFFGEL)運作參數記錄圖
樣品經(A) centrifugal filter (B) acetone precipitation 去鹽，各別以 1.2 mg 起始量水解、HAMMOC 純化及等電點聚焦分級儀分離，圖為分離時參 數變動記錄。當 kVHours 達到 50 kVh，即表示分離完成，各約 27 小時。
82
(A) (B)
圖 37、離心過濾法於 sIEF 分離 12 分管各別鑑定得到獨特的磷酸化胜肽數目之分布圖
(A)LTQ 與(B) Orbitrap 質譜分析之結果分布圖。1P 表示單磷酸化胜肽，2P 表示雙磷酸化胜肽，Multiply 表示多磷酸化胜肽。
0
# of u n iq u e p h osp h op ep tid es
Fraction No.
LTQ-sIEF-Centrifugal Filter
1P 2P Multiply
# of un iq ue ph osph opept id es
Fraction No.
Orbitrap-sIEF-Centrifugal Filter
1P 2P Multiply
83
(A) (B)
圖 38、丙酮沉澱法於 sIEF 分離 12 分管各別鑑定得到獨特的磷酸化胜肽數目之分布圖
(A)LTQ 與(B)Orbitrap 質譜分析之結果分布圖。1P 表示單磷酸化胜肽，2P 表示雙磷酸化胜肽，Multiply 表示多磷酸化胜肽。
0
# of u n iq u e p h osp h op ep tid es
Fraction No.
# of u n iq u e p h osp h op ep tid es
Fraction No.
Orbitrap-sIEF-Acetone Precipitation
1P 2P Multiply
84
(A)
(B)
圖 39、不同去鹽策略之鑑定總結果
各個實驗皆搭配 HAMMOC 純化以及等電點聚焦電泳分離樣品。圖中(A)獨特的磷酸化蛋白質與(B)獨特的磷酸化胜肽之總數 目分布圖。1P 表示單磷酸化胜肽，2P 表示雙磷酸化胜肽，Multiply 表示多磷酸化胜肽。
939 884 190
150
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Acetone Precipitation
Centrifugal Filter
# of unique phosphoproteins
LTQ XL LTQ Orbitrap XL
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 Orbitrap-Acetone Precipitation
LTQ-Acetone Precipitation Orbitrap-Centrifugal Filter LTQ-Centrifugal Filter
# of unique phosphopeptides
1P 2P Multiply
85
圖 40、不同去鹽策略於質譜儀鑑定獨特的磷酸化蛋白質/胜肽之 Venn diagram
(A、B)為 LTQ 質譜分析之統計結果，(C、D)為 Orbitrap 質譜分析之統計結果。86
圖 41、強陽離子交換(SCX)層析圖
以 1.2 mg 起始樣品水解經 HAMMOC 純化，再以 SCX 分離。左縱軸為波長 214 nm 之 UV 吸收(細線條)，右縱軸是%B (粗線 條)，橫軸為層析滯留時間。分離後匯集成 12 管，1-15 分鐘每五分鐘一管，16-39 分鐘每三分鐘一管，40-80 分鐘收成一管。
87
(A) (B)
圖 42、以 SCX 分離於 12 分管各別鑑定得到獨特的磷酸化胜肽數目之分布圖
(A)LTQ 與(B) Orbitrap 質譜分析之結果分布圖。1P 表示單磷酸化胜肽，2P 表示雙磷酸化胜肽，Multiply 表示多磷酸化胜肽。
0
# of u n iq u e p h osp h op ep tid es
Fraction No.
LTQ-SCX-Centrifugal Filter
1P 2P Multiply
# of un iq ue ph osph opept id es
Fraction No.
Orbitrap-SCX-Centrifugal Filter
1P 2P Multiply
88
圖 43、親水性作用(HILIC)層析圖
以 1.2 mg 起始樣品水解經 HAMMOC 純化，再以 HILIC 分離。左縱軸為波長 214 nm 之 UV 吸收(細線條)，右縱軸是%B (粗 線條)，橫軸為層析滯留時間。分離後匯集成 12 管，1-16 分鐘每八分鐘一管，17-43 分鐘每三分鐘一管，44-80 分鐘收成一管。
89
# of u n iq u e p h osp h op ep tid es
Fraction No.
LTQ-HILIC-Centrifugal Filter
1P 2P
# of u n iq u e p h osp h op ep tid es
Fraction No.
Orbitrap-HILIC-Centrifugal Filter
1P 2P Multiply
90
(A)
(B)
圖 45、三種不同分離策略之鑑定總結果
各個分離方法皆使用離心過濾法(centrifugal filter)去鹽以及 HAMMOC 純化。圖中(A)獨特的磷酸化蛋白質與(B)獨特的磷酸化 胜肽之總數目分布圖。1P 表示單磷酸化胜肽，2P 表示雙磷酸化胜肽，Multiply 表示多磷酸化胜肽。
884
# of unique phosphoproteins
LTQ XL
LTQ Orbitrap XL
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Orbitrap-sIEF
# of unique phosphopeptides
1P 2P Multiply
91
圖 46、各分離策略於不同質譜儀鑑定獨特的磷酸化蛋白質/胜肽之 Venn diagram
(A、B)為 LTQ 質譜分析之統計結果，(C、D)為 Orbitrap 質譜分析之統計結果。92
圖 47、Laber-Free 策略於不同質譜參數設定之鑑定獨特的磷酸化蛋白質/胜肽
Ctrl 表示控制組，LPS 表示脂多醣刺激組。a 表示將重複鑑定次數(repeat counts)設為 1 次，而排除滯留時間(exclusion duration) 設為 60 秒；b 表示重複鑑定次數(repeat counts)設為 10 次，而排除滯留時間(exclusion duration)設為 30 秒。1 與 2 表示分析第 一次與第二次。
0 200 400 600 800 1000 1200
Ctrl(a1) Ctrl(a2) Ctrl(b1) Ctrl(b2) LPS(a1) LPS(a2) LPS(b1) LPS(b2)
Unique phosphopeptides Unique phosphoproteins
93
Ctrl LPS Ctrl LPS
exclusion duration: 60 s exclusion duration: 30 s repeat counts: 1 repeat counts: 10
# o f u nique
Phosphopeptides
Phosphoproteins
94
圖 49、Label-Free 策略於不同質譜參數設定下共鑑定磷酸化蛋白質/胜肽之 Venn diagram
(A、B)為在控制組中獨特的磷酸化蛋白質與獨特的磷酸化胜肽之統計結果，(C、D)為在脂多醣刺激組中獨特的磷酸化蛋白 質與獨特的磷酸化胜肽之統計結果。a 表示將重複鑑定次數(repeat counts)設為 1 次，而排除滯留時間(exclusion duration)設 為 60 秒；b 表示重複鑑定次數(repeat counts)設為 10 次，而排除滯留時間(exclusion duration)設為 30 秒。
95
exclusion duration: 60 s exclusion duration: 30 s repeat counts: 1 repeat counts: 10
# o f unique pho spho prpte ins Up-regulated phosphoproteins
(spectral counts≧2)
Up-regulated phosphoproteins (spectral counts≧2, # of phosphopeptides≧3)
Down-regulated phosphoproteins (spectral counts≦0.5)
Down-regulated phosphoproteins (spectral counts≦0.5, # of
phosphopeptides≧3)
96
圖 51、Immune Response_CD28 Signaling 路徑圖
紅色圈表示本實驗找到具有差異的蛋白質，在右邊的 bar 即為 LPS 刺激組 鑑定到蛋白質的胜肽圖譜數為控制組鑑定到蛋白質的胜肽圖譜數 2 倍以上 的蛋白質。
97
附表
Time (min) % SCX mobile phase B Flow (mL/min)
1 0 2 0.2
2 15 2 0.2
3 55 40 0.2
4 60 98 0.2
5 65 98 0.2
6 70 2 0.2
7 80 2 0.2
表 1、強陽離子交換層析梯度表(SCX Gradient)
流速設定 0.2 mL/min，樣品以 200 μL SCX mobile phase A 回溶，梯度在 40 分鐘內從 2% SCX mobile phase B 拉至 40% SCX mobile phase B。
98
Time (min) % HILIC mobile phase B Flow (mL/min)
1 0 98 0.2
2 5 98 0.2
3 50 50 0.2
4 55 10 0.2
5 65 10 0.2
6 70 98 0.2
7 80 98 0.2
表 2、親水性作用層析梯度表(HILIC Gradient)
流速設定 0.2 mL/min，樣品以 200 μL HILIC mobile phase B 回溶，梯度在 45 分鐘內從 98% SCX mobile phase B 拉至 50% SCX mobile phase B。
99
Time (min) % mobile phase B Flow (μL/min)
1 0 2 0.4
2 95 40 0.4
3 96 80 0.4
4 105 80 0.4
5 110 2 0.4
6 125 2 0.4
表 3、液相層析 Waters UPLC 梯度表
樣品經自動進樣器進樣後，將流速設為3 μL/min 推入 trapping column，使 得樣品被捕捉於 pre-column 且以 mobile phase A 進行去鹽五分鐘，再利用 分流系統使流速降為 0.4 μl/min，使得樣品送入分析管柱中(analytical column)，以 96 分鐘內將梯度從 2%拉至 80% mobile phase B 進行胜肽分 離。
100
Time (min) % mobile phase B Flow (μL/min)
1 0 5 0.5
2 5 5 0.5
3 10 10 0.5
4 70 40 0.5
5 75 99 0.5
6 85 99 0.5
7 85.1 5 0.5
8 105 5 0.5
表 4、液相層析 Dionex UltiMate 3000 RSLC 梯度表
樣 品 經 自 動 進 樣 器 進 樣 後 ， 將 流 速 設 為 0.5μL/min 推 入 分 析 管 柱 中 (analytical column)，以 75 分鐘內將梯度從 5%拉至 99% mobile phase B 進 行胜肽分離。
101
(A)
Conc. (μg/mL) 60 50 40 30 20 10 0 O.D 595 nm 1.394 1.218 1.114 0.909 0.722 0.57 0.399
(B)
RAW 264.7 Control LPS-treated O.D. 595nm 0.926 1.045 Conc. (μg/μL) 31.34 19.22
Amounts (mg) 9.4 5.7
表 5、牛血清白蛋白(BSA)標準液和 RAW 264.7 之蛋白質吸收值與濃 度表
(A) 為 BSA 標準液之濃度與吸收值，利用此數據繪製出吸收值與濃度之校 正曲線。
(B) 為小鼠巨噬細胞株(RAW 264.7)之吸收值，帶入 BSA 校正曲線即可推 得原始濃度以及含量。
102
(A)
Conc. (μg/μL) 60 50 40 30 20 10 0 O.D. 595nm 1.33 1.217 1.065 0.8771 0.7151 0.561 0.373
(B)
Desalting Centrifugal filter Acetone precipitation RAW 264.7 Control LPS-treated Control LPS-treated O.D. 595nm 0.881 0.801 1.025 0.889 Conc. (μg/μL) 27.61 23.51 1.23 0.95
Amounts (mg) 1.3 1.1 0.7 0.6
Recovery 80.9% 80.7% 21.2% 28.0%
表 6、牛血清白蛋白(BSA)標準液和 RAW 264.7 去鹽後蛋白質吸收值 與濃度表
(A) 為 BSA 標準液之濃度與吸收值，利用此數據繪製出吸收值與濃度之校 正曲線。
(B) 為蛋白質去鹽後小鼠巨噬細胞株(RAW 264.7)之吸收值，帶入 BSA 校 正曲線即可推得原始濃度、含量以及計算回收率。
103
RAW264.7 (Control & LPS-treated)
Sample amounts (μg) 1200 1200
# of fractions all 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
# of queries 55723 4351 4643 3986 4140 3749 3785 3883 6107 3962 3144 7264 6709
Ions score cut-off 46 46 46 46 46 46 46 46 46 46 46 46 46
# of proteins 174 111 43 25 13 3 6 5 15 5 2 11 3
# of unique peptides 265 141 58 25 14 3 5 5 19 5 2 11 3
# of non-phosphopeptides 58 15 20 2 2 2 3 0 5 1 1 10 3
# of unique phosphopeptides 208 126 38 23 12 1 3 5 14 4 1 1 0
# of phosphopeptide sites 234 139 45 24 12 1 4 6 15 6 2 1 0
Specificity (%) 78.5 89.4 65.5 92.0 85.7 33.3 60.0 0.0 73.7 80.0 50.0 9.1 0.0
表 7、以離心過濾法搭配 sIEF 分離方法於 LTQ XL 分析 12 分管鑑定結果列表
104
RAW264.7 (Control & LPS-treated)
Sample amounts (μg) 1200 1200
# of fractions all 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
# of queries 147160 13546 14030 13960 14315 14016 14030 13531 9992 13016 12443 11891 9543
Ions score cut-off 28 30 29 28 29 28 28 28 28 28 27 27 27
# of proteins 1072 476 358 192 195 152 174 137 11 133 78 45 15
# of unique peptides 2368 750 564 251 258 217 227 188 11 181 101 60 15
# of non-phosphopeptides 557 102 172 33 46 126 75 23 2 8 25 53 10
# of unique phosphopeptides 1811 648 392 218 212 94 152 165 9 173 76 7 5
# of phosphopeptide sites 2331 784 489 285 267 135 206 228 13 265 110 11 16 Specificity (%) 76.5 86.4 69.5 86.9 82.2 43.3 67.0 87.8 81.8 95.6 75.2 11.7 33.3
表 8、以離心過濾法搭配 sIEF 分離方法於 LTQ Orbitrap XL 分析 12 分管鑑定結果列表
105
RAW264.7 (Control & LPS-treated)
Sample amounts (μg) 1200 1200
# of fractions all 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
# of queries 36340 4804 3946 3939 3548 2170 3707 2639 1587 2207 2323 2840 2630
Ions score cut-off 46 46 46 46 47 47 47 47 47 47 46 46 46
# of proteins 209 119 56 42 12 1 11 12 3 0 1 2 3
# of unique peptides 333 174 76 46 14 1 12 13 3 0 1 2 3
# of non-phosphopeptides 49 13 21 3 1 1 4 0 2 0 0 2 3
# of unique phosphopeptides 285 161 55 43 13 0 8 13 1 0 1 0 0
# of phosphopeptide sites 322 186 62 48 14 0 9 15 1 0 1 0 0
Specificity (%) 85.6 92.5 72.4 93.5 92.9 0 66.7 100 33.3 0 100 0 0
表 9、以丙酮沉澱法搭配 sIEF 分離方法於 LTQ XL 分析 12 分管鑑定結果列表
106
RAW264.7 (Control & LPS-treated)
Sample amounts (μg) 1200 1200
# of fractions all 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
# of queries 105642 11323 11655 9641 11297 8341 8748 8610 9522 8415 7495 5391 5204
Ions score cut-off 28 30 30 29 29 29 28 28 28 27 27 25 25
# of proteins 1178 482 379 139 238 133 202 137 149 80 32 81 58
# of unique peptides 2769 776 585 171 335 188 278 196 206 123 38 116 71
# of non-phosphopeptides 877 172 170 24 64 122 125 20 54 4 15 108 68
# of unique phosphopeptides 1892 604 415 147 271 66 153 176 152 119 23 8 3
# of phosphopeptide sites 2289 665 490 163 328 95 193 226 229 208 41 10 5
Specificity (%) 68.3 77.8 71.0 86.0 80.9 35.1 55.0 89.8 73.8 96.7 60.5 6.9 4.2
表 10、以丙酮沉澱法搭配 sIEF 分離方法於 LTQ Orbitrap XL 分析 12 分管鑑定結果列表
107 Accession
number Protein name Peptides/phosphorylation sites identified Modification
Peptide score
IPI00553798 Ahnak AHNAK nucleoprotein isoform 1
GGVTG[pS]PEASISGSK Phospho (ST) 85.11
GHYEVTG[pS]DDEAGK Phospho (ST) 76.16
SSEVVL[pS]GDDEDYQR Phospho (ST) 75.04
ASLGSLEGEVEAEAS[pS]PK Phospho (ST) 77.76 ASLG[pS]LEGEVEAEASSPK Phospho (ST) 64.13 LPSGSGPA[pS]PTTGSAVDIR Phospho (ST) 66.71
LR[pS]EDGVEGDLGETQSR Phospho (ST) 70.17
SSKA[pS]LG[pS]LEGEVEAEASSPK 2 Phospho (ST) 54.56 S[pS]KA[pS]LGSLEGEVEAEASSPK 2 Phospho (ST) 48.69 TVIRLPSG[pS]GPA[pS]PTTGSAVDIR 2 Phospho (ST) 55.64 SN[pS]FSDEREFSAPSTPTGTLEFAGGDAK Phospho (ST) 59.02
IPI00110850 Actb Actin, cytoplasmic 1 [pS]YELPDGQVITIGNER Phospho (ST) 61.61
IPI00115660 Tcof1 Treacle protein
KL[pS]GDLEAGAPK Phospho (ST) 50.39
AGAVTSSASLS[pS]PALAK Phospho (ST) 74.23
STSS[pS]PAPTQTLPNSITQR Phospho (ST) 46.04 SAEPLANTVLASE[pT]EEEGNAQALGPTAK Phospho (ST) 50.53
IPI00756424 Eif5b Eukaryotic translation initiation factor 5B
SVPTVD[pS]GNEDDDSSFK Phospho (ST) 80.86
TARPNSEAPLSG[pS]EDADDSNK Phospho (ST) 73.13 TARPNSEAPL[pS]GSEDADDSNK Phospho (ST) 57.55
108 IPI00330804 Hsp90aa1 Heat shock protein HSP 90-alpha
ESDDKPEIEDVG[pS]DEEEEEK Phospho (ST) 57.05 ESDDKPEIEDVG[pS]DEEEEEKK Phospho (ST) 46.89 IPI00118875 Eef1d Isoform 1 of Elongation factor 1-delta GATPAEDDEDKDIDLFG[pS]DEEEEDK Phospho (ST) 47.78
IPI00652799 Mybbp1a Uncharacterized protein
SPAPSNPTL[pS]PSTPAK Phospho (ST) 64.27
LSQVNGATPV[pS]PIEPESK Phospho (ST) 61.85
IPI00111169 Pla2g4a Cytosolic phospholipase A2
HIVSNDSSD[pS]DDEAQGPK Phospho (ST) 74.42 HIVSNDS[pS]DSDDEAQGPKGTENEEAEK Phospho (ST) 66.28 HIVSNDSSD[pS]DDEAQGPKGTENEEAEK Phospho (ST) 61.86
IPI00118438 Srrm1 serine/arginine repetitive matrix protein 1 isoform 2
IPI00118438 Srrm1 serine/arginine repetitive matrix protein 1 isoform 2