脂族羥基酸修飾的金屬氧化物層析法(HAMMOC)搭配液相層析串聯式質譜分析技術(LC-MS/MS)之磷酸化蛋白質體研究

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(1)國立臺灣師範大學化學系研究所碩士論文 Department of Chemistry, National Taiwan Normal University Master Thesis. 脂族羥基酸修飾的金屬氧化物層析法(HAMMOC)搭配液相層析串聯式質譜分析技術(LC-MS/MS)之磷酸化蛋白質體研究 Phosphoproteomic Analysis by HAMMOC Enrichment and Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry. 研究生：林佳穎. 撰. Graduate Student: Chia-Ying Lin 指導教授：陳頌方. 博士. Advisor: Sung-Fang Chen, Ph. D. 中華民國一百零三年七月 July, 2014.

(2) 謝誌光陰似箭，日月如梭，在師大這兩年是個充實又溫馨的歲月。在這段學習旅程裡，慶幸遇到許多貴人，因為有大家的陪伴、幫助與鼓勵，讓我能夠如期完成這本論文。首先非常感謝指導教授–陳頌方博士，學識淵博的老師總能循循善誘的教導使我成長，讓我對於各方面有更深更廣的見解，也讓我養成運動的習慣來面對更多的挑戰。老師就像燈塔一樣，會給予明確的方向指引我前往，讓我的論文從無到有，漸漸開花結果，這些都要感謝老師的教導與協助。在此也感謝百忙抽空參與口試的口試委員–周綠蘋教授與辜韋智教授，兩位老師在口試時都給予不同面向的意見，讓我知道論文中需要補強的部分，如此可讓研究更加的完善。特別感謝辜老師，因為在老師的指導下，讓我對於 HAMMOC 技術更加了解，使我的論文更加的豐富。另外也要感謝工研院的曾湘文博士，在曾博士多次提供樣品之下，讓我能有足夠的樣品進行實驗分析。衷心感謝 C404 成員的陪伴與協助。感謝芷威學姊，在專業知識上妳總是能提點我的不足，更在報告前幫我順稿，在生活上妳總是能提供廣大的美食網路讓我大飽口福。感謝沛倫學長，專業的軟體技術解決我研究上的困難，以及在實驗出遊時能帶著大家一同前往。感謝俞靜學姊提供研究的相關資料，讓我能夠更快上手。感謝珮琳學姊分享實驗的寶貴經驗，讓我注意許多細節。感謝立平學姊熱心幫助在外地生活的我，讓我感受到台北的熱情。感謝堯聰學長大方展現廚藝，讓我品嘗美食。感謝群皓學長幽默風趣，讓實驗室充滿歡笑氣氛。感謝同窗好友們–活潑可愛的羽薇、談笑風生的昀昇和思緒豐富有創意的祖儀，這兩年的生活裡，有你們並肩作戰讓我不孤單，不論在課業上還是生活中，從你們身上我獲益良多。感謝心思細密的境晏、認真負責的思樺與平易近人的瓊文，在閒暇之餘帶來歡樂以舒緩疲憊的身心。最終感謝家人與朋友們的支持與鼓勵。最親愛的爸媽，謝謝你們提供許多資源，讓我安心順利完成學業，你們辛苦了！親愛的妹妹，謝謝妳的安慰，給我堅持下去的力量。謝謝靜英阿姨，讓在台北的我有個溫暖的避風港。謝謝烝祺與慶祐，將失落的我拉我一把，開導我、鼓勵我、包容我，讓我提起信心繼續前進。僅以此論文獻給關心和愛護我的家人、師長與朋友們！.

(3) 目錄目錄 ...................................................................................................................... I 圖目錄 ............................................................................................................... IV 表目錄 ............................................................................................................... VI 英文縮寫檢索表 ............................................................................................. VII Abstract ............................................................................................................ IX 摘要 .................................................................................................................... X 第一章序論 ....................................................................................................... 1 一、蛋白質磷酸化 ......................................................................................... 1 二、偵測磷酸化蛋白質 ................................................................................. 2 2.1 放射性標記法........................................................................................................... 2 2.2 免疫染色標記法....................................................................................................... 2 2.3 質譜法....................................................................................................................... 3. 三、純化磷酸化蛋白質與磷酸化胜肽方法................................................. 4 3.1 化學衍生法(Chemical Derivatization Strategies) .................................................... 4 3.2 親和性層析法(Affinity Chromatography) ............................................................... 5. 四、液相層析分離技術 ................................................................................. 8 4.1 等電點聚焦電泳(Solution Isoelectric Focusing Electrophoresis, sIEF) .................. 8 4.2 離子交換層析法(Ion Exchange Chromatography, IEX).......................................... 9 4.3 親水性作用層析法(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC) .... 10 4.4 靜電排斥親水性作用層析法(Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography, ERLIC) ...............................................................................................11. 五、質譜儀技術 ........................................................................................... 12 5.1 質譜儀(Mass Spectrometry, MS)............................................................................ 12 5.2 蛋白質身分鑑定(Protein Identification) ................................................................ 14 5.3 質譜應用在磷酸化蛋白質序列鑑定 ..................................................................... 16 5.4 差異蛋白質體學(Differential Proteomics) ............................................................ 19 I.

(4) 六、研究動機 ............................................................................................... 21 第二章實驗材料............................................................................................. 22 一、樣品 ....................................................................................................... 22 二、藥品與試劑 ........................................................................................... 22 三、材料 ....................................................................................................... 23 四、儀器 ....................................................................................................... 23 第三章實驗方法............................................................................................. 24 一、樣品 ....................................................................................................... 24 二、蛋白質濃度測定 ................................................................................... 25 三、樣品前處理 ........................................................................................... 26 3.1 離心過濾法(Centrifugal Filter) .............................................................................. 26 3.2 丙酮沉澱法(Acetone Precipitation) ....................................................................... 26. 四、蛋白質水解(In Solution Digestion) ..................................................... 27 五、聚苯乙烯二乙烯基苯去鹽(Polystyrenedivinylbenzene Copolymer Stage Tip Desalting, SDB Desalting) ..................................................................... 27 六、脂族羥基酸修飾的金屬氧化物層析法(HAMMOC) ......................... 28 七、聚苯乙烯二乙烯基苯去鹽(SDB Desalting) ........................................ 29 八、第一維分離策略 ................................................................................... 30 8.1 等電點聚焦電泳(Solution Isoelectric Focusing Electrophoresis, sIEF) ................ 30 8.2 強陽離子交換層析法(Strong Cation Exchange Chromatography, SCX).............. 31 8.3 親水性作用層析法(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC) .... 32. 九、碳 18 離心管柱去鹽(C18 Spin Column Desalting)............................. 33 十、液相層析參數設定 ............................................................................... 34 10.1 ACUQITY Ultra Performance LC system ............................................................. 34 10.2 Dionex UltiMate 3000 Rapid Separation LC system ............................................. 34. 十一、串聯式質譜參數設定 ....................................................................... 35 11.1 LTQ XL .................................................................................................................. 35 11.2 LTQ Orbitrap XL ................................................................................................... 36 11.3 應用於無標記(Label-Free)之 LTQ Orbitrap XL ................................................. 37 II.

(5) 十二、蛋白質資料庫搜尋(Data Analysis).................................................. 38 第四章實驗結果與討論................................................................................. 39 一、蛋白質濃度測定 ................................................................................... 39 二、不同去鹽策略對於蛋白質濃度測定與磷酸化胜肽鑑定之影響 ...... 39 2.1 以離心過濾法與丙酮沉澱法去鹽後之各別蛋白質濃度測定 ............................. 40 2.2 以離心過濾法與丙酮沉澱法去鹽後之各別鑑定磷酸化胜肽 ............................. 40 2.3 去鹽策略之互補性(Complementarity)分析 .......................................................... 42. 三、不同分離策略對於磷酸化胜肽鑑定之影響 ...................................... 43 3.1 等電點聚焦電泳(Solution Isoelectric Focusing Electrophoresis, sIEF) ................ 43 3.2 強陽離子交換層析法(Strong Cation Exchange Chromatography, SCX).............. 44 3.3 親水性作用層析法(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC) .... 45 3.4 分離策略之互補性(Complementarity)分析 .......................................................... 46. 四、無標記(Label-free)方法分析脂多醣刺激小鼠巨噬細胞(RAW264.7)之差異磷酸化蛋白質體研究........................................................................... 46 4.1 磷酸化蛋白質身分鑑定 ......................................................................................... 47 4.2 磷酸化蛋白質定量分析 ......................................................................................... 48 4.3 生物資訊分析......................................................................................................... 48. 第五章結論與未來展望................................................................................. 49 附圖 ................................................................................................................... 50 附表 ................................................................................................................... 97 參考文獻 ............................................................................................................. a. III.

(6) 圖目錄圖 1、磷酸化與去磷酸化(Phosphorylation-Dephosphorylation)循環 ...................... 50 圖 2、O-phosphates 之磷酸化.................................................................................... 50 圖 3、常見分析磷酸化蛋白質方式........................................................................... 51 圖 4、純化磷酸化蛋白質與磷酸化胜肽示意圖....................................................... 52 圖 5、以 β-elimination 純化磷酸化胜肽 ................................................................... 53 圖 6、以 Phosphoramidate Chemistry (PAC)純化磷酸化胜肽 ................................. 54 圖 7、固定相金屬親和層析法(IMAC)示意圖 ......................................................... 55 圖 8、固定相金屬親和層析法(IMAC)之螯合基 ..................................................... 56 圖 9、含有羧基(-COOH)側鏈的胺基酸 ................................................................... 56 圖 10、去胺基化(Deamidation) ................................................................................. 57 圖 11、金屬氧化物親和層析法(MOAC)示意圖 ...................................................... 58 圖 12、在金屬氧化物親和層析法中常用之脂族羥基酸......................................... 59 圖 13、以脂族羥基酸修飾的金屬氧化物層析法(HAMMOC)純化磷酸化胜肽之作用機制.................................................................................................................. 60 圖 14、等電點聚焦(OFFGEL)流程圖 ....................................................................... 61 圖 15、離子交換層析法(IEX)鍵結示意圖 ............................................................... 62 圖 16、親水性作用層析法與靜電排斥親水性作用層析法鍵結示意圖................. 63 圖 17、電噴灑游離法(Electrospray Ionization, ESI)機制圖 .................................... 64 圖 18、LTQ XL 裝置圖 .............................................................................................. 65 圖 19、LTQ Orbitrap XL 裝置圖 ............................................................................... 66 圖 20、質譜中胜肽離子碎片形式............................................................................. 67 圖 21、質譜掃描模式................................................................................................. 68 圖 22、以 Mascot 搜尋結果之範例 ........................................................................... 69 圖 23、各種裂解模式圖譜示意圖 74 ......................................................................... 70 圖 24、Neutral loss MS3 (NL-MS3)及 Multistage Activation (MSA)模式 ................ 71 圖 25、pY-immonium ion 形成 .................................................................................. 72 圖 26、以 Gel-Free 之定量方法分類 ........................................................................ 73 圖 27、同重元素相對與絕對定量標定(iTRAQ)試劑結構 ...................................... 74 圖 28、同重元素相對與絕對定量標定(iTRAQ)流程圖 .......................................... 75 IV.

(7) 圖 29、無標記定量方法(Label-Free Quantitation) ................................................... 76 圖 30、不同策略之實驗總流程圖............................................................................. 77 圖 31、脂多醣(Lipopolysaccharide, LPS)結構 ......................................................... 78 圖 32、Toll-like receptor (TLR)4 signaling pathway87.............................................. 79 圖 33、小鼠巨噬細胞株(RAW264.7)培養流程圖 .................................................... 79 圖 34、牛血清白蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖 .............................................. 80 圖 35、牛血清白蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖 .............................................. 80 圖 36、等電點聚焦分級儀(OFFGEL)運作參數記錄圖 ........................................... 81 圖 37、離心過濾法於 sIEF 分離 12 分管各別鑑定得到獨特的磷酸化胜肽數目之分布圖.................................................................................................................. 82 圖 38、丙酮沉澱法於 sIEF 分離 12 分管各別鑑定得到獨特的磷酸化胜肽數目之分布圖.................................................................................................................. 83 圖 39、不同去鹽策略之鑑定總結果......................................................................... 84 圖 40、不同去鹽策略於質譜儀鑑定獨特的磷酸化蛋白質/胜肽之 Venn diagram 85 圖 41、強陽離子交換(SCX)層析圖 .......................................................................... 86 圖 42、以 SCX 分離於 12 分管各別鑑定得到獨特的磷酸化胜肽數目之分布圖 . 87 圖 43、親水性作用(HILIC)層析圖 ........................................................................... 88 圖 44、以 HILIC 分離於 12 分管各別鑑定得到獨特的磷酸化胜肽數目之分布圖 .............................................................................................................................. 89 圖 45、三種不同分離策略之鑑定總結果................................................................. 90 圖 46、各分離策略於不同質譜儀鑑定獨特的磷酸化蛋白質/胜肽之 Venn diagram .............................................................................................................................. 91 圖 47、Laber-Free 策略於不同質譜參數設定之鑑定獨特的磷酸化蛋白質/胜肽 . 92 圖 48、Label-Free 策略於不同質譜參數設定鑑定之二重複統計結果 .................. 93 圖 49、Label-Free 策略於不同質譜參數設定下共鑑定磷酸化蛋白質/胜肽之 Venn diagram ................................................................................................................ 94 圖 50、Label-Free 策略於不同質譜參數設定下之差異磷酸化蛋白質 .................. 95 圖 51、Immune Response_CD28 Signaling 路徑圖 .................................................. 96. V.

(8) 表目錄表 1、強陽離子交換層析梯度表(SCX Gradient) ..................................................... 97 表 2、親水性作用層析梯度表(HILIC Gradient) ...................................................... 98 表 3、液相層析 Waters UPLC 梯度表 ...................................................................... 99 表 4、液相層析 Dionex UltiMate 3000 RSLC 梯度表 ........................................... 100 表 5、牛血清白蛋白(BSA)標準液和 RAW 264.7 之蛋白質吸收值與濃度表 ..... 101 表 6、牛血清白蛋白(BSA)標準液和 RAW 264.7 去鹽後蛋白質吸收值與濃度表 ............................................................................................................................ 102 表 7、以離心過濾法搭配 sIEF 分離方法於 LTQ XL 分析 12 分管鑑定結果列表 ............................................................................................................................ 103 表 8、以離心過濾法搭配 sIEF 分離方法於 LTQ Orbitrap XL 分析 12 分管鑑定結果列表................................................................................................................ 104 表 9、以丙酮沉澱法搭配 sIEF 分離方法於 LTQ XL 分析 12 分管鑑定結果列表 ............................................................................................................................ 105 表 10、以丙酮沉澱法搭配 sIEF 分離方法於 LTQ Orbitrap XL 分析 12 分管鑑定結果列表................................................................................................................ 106 表 11、磷酸化蛋白質與磷酸化胜肽列表 ............................................................... 117 表 12、以 SCX 分離方法於 LTQ XL 分析之 12 分管鑑定結果列表 ................... 118 表 13、以 SCX 分離方法於 LTQ Orbitrap XL 分析 12 分管鑑定結果列表 ........ 119 表 14、以 HILIC 分離方法於 LTQ XL 分析 12 分管鑑定結果列表 .................... 120 表 15、以 HILIC 分離方法於 LTQ Orbitrap XL 分析 12 分管鑑定結果列表...... 121 表 16、以不同質譜參數設定於 LTQ Orbitrap XL 分析鑑定結果列表 ................ 122 表 17、變動分析質譜設定(repeat counts:10, exclusion duration: 30)之上調磷酸化蛋白質列表............................................................................................................ 124 表 18、變動分析質譜設定(repeat counts:10, exclusion duration: 30)之下調磷酸化蛋白質列表............................................................................................................ 126. VI.

(9) 英文縮寫檢索表 acetic acid. AA. acetonitrile. ACN. bovine serum albumin. BSA. chemical ionization. CI. collision-induced dissociation. CID. data dependent acquisition. DDA. D,L-dithiothreitol. DTT. electron capture dissociation. ECD. electron impact ionization. EI. electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography ERLIC electrospray ionization. ESI. electron transfer dissociation. ETD. formic acid. FA. hydrophilic interaction liquid chromatography. HILIC. aliphatic hydroxyl acid-modified metal oxide chromatography. HAMMOC. high-energy collision dissociation. HCD. high performance liquid chromatography. HPLC. iminodiacetic acid. IDA. immobilized metal affinity chromatography. IMAC. immunoprecipitation. IP. immobilized pH gradient. IPG. iodoacetamide. IAA. ion exchange chromatography. IEX. ion trap. IT. isobaric tags for relative and absolute quantitation. iTRAQ. linear ion trap. LIT. lipopolysaccharide. LPS VII.

(10) liquid chromatography. LC. lysyl endopeptidase. Lys-C. milli-Q systems dispense the water. milli-Q H2O. metal oxide affinity chromatography. MOAC. mass spectrometry. MS. multistage activation. MSA. tandem mass spectrometry. MS/MS. N-hydroxy-succinimide. NHS. neutral loss MS3. NL-MS3. nitrilotriacetic acid. NTA. phosphoramidate chemistry. PAC. peptide fragment fingerprinting. PFF. peptide mass fingerprinting. PMF. phosphoserine. pS. phosphothreonine. pT. post translational modification. PTM. phosphotyrosine. pY. quadrupole. Q. reverse phase. RP. strong anion exchange chromatography. SAX. strong cation exchange chromatography. SCX. polystyrenedivinylbenzene. SDB. solution isoelectric focusing electrophoresis. sIEF. sequential elution from IMAC. SIMAC. solid phase extraction. SPE. triethylammonium bicarbonate. TEAB. trifluoroacetic acid. TFA. VIII.

(11) Abstract Protein phosphorylation is one of major post-translational modifications, which regulates many biological intracellular systems, including gene expression, signal transduction pathways and metabolic processes. Phosphorylation, a transient modification and low abundance, requires highly sensitive and specific strategies for its analysis. The combination of aliphatic hydroxyl acid-modified metal oxide chromatography (HAMMOC) enrichment and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis were employed for the phosphoproteome analysis in this study. Two desalting methods, including acetone precipitation and centrifugal filter, were used separately before HAMMOC treatment. Moreover, three fractionation strategies, solution isoelectric focusing electrophoresis (sIEF), strong cation exchange. chromatography. (SCX). and. hydrophilic. interaction. liquid. chromatography (HILIC), were utilized to reduce the sample complexity after HAMMOC enrichment. Finally, label-free strategy was implemented for the phosphoproteomic quantification. A total of 2953 phosphopeptides and 1231 phosphoproteins were found in milligram proteins of RAW264.7 cell lysate by combining two desalting methods coupled with HAMMOC-sIEF approach. The use of centrifugal filter and HAMMOC coupled with three various fractionation strategies had shown good complementarity (86.8% more phosphopeptide identifications than SCX only). One hundred and fourteen phosphoproteins were found differentially expressed between control and lipopolysaccharide-treated RAW264.7 from 200 microgram proteins by using label-free comparative approach after HAMMOC and LC-MS/MS. These results indicate that HAMMOC followed by LC-MS/MS analysis is suited for the in-depth analysis of qualitative and quantitative phosphoproteome profiling. Keywords: phosphopeptides、HAMMOC、LC-MS/MS、sIEF、SCX、HILIC、 label-free. IX.

(12) 摘要蛋白質磷酸化是一種主要的後轉譯修飾，它調節許多生物系統，如基因表現、訊號傳遞與代謝路徑。但磷酸化修飾為可逆反應且含量低，故需要高靈敏度與具特異性的分析方法。本研究結合脂族羥基酸修飾的金屬氧化物層析法(HAMMOC)與液相層析串聯式質譜分析技術(LC-MS/MS)研究磷酸化蛋白質體學。首先選用丙酮沉澱法與離心過濾法，以比較不同去鹽方法之磷酸化研究；接著於 HAMMOC 純化後，以等電點聚焦電泳(sIEF)、強陽離子交換層析法(SCX)與親水性層析法(HILIC)降低樣品複雜度，並比較不同分離方法之磷酸化研究；最後，採用無標記定量方法(label-free)進行磷酸化蛋白質體定量。取小鼠巨噬細胞株(RAW 264.7)裂解液，經離心過濾法以及丙酮沉澱法去鹽，毫克含量的蛋白質水解後搭配 HAMMOC-sIEF 與質譜分析，在兩種方法共鑑定到 1231 個磷酸化蛋白質與 2953 段磷酸化胜肽。以離心過濾法搭配 HAMMOC 與三種分離方法，結果顯示單一 HAMMOC-SCX 可以鑑定到 1747 段磷酸化胜肽，再搭配 HAMMOC-sIEF 和 HAMMOC-HILIC 可額外鑑定 1517 段(86.8%)磷酸化胜肽，由此可知三種分離方法具良好的互補性。從小鼠巨噬細胞株之控制組與脂多醣刺激組取 200 微克的蛋白質，以 HAMMOC 與 LC-MS/MS 利用無標記定量方法進行相對定量分析，從中挑選出 114 個差異表現的磷酸化蛋白質。以上結果顯示選用 HAMMOC 搭配 LC-MS/MS 適合深入研究磷酸化蛋白質體學的定性和定量分析。關鍵字: 磷酸化胜肽、脂族羥基酸修飾的金屬氧化物層析法、液相層析串聯式質譜儀、等電點聚焦電泳、強陽離子交換層析法、親水性作用層析法、無標記定量方法. X.

(13) 第一章序論一、蛋白質磷酸化生物體中去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)與蛋白質(protein) 是非常重要的巨分子，DNA 序列經轉錄成為信使核醣核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)，mRNA 再轉譯成蛋白質；然而在生物體中，許多蛋白質須進行化學修飾後才具有活性，此即為後轉譯修飾(post translational modification, PTM)。後轉譯修飾是蛋白質經生化合成的，常見有官能團類的磷酸化(phosphorylation)、醣基化(glycosylation)1-3、烷基化(alkylation)4,5、乙醯化(acylation)6 等。近年來，後轉譯修飾的研究在蛋白質體學(proteomic)領域裡佔有一席之地，現今以質譜分析技術研究後轉譯修飾為主力工具。蛋白質磷酸化為後轉譯修飾重要的研究範疇之一，蛋白質磷酸化與細胞間訊號傳遞有密不可分的關聯 7，亦將磷酸化蛋白質視為細胞與外界訊號的啟動開關，讓細胞活性及各種反應機制產生不同程度的影響，藉由分析技術鑑定在不同狀態下的磷酸化修飾，以獲得細胞間訊息傳遞的資訊，進而應用於疾病檢測及治療，如癌症 8、神經性疾病 9、糖尿病等，因此探討磷酸化蛋白質或磷酸化胜肽和磷酸化位點是期望能進一步了解疾病，並且找尋相關治療與預防的方法 10。蛋白質磷酸化在生物體中是可逆的化學修飾，藉由磷酸化與去磷酸化的循環(phosphorylation-dephosphorylation cycle)，如圖 1 所示，促使蛋白質活性改變以致影響生理功能表現，因此在細胞生長、代謝、增殖、癌變等與細胞間訊號傳遞方面都扮演著重要的角色 7。所謂蛋白質磷酸化是由蛋白激酶(kinase)催化與 ATP 或 GTP 提供磷酸，使蛋白質中特定的胺基酸磷酸化；而去磷酸化即是由磷酸激酶(phosphatase)從胺基酸上移除磷酸，使蛋白質中特定的胺基酸成為非磷酸化狀態。蛋白質磷酸化可以依據修飾在不同的胺基酸位置分為四類：O-phosphates、N-phosphates、S-phosphates 以及 acyl-phosphates；O-phosphates 是修飾在絲胺酸(serine, Ser)、蘇胺酸 (threonine, Thr)或酪胺酸(tyrosine, Tyr)位置，如圖 2 所示；而 N-phosphates 1.

(14) 是修飾在精胺酸(arginine, Arg)、組胺酸(histidine, His)或賴胺酸(lysine, Lys) 上；S-phosphates 修飾在半胱胺酸(cysteine, Cys)位點；acyl-phosphates 是修飾在天門冬酸(aspartic acid, Asp)或谷胺酸(glutamic acid, Glu)。真核生物體中的蛋白質磷酸化以 O-phosphates 佔極大部分，而其它形式大多在原核生物中發現；有研究指出在真核生物中. 11. ，O-phosphates 的絲胺酸:蘇胺酸:. 酪胺酸之間比例約為 1800：200：1。. 二、偵測磷酸化蛋白質從古至今偵測磷酸化蛋白質的方法有三種 12，分別是放射性標記法、免疫染色標記法以及質譜法，這些方法依以下小節說明。. 2.1 放射性標記法放射性標記法是以同位素標定的方式鑑定磷酸化蛋白質. 13,14. ，加入大. 量磷同位素 32P 或 33P 的策略進行體內代謝培養，使放射性 32P 或 33P 標記於特定的磷酸根上，並透過代謝進入細胞中，如此一來細胞內蛋白質的磷酸修飾具有放射性 32P 或 33P 標記。此法也可以搭配電泳或 Edman 降解定序方法(Edman sequencing)，推測磷酸化修飾與位點。1991 年，Arrigo 等人採用放射性標記法和二維凝膠電泳分離法，已耐熱處理的細胞經由熱與腫瘤壞死因子刺激，研究有無磷酸化蛋白質變化。放射性標記法靈敏度高，且可以搭配二維凝膠電泳觀察細胞內蛋白質磷酸化的變化，但此方法受限於放射性汙染以及毒性問題、無法標記於組織樣品以及無法標定所有的特定磷酸位點，因而增加分析上的困難。. 2.2 免疫染色標記法免疫染色標記法即是將磷酸化蛋白質加以染色利於偵測，此方法常與膠體電泳結合使用，免疫染色標記法可分為兩種，一是藉由額外的抗體染色. 15. ，另一種則是直接在磷酸化位點上染色. 16,17. 。前者是先使用膠體電泳. 將蛋白質分離後，再套用免疫沉澱法中能與磷酸位點結合的特異性抗原， 2.

(15) 最後標記上具有螢光染色的二次抗體，即可偵測；後者是先使用膠體電泳將蛋白質分離後，再加入能直接在磷酸化位點上染色的染劑，如: ProQdiamond，亦可用來鑑定磷酸化蛋白質。此類方法靈敏度高，但是膠體電泳再現性不佳，故分析上有限制。. 2.3 質譜法近幾年質譜儀技術日新月異，軟性游離源迅速發展，不僅在分析蛋白質的技術蒸蒸日上，對研究磷酸化蛋白質也有更進一步的擴展。利用質譜鑑定蛋白質和胜肽的方法也可套用在磷酸化蛋白質和磷酸化胜肽上 18，質譜法可分為兩種，一是自上而下分析方法(top-down method)19-21，另一種則是較為常用的自下而上分析方法(bottom-up method)。. 2.3.1 自上而下分析方法(Top-Down Method) 自上而下分析方法是直接將完整的蛋白質送入高準確度、高靈敏度且高解析度的質譜儀分析，如: Orbitrap、FT-ICR，此分析方法不須繁複的前處理，也能鑑定後轉譯修飾及蛋白質複合物，且省時又有較佳蛋白質序列涵蓋率(sequence coverage)，但經質譜分析撞碎後其離子碎片過大且圖譜複雜，因此樣品的複雜度會限制鑑定結果。. 2.3.2 自下而上分析方法(Bottom-Up Method) 自下而上分析方法是目前普遍分析蛋白質的方法，可套用在磷酸化蛋白質上，圖 3 為常見分析磷酸化蛋白質方式，首先從細胞或組織中萃取出蛋白質，選擇合適的水解酵素將蛋白質水解成胜肽，接著藉由純化磷酸化胜肽技術分離磷酸化胜肽與非磷酸化胜肽，最後將磷酸化胜肽送入質譜儀分析，鑑定磷酸化位點，更可進一步進行生物資訊分析。此方法不僅適用高複雜度樣品，其靈敏度也比自上而下分析方法高，亦能在質譜前端搭配多維分離方法降低樣品複雜度；但此法有資訊流失的可能，例如無法鑑定完整的蛋白質序列而造成涵蓋率(coverage)低，或是含量過多的胜肽訊號遮蔽含量較少的胜肽訊號，因此無法有效鑑定低含量的後轉譯修飾資訊。 3.

(16) 現今採用質譜儀分析技術偵測磷酸化修飾與位點會遇到許多難題：第一，磷酸化的表現量在生物體內相當稀少，隨時間或環境的不同使可逆的磷酸化有不同表現，如此一來大幅增加鑑定的困難度；第二，質譜儀廣泛使用正電模式分析，但磷酸根帶負電，使得磷酸化胜肽總價數降低，造成磷酸化胜肽不僅難以游離，高含量的非磷酸化胜肽會抑制磷酸化胜肽的訊號，使得偵測限制提升；第三，常選用的碰撞模式為碰撞誘導裂解 (collision-induced dissociation, CID)，在此模式中磷酸根不穩定，極容易脫去中性分子(H3PO4, 98 Da)，成為高強度的中性丟失譜峰([M+nH-H3PO4]n+)，因此常常無法推測確切的磷酸化位點以及磷酸化胜肽序列。為了克服上述問題鑑定磷酸化胜肽序列及磷酸化位點，可藉由純化方法減少非磷酸化胜肽干擾，也可利用多種碰撞模式了解磷酸化位點及磷酸化胜肽序列資訊。. 三、純化磷酸化蛋白質與磷酸化胜肽方法選用質譜儀分析技術偵測磷酸化胜肽和磷酸化位點時，常常因為磷酸化的表現量相當低，加上含量高的非磷酸化胜肽亦會抑制磷酸化胜肽游離，甚至遮蔽磷酸化胜肽訊號，所以在質譜分析前進行純化步驟，如此可提高鑑定磷酸化胜肽和位點的機會。現今成功開發純化方法分為兩群，即化學衍生法及親和性層析法，如圖 4 所示。. 3.1 化學衍生法(Chemical Derivatization Strategies) 化學衍生法是將磷酸修飾經過一系列特殊的化學修飾，形成特定衍生物，再選與此衍生物具專一性的親和性層析方法純化已衍生的磷酸化修飾；目前此法有 β-elimination11,22 和 phosphoramidate chemistry (PAC)23,24。. 3.1.1 β-elimination β-elimination 是藉由鹼性硫代二乙醇(2,2'-Thiodiethanol)溶液，使磷酸化絲胺酸(phosphoserine, pS)及磷酸化蘇胺酸(phosphothreonine, pT)脫去磷酸基團，分別成為 dehydroalanine 和 dehydroaminobutyric acid，再採用 Michael addition 方法將生物素(biotin tag)標記於脫去磷酸基團的胜肽上， 4.

(17) 藉由生物素與親和素(avidin)之親和力，透過含有親和素的層析管柱純化已脫去磷酸基團的磷酸化蛋白質或磷酸化胜肽，如圖 5 所示。然而 β-elimination 需要大量的起始樣品，並且不適用於磷酸化酪胺酸 (phosphotyrosine, pY)，若反應不完全，則增加鑑定磷酸化修飾困難度。. 3.1.2 Phosphoramidate Chemistry (PAC) 在 2001 年 Zhou 等人開發另外一種名為 phosphoramidate chemistry 的化學衍生法，藉由碳二亞胺濃縮反應使半胱胺酸(cysteine)修飾於磷酸基團，而半胱胺酸與碘乙酰胺樹脂鍵結，最後以酸液釋放已衍生的磷酸化胜肽，如圖 6 所示。PAC 方法可以純化 O-phosphates 類型的磷酸化胜肽，但此法需要大量起始樣品，還需繁複的化學反應和管柱層析純化，並且在衍生過程中尚有副反應或反應不完全的可能，因此造成檢測上困難。. 3.2 親和性層析法(Affinity Chromatography) 除了上述方法外，親和性層析法也可以用於純化磷酸蛋白質/胜肽，分別為免疫沉澱法(IP)、固定相金屬親和層析法(IMAC)、金屬氧化物親和層析法(MOAC)以及固定相金屬親和層析連續洗脫法(SIMAC)。. 3.2.1 免疫沉澱法(Immunoprecipitation, IP) 免疫沉澱法是利用抗原(antigen)與抗體(antibody)的專一性純化分析物，藉由辨別磷酸化胺基酸殘基的特異性抗體進行免疫共沉澱，以此純化磷酸化蛋白質/胜肽 25；此法可以結合管柱層析或西方墨點法(Western blotting) 15。現今市面上已有純化 O-phosphates 類型的抗體，但磷酸化絲胺酸(pS)和磷酸化蘇胺酸(pT)其抗原和抗體結合位點具有立體障礙，造成 pS 和 pT 與抗體結合力差，故 anti-pS 和 anti-pT 的免疫沉澱純化效果有限 26；而以磷酸化酪胺酸(pY)的抗體進行免疫共沉澱純化 pY 時，因 anti-pY 在選擇性、特異性及親和力都比另兩種抗體較好，故 pY 的抗體能廣泛使用法有良好的專一性，但抗體成本昂貴為其缺點。. 5. 27. 。雖然此.

(18) 3.2.2. 固定相金屬親和層析法 (Immobilized. Metal. Affinity. Chromatography, IMAC) 固定相金屬親和層析法是依正負電親和作用達到純化目的，負電的磷酸根會與正電的金屬離子結合，因金屬離子的空軌域吸引磷酸根的孤對電子產生鍵結，以此純化磷酸化胜肽，圖 7 為純化過程。IMAC 之金屬離子修飾於已有螯合基(chelating ligands)的固相載體上，常見金屬離子有 Fe3+、 Cu3+或 Ga2+等，固相載體可為樹酯(resin)、薄膜(membrane)或磁珠(magnetic beads)等，而有三螯合基 iminodiacetic acid (IDA)和四螯合基 nitrilotriacetic acid (NTA)兩種螯合基(圖 8)。IMAC 技術一開始是純化含組胺酸(histidine) 及半胱胺酸(cysteine)的蛋白質 28-30，1986 年 Andersson 和 Porath 運用 IMAC 純化磷酸化蛋白質 31，1997 年 Neville 等人使用 IMAC 純化磷酸化胜肽 32，於日後 IMAC 被廣泛應用在純化磷酸化蛋白質/胜肽研究上。 IMAC 的困難在於純化後仍含有酸性胺基酸的胜肽(圖 9)，因為麩胺酸 (glutamic acid, Glu, E)和天門冬胺酸(aspartic acid, Asp, D)兩種胺基酸中皆有羧基(-COOH)的側鏈，而羧基在 IMAC 環境下容易解離成負離子(-COO-)，使得負電的羧基離子與正電的金屬離子因庫倫靜電力產生非特異性鍵結，進而降低純化效率。在 2002 年 Ficarro 等人以 O-methyl esterification 反應改善純化效率，將酸性胜肽的羧基轉換成甲基酯，使之無法與正電金屬離子鍵結，進而提高純化效果 33,34. 。但是實驗中冷凍乾燥步驟會流失磷酸化胜肽，此外，O-methyl esterification. 反應的轉換效率並非百分之百. 35. ，且會導致去胺基化(deamidation)36，如圖 10. 所示，以上因素皆會影響純化的效果。另外有研究調整 pH 值以提升純化效率 37，此方法是先將樣品調整在適合的酸性環境進行 IMAC 純化，如此可以降低羧基解離以維持電中性，而磷酸根的負電荷仍可與金屬離子結合，進而提高純化效率。. 3.2.3 金屬氧化物親和層析法 (Metal Oxide Affinity Chromatography, MOAC) 金屬氧化物親和層析法是以金屬氧化物或氫氧化物做為固定相，藉此純化磷酸化胜肽，圖 11 為純化過程，金屬氧化物如:TiO2、AlO3、SnO2、 6.

(19) ZrO238，其中二氧化鈦(titanium dioxide, TiO2)開發最完全且最常使用。TiO2 在酸性環境下表現為路易斯酸成為正電鈦離子，正電鈦離子可和負電磷酸根結合；然而 TiO2 在鹼性環境下會表現為路易斯鹼成為負電鈦離子，便與負電磷酸根互斥，因此改變環境的酸鹼值即可純化磷酸化胜肽。 MOAC 和固定相金屬親和層析法(IMAC)有相同缺陷 39，對於酸性的非磷酸化胜肽也有非特異性鍵結，雖可用 O-methyl esterification 或添加苯甲酸衍生物解決. 40. ，但芳香酸疏水性強，不易去除進而干擾質譜分析，因此這. 兩種改善方法仍有許多限制。本實驗所使用的磷酸化胜肽純化方法由 Sugiyama 等人發展脂族羥基酸修飾的金屬氧化物層析法(aliphatic hydroxyl acid-modified metal oxide chromatography, HAMMOC)41-44，此法即是將金屬氧化物親和層析法藉由脂族羥基酸加以改良，常見的脂族羥基酸(圖 12)如：2,5-DHB、benzoic acid、 salicylic acid、phthalic acid、乳酸(lactic acid)等；在樣品中磷酸化胜肽、酸性非磷酸化胜肽與 TiO2 鍵結能力不同，其中以磷酸化胜肽最強，脂族羥基酸次之，而酸性胺基酸的羧基最弱，藉由脂族羥基酸先與 TiO2 結合，酸性非磷酸化胺基酸即無法吸附在 TiO2 上，磷酸化胜肽仍可以取代脂族羥基酸進而與 TiO2 鍵結，最後可由鹼性溶液將磷酸化胜肽洗脫而出，本實驗是選用乳酸進行純化，作用如圖 13 所示，HAMMOC 可有效降低非特異性鍵結進而提高純化磷酸化胜肽效率。添加脂族羥基酸後，不僅可有效解決非特異性鍵結問題，更可提高專一性，脂族羥基酸也較容易以逆相層析去除，利於後續質譜分析。. 3.2.4 固定相金屬親和層析連續洗脫法(Sequential Elution from IMAC, SIMAC) 在鑑定磷酸化胜肽中，多磷酸化胜肽(multiple-phosphopeptides)含量比單一磷酸化胜肽(mono-phosphopeptides)少，加上多磷酸化胜肽在實驗過程中較容易流失，所以在鑑定上更加困難。固定相金屬親和層析連續洗脫法是結合 IMAC 和 MOAC-TiO2 的純化方法 45，單磷酸化胜肽是 IMAC 經由酸性溶液洗脫後並以 MOAC-TiO2 再次純化而得，而多磷酸化胜肽是 IMAC 經由鹼性溶液洗脫得到，SIMAC 將單磷酸化胜肽與多磷酸化胜肽區分，如 7.

(20) 此單磷酸化胜肽不會抑制多磷酸化胜肽訊號，不僅可以鑑定單磷酸化胜肽，也提高多磷酸化胜肽鑑定的機率。. 四、液相層析分離技術液相層析分離技術對於鑑定生化大分子而言是強而有力的工具，因為生物檢體極為複雜，以現階段的質譜技術無法直接鑑定到低含量的蛋白質，為了增加偵測低含量蛋白質的機率，可運用液相層析分離技術加以改善。近年來除了上述純化方法不斷改良以鑑定磷酸化修飾與位點，磷酸化胜肽也可套用液相層析分離技術達到更多的鑑定機會。目前常見用於磷酸化胜肽上的液相層析分離技術有等電點聚焦電泳(sIEF)、離子交換層析法(IEX)、親水性作用層析法(HILIC)及靜電排斥親水性作用層析法(ERLIC)。. 4.1 等電點聚焦電泳(Solution Isoelectric Focusing Electrophoresis, sIEF) 等電點聚焦電泳是依據各個蛋白質/胜肽的等電點(isoelectric point, pI) 分離，將兩性電解質載體置入電泳槽內，施加直流電使兩性電解質從正極到負極形成一個遞增的酸鹼值(pH)梯度，蛋白質/胜肽朝向與自身相反的電極移動，若在特定酸鹼值下，蛋白質/胜肽其淨電荷(net charge)為零，即到達它的等電點，因此不會受電場影響而停留，故依此分離。在 2006 年 Agilent Technologies 開發出等電點聚焦分析儀(OFFGEL)，生化樣本會在膠條間移動，當移動特定酸鹼值時，淨電荷為零，即等電點，此時樣本會從膠條中釋出並存在於該酸鹼值上層的緩衝溶液裡(圖 14)，最後只需取出緩衝溶液即可得到分離的樣本，此法便利且再現性高，應用範圍極廣 46,47。 Zhao 等人選用 sIEF 分離磷酸化胜肽. 48. ，雖無法直接分離出磷酸化胜. 肽與非磷酸化胜肽，但能分離出甲基化的磷酸化胜肽與甲基化的非磷酸化胜肽；若將所有胜肽甲基化即可達到分離的效果，是因甲基化的磷酸化胜肽等電點小於 7.4，而甲基化的非磷酸化胜肽其等電點大於 9.0，藉由此項差異即可用 sIEF 分離出磷酸化胜肽。. 8.

(21) 4.2 離子交換層析法(Ion Exchange Chromatography, IEX) 離子交換層析法是依親和力不同分離胜肽，不同電荷的胜肽與固定相有不同的吸附強度，藉著不同離子強度或酸鹼值的移動相依序將胜肽分離。最常用的離子交換樹脂材質是聚苯乙烯-苯二乙烯，由苯乙烯(styrene)和苯二乙烯(divinylbenzene)聚合而成的三維網狀結構。管柱中填充的樹酯可分為陽離子樹酯與陰離子樹酯(圖 15)，兩種樹酯根據反應基又可細分為強、中強與弱三種類型。對於陽離子樹酯，其強酸型樹脂含有－SO3H 基團，而中強酸型樹脂含有－PO3H2、－PO2H2 或－OPO2H2 基團；弱酸型樹脂含有－COOH 或－OH 基團。對於陰離子樹酯，其強鹼型樹脂含有銨鹽或四級銨鹽－N+(CH3)3 基團，而弱鹼型樹脂為三級以下銨鹽－N(CH3)2 、－ NHCH3 或－NH2 基團；同時具有強鹼和弱鹼型基團為中強鹼型的樹脂。. 強陽離子交換層析法(Strong Cation Exchange Chromatography,. 4.2.1 SCX). 強陽離子交換層析法是藉由強酸型樹酯上負電的基團分離胜肽，如圖 15 (A)所示。在特定酸鹼值下，胜肽中若含有較多帶負電的胺基酸，則會與負電的樹酯互相排斥，故吸附能力較弱，因此容易較早洗脫而出；若胜肽中含有較多帶正電的胺基酸，則會與負電的樹酯互相吸引，故吸附能力較強，不容易被取代而較晚洗脫出來。對於磷酸化胜肽，雖序列中含有帶正電的胺基酸，但負電的磷酸修飾會與 SCX 互斥，容易在分析前端鑑定到磷酸化胜肽；若含有的磷酸基團越多，則排斥力強，越早洗脫；如此可分離磷酸化胜肽與非磷酸化胜肽。 Dengjel 等人結合 SCX 與 TiO2 純化方法 49，發現 SCX-TiO2 可鑑定許多磷酸化胜肽與位點。Beausoleil 等人研究在酸性環境下 50，磷酸化胜肽與非磷酸化胜肽各所帶的電荷不盡相同，藉此分離磷酸化胜肽與非磷酸化胜肽，研究中結合 SDS-PAGE 與 SCX，在 SCX 移動相之酸鹼值(pH)為 2.7 時，以胰蛋白酶(trypsin)水解得到大多為正二價的胜肽，若胜肽中含有磷酸修飾，價數會因帶負一價的磷酸根而減為正一價，如此在 SCX 中含有磷酸根的胜肽會比無磷酸根的胜肽更早洗脫而出，藉此進一步將磷酸化胜肽與 9.

(22) 非磷酸化胜肽分離。但多於一個磷酸根的胜肽，價數會減少至零或小於零，這類多磷酸胜肽與 SCX 無法進行離子交換作用，因此以 SCX 分離時，多磷酸化胜肽易集中於前端分管。. 強陰離子交換層析法(Strong Anion Exchange Chromatography,. 4.2.2 SAX). 強陰離子交換層析法是藉由強鹼型樹酯上正電的基團分離胜肽 51，如圖 15 (B)所示。在特定酸鹼值下，胜肽中若含有較多帶正電的胺基酸，則與正電樹酯互相排斥，故吸附能力較弱，因此容易較早洗脫而出；若胜肽中含有較多帶負電的胺基酸，則會與正電的樹酯互相吸引，故吸附能力較強，因此較不容易被取代而較晚洗脫出來。對於磷酸化胜肽，因負電的磷酸修飾會與 SAX 有較強親和力，若含有的磷酸基團越多，則吸附能力越強而越晚洗脫出來，藉此可以將磷酸化胜肽與非磷酸化胜肽分離，更可將磷酸化胜肽進一步分成單、雙及多磷酸胜肽。在 2006 年 Zhang 選擇不同洗脫液體，將非磷酸化胜肽與磷酸化胜肽分離，而且更進一步細分磷酸化胜肽. 52. ；第一種是微型式固相萃取(solid. phase extraction, SPE)的陰離子交換層析，首先以 100 mM NaCl 將非磷酸化胜肽分離出來，再藉由 5%的 NH4OH 將磷酸化胜肽洗脫而出；第二種是一般型式固相萃取的陰離子交換樹酯，依序加入 H2O、100 mM NH4H2PO4、 300 mM NH4H2PO4 及 5% NH4OH，即可依序將非磷酸化胜肽、單磷酸化胜肽、雙磷酸化胜肽及多磷酸化胜肽各別分離出來。SAX 也可以搭配不同的純化方法進一步研究磷酸化胜肽，在 2003 年 Nühse 等人選用 IMAC 純化方法與 SAX 研究磷酸化胜肽 51，以達到更好的特異性與鑑定結果。. 4.3. 親水性作用層析法 (Hydrophilic. Interaction. Liquid. Chromatography, HILIC) 親水性作用層析法是依親水性不同分離胜肽，固定相為親水性的吸附材質，如：矽膠(silica)、amine、amide 等，親水性吸附材質與極性高的胜肽有很強的親和力，而極性低的胜肽與親水性的吸附材質親和力較弱，因 10.

(23) 此藉由 HILIC 能分離不同極性的胜肽，如圖 15 (A)所示。磷酸化胜肽與非磷酸化胜肽有極性上的差異，由於磷酸基團有較強的親水性質，當樣品經由親水作用層析分離時，非磷酸化胜肽無法與固定相結合而直接被沖堤出來，但磷酸胜肽會與固定相產生親和作用，因此將移動相極性提高時，可把磷酸化胜肽從固定相上洗脫而出 53，不僅簡單地將磷酸化胜肽與非磷酸化胜肽分離，也初步地分散磷酸化胜肽分布。將 HILIC 與不同的純化磷酸化胜肽策略結合，以利於鑑定更多的磷酸化胜肽， Dengjel 等人結合 HILIC 與 TiO2 方法 49，用以鑑定磷酸化胜肽與位點。McNulty 和 Annan 將 HILIC 應用在純化磷酸化胜肽上 54，其研究結果顯示串聯 HILIC 與 IMAC 的純化磷酸化胜肽效果最為優越，而單獨使用 HILIC、SCX 或 IMAC 的純化磷酸化胜肽效果較不理想；此外，研究顯示若樣品先經由 HILIC 預分離，再以 IMAC 純化磷酸化胜肽，其結果相較於先 IMAC 純化再 HILIC 分離之磷酸化胜肽的選擇性可提高到 99%。. 4.4 靜電排斥親水性作用層析法(Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography, ERLIC) 靜電排斥親水性作用層析法是結合 HILIC 與 IEX 的分離方法 55，如圖 16 (B)所示，其固定相材質兼具親水性與弱正電荷的性質，酸性下羧基 (-COOH)不會解離維持電中性，而胺基(-NH3)會帶一個質子形成-NH4+，磷酸基團則會解離成負離子，且磷酸根本身具親水性，相較於非磷酸化胜肽與 ERLIC 有較強的親和作用力，使得含有磷酸化修飾的胜肽能在 ERLIC 有較長的滯留時間，藉此磷酸化胜肽可以從非磷酸化胜肽分離出來 56。 ERLIC 可搭配不同的純化磷酸化胜肽方法，以鑑定更多磷酸化胜肽。 Goshe 等人搭配 ERLIC 與 IMAC 研究 Marek’s Disease (MD)57，此搭配比起個別單獨使用可以鑑定到更多的磷酸化胜肽。Dengjel 等人結合 ERLIC 與 TiO2 鑑定磷酸化修飾 49，發現 ERLIC-TiO2 比 SCX-TiO2 與 HILIC-TiO2 有更多的雙磷酸化胜肽比例；一年後，針對 ERLIC 與 SCX 搭配進一步分析 58，結果顯示 ERLIC-SCX 可以鑑定最多的磷酸化胜肽，而 SCX-ERLIC 在實驗步驟則較便利，兩種方法鑑定結果都比單獨使用 SCX 分析方法優異。 11.

(24) 五、質譜儀技術近年來，質譜分析技術日新月異，廣泛應用於各種研究，不僅有蛋白質體學，也含小分子範疇，質譜儀研究磷酸化蛋白質也有進一步的發展。. 5.1 質譜儀(Mass Spectrometry, MS) 質譜儀為分析質量的工具，其硬體設備可以分為五大結構，依序為樣品進樣區(sample inlet)、離子源(ion source)、質量分析器(mass analyzer)、偵測器(detector)以及資料處理系統(data system)。質譜儀分析是樣品經由進樣區送至離子源，分析物在離子源會游離成不同質荷比(mass-to-charge ratio, m/z)的氣相帶電離子，藉著離子源與質量分析器之間真空度與電場電位的差異，將氣相帶電離子導入質量分析器，在質量分析器裡利用電場與磁場交互作用，使得不同質荷比的離子分離，再送入偵測器檢測，最後藉由資料處理系統將所得的離子訊號以電腦分析轉換成圖譜方式呈現。. 5.1.1 電噴灑游離法(Electrospray Ionization, ESI) 早期常用的游離源為電子撞擊游離法(electron impact ionization, EI) 和化學游離法(chemical ionization, CI)59，此類游離法適合分析分子量小於 500 Da 且具有揮發性及熱穩定性的小分子，但並不適用在蛋白質的分析。二十世紀時，軟性游離源問世，其一為 Hillenkamp、Tanaka 等人提出基質輔助雷射脫附游離法(matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI)60,61，另一是 Fenn 提出的電噴灑游離法 62，透過軟性游離技術能成功分析大分子蛋白質，對於研究蛋白質體學有很大的進展 61。電噴灑游離法是施加高電壓的正電場在毛細管上，當分析物液體流經毛細管，負電荷離子往正極方向移動，而正電荷離子聚集在毛細管前端形成圓錐形的帶電液滴，稱為泰勒錐(Taylor cone)63，如圖 17 所示；當施加電壓達一定程度，使液滴尖端的靜電斥力大於液體的表面張力，而帶電液滴從泰勒錐前端噴灑形成電噴灑現象，因游離源與質譜分析器間真空度與電位的差異，將產生的多價氣相離子導入質量分析器進行後續質譜分析。. 12.

(25) 5.1.2 四極桿(Quadrupole, Q) 四極桿是一種常見的質量分析器. 64,65. ，透過四極桿可以將分析物離子. 依質荷比的不同進行篩選。四極桿結構如其名，即是由四條平行的電極，並以四方形之對角排列。透過交流電與直流電的轉換，只讓特定的質荷比離子穩定震動，順利通過四極桿到達偵測器，而其他質荷比的離子會與四極桿碰撞便無法抵達偵測器，因此可調整交流電與直流電頻率偵測不同質荷比的離子；除此之外，四極桿也可以不做任何篩選，僅讓所有離子通過，因此藉著四極桿的特性可針對已知的分析物進行相關分析。四極桿的特點在於儀器元件設置簡單以及操作容易，但是其解析度較差。. 5.1.3 離子阱(Ion Trap, IT) 離子阱是常用的質量分析器 66，運作原理與四極桿相似，它具有分離的功能，還具備保留(trap)離子的能力，與分析速度快的優點。離子阱依結構可分為兩種，其一為三維離子阱(3D ion trap)，其二為線形離子阱(linear ion trap, LIT)。離子阱是利用交流電與電場的作用，將分析物離子保留(trap) 在離子阱內，再調整交流電的大小，根據離子質荷比大小依序送至偵測器檢測，因此以離子阱作為質量分析器有較佳的快速掃描週率(duty cycle)。此外離子阱也具有碰撞的能力，當氣體送入離子阱中，可以針對儲存的離子進行多次碰撞誘導裂解(collision-induced dissociation, CID)，再依序送入偵測器檢測，進行多次質譜(MSn)分析，因此可用於分析物的定性分析。離子阱也可搭配其他質量分析器，現今有許多質譜儀會串聯四極桿與線性離子阱作為分析的工具 67。. 5.1.4 軌道阱(Orbitrap) 軌道阱是解析度佳、準確度高、背景訊號低以及掃瞄快速的質量分析器 68，與離子阱相似，不僅能分離及儲存離子，本身更能直接作為偵測器。構造上是一個高電壓的中央電極(central electrode)，以及分成兩半的接地外電極(outer electrode)組成。軌道阱原理為將分析物離子捕捉至軌道阱中，藉由電極之間交互作用使得分析物離子在軌道阱中繞著中央電極做螺旋運動，藉由旋轉的速率與頻率不同，將訊號以傅立葉轉換成質荷比而達到 13.

(26) 質量分析的目的。軌道阱也可以搭配其他質量分析器，現今有許多質譜儀會串聯四極桿或線性離子阱與軌道阱作為分析的工具 69。. 5.1.5 串聯式質譜儀(Tandem Mass Spectrometry, MS/MS) 串聯式質譜儀即是由多個質量分析器串聯而成的質譜儀，其可分為兩種，一為空間式串聯(tandem in space)，二為時間式串聯(tandem in time)，現今兩種串聯式質譜儀廣泛使用在蛋白質身分鑑定。空間式串聯是在空間上串聯質量分析器，即在不同空間上進行質譜分析，如四極桿飛行時間串聯式質譜儀，將兩個質量分析器串接一起，其中四極桿選取離子，而飛行時間掃描離子。時間式串聯是時間上串聯的質量分析器，即為不同時間上在相同質譜分析器做不同的質譜分析，如線性離子阱質譜儀，線性離子阱可在不同時間上具有選取、撞碎與掃描的能力。本實驗選用兩種串聯式質譜儀分析，一為 LTQ XL (圖 18)，其質量分析器為線性離子阱，內部儲存離子容量較傳統環形離子阱大，可提高訊號與離子累積數目，使靈敏度更佳，在此離子阱可將離子捕捉、進行碰撞及質量掃描分析；二為 LTQ Orbitrap XL (圖 19)，其質量分析器為線性離子阱以及軌道阱，軌道阱可增加解析度、準確度和掃瞄速度以及降低背景訊號，在此以離子阱進行碰撞誘導解離，而軌道阱作為質量掃描分析。. 5.2 蛋白質身分鑑定(Protein Identification) 蛋白質是由二十種胺基酸組成，各個蛋白質擁有特定的胺基酸排列順序與數目，蛋白質體學是希望透過蛋白質的研究能更加了解生物體中相關的運作模式，以進一步探討在不同生理或疾病狀態之蛋白質表現與差異。早期仰賴 Edman 降解定序方法(Edman sequencing)鑑定蛋白質的身分，隨著質譜儀技術開發，發展出胜肽質量指紋方法(peptide mass fingerprinting, PMF)，因串聯式質譜儀(MS/MS)分析技術日新月異，現今研究多以胜肽碎片指紋法(peptide fragment fingerprinting, PFF)鑑定蛋白質的胺基酸序列以及化學修飾等相關研究。. 14.

(27) 5.2.1 Edman 降解定序方法(Edman Sequencing) 早期是將分析物藉由高效能液相層析儀 (high performance liquid chromatography, HPLC) 或二維聚丙烯酰胺凝膠電泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D-PAGE)方法找出純蛋白質，直接以 Edman 降解定序方法進行胺端(N-terminal)胺基酸序列分析。除上述方法之外，將純蛋白質以蛋白質水解酵素進行蛋白質水解(digestion)，蛋白質水解後可得較小的胜肽片段(peptide fragments)，再以 Edman 降解定序方法進行胺端(N-terminal)胺基酸序列分析 70，藉此得知的胺基酸序列組合來鑑定蛋白質。但是此法花費時間，且能解讀出的胺基酸序列有限，故不適用於複雜的蛋白質體研究。. 5.2.2 胜肽質量指紋(Peptide Mass Fingerprinting, PMF) 胜肽質量指紋鑑定蛋白質的身分是由質譜分析技術所發展出的方法 71。胜肽質量指紋方法是先選用高效能液相層析儀或二維電泳方法純化蛋白質，再藉由水解反應將蛋白質切割成一群獨特、不同質量的胜肽片段，因不同蛋白質含特有的胺基酸序列，如同每個人都有屬於自己的指紋，搭配搜尋引擎和電腦資料庫(database)比對已知序列的蛋白質所對應的胜肽質量，並以統計法找出最大機率產生此胜肽質量的蛋白質序列，即可鑑定蛋白質的身分。然而此法亦不適用複雜的蛋白質體研究。. 5.2.3 胜肽碎片指紋(Peptide Fragment Fingerprinting, PFF) 對於大量複雜的蛋白質分析物，無法以 Edman 降解定序法與 PMF 方法分析，現今選用串聯式質譜法(MS/MS)搭配胜肽碎片指紋鑑定蛋白質身分. 72,73. 。PFF 方法是直接將複雜的蛋白質水解成小段的胜肽，再送入串聯. 式質譜儀分析。於串聯式質譜儀分析時，在儀器中第一段質量分析器選取特定範圍內質荷比的胜肽離子，選取的胜肽離子亦稱為前驅離子(precursor ions)，緊接著前驅離子進入碰撞室內，前驅離子經由碰撞後碎裂成產物離子(product ions)，再將產物離子送入第二段質量分析器掃描，最後至偵測器檢測與資料處理系統以得到碎片離子圖譜，搭配搜尋引擎和電腦資料庫 (database)比對，即可進行蛋白質的身分鑑定。 15.

(28) 胜肽離子碎片命名可分為兩類，一為胺端(N-terminal) 碎片包含 a、b、 c 系列離子，另一為羧端(C-terminal)碎片包含 x、y、z 系列離子，數字則代表胺基酸的排列順序，如圖 20 所示。依據不同的碰撞模式有不同的碎片離子，碰撞誘導裂解(collision-induced dissociation, CID)是以惰性氣體與前驅離子碰撞，將動能轉成內能使得前驅離子碎裂成 b-ions 與 y-ions 碎片離子；高能量碰撞裂解(high-energy collision dissociation, HCD)也可得 b-ions 與 y-ions 碎片離子；電子捕捉裂解(electron capture dissociation, ECD)或電子轉移裂解(electron transfer dissociation, ETD)則可得 c-ions 與 z-ions 碎片離子。由相同系列的碎片離子之間的質量差距(如:b2、b3、b4……)，可推算胜肽前驅離子的序列，以此序列與資料庫比對理論蛋白質序列分析，進一步得知蛋白質的身分。PFF 方法有高正確率與高專一性，不僅常應用在蛋白質身分鑑定，也可研究轉譯後修飾等相關研究。. 5.3 質譜應用在磷酸化蛋白質序列鑑定藉由串聯式質譜儀分析磷酸化胜肽時，其鑑定方法與胜肽相同，在磷酸化胜肽與非磷酸化胜肽的差異在於磷酸化修飾，理論上由質量上找出 80 Da 的質量差即可判斷，但磷酸化胜肽特有的性質，大多無法直接由此方式辨別磷酸化胜肽，因此在鑑定磷酸化胜肽有不少限制與挑戰。以下為現今常用的質譜分析方法鑑定磷酸化胜肽。. 5.3.1 產物離子掃描(Product Ions Scan)模式現今最常使用的分析模式是結合檢視質譜掃描(survey scan)與產物離子掃描進行分析，產物離子掃描模式如圖 21 (A)所示；一開始選用檢視質譜掃描，在此質量分析器會掃描特定質量範圍內離子的質荷比，並以數據相關擷取模式(data dependent acquisition, DDA)設為接續離子掃描的依據，如:胜肽的強度、質荷比、帶電價數及鑑定次數；若符合 DDA 條件則進行產物離子掃描，在第一段質量分析器選出符合 DDA 條件的前驅離子 (precursor ions)，將選出的前驅離子送入碰撞室產生產物離子(product ions)，將碎片離子送至第二段質量分析器掃描，最後到達偵測器檢測與資料處理系統得到圖譜。 16.

(29) 藉由檢視質譜掃描可在全掃描譜圖(MS)中，發現相同序列的胜肽中含磷酸化修飾相較於無磷酸化修飾有多 80 Da 的分子量，若含有兩個磷酸化修飾則多 160 Da 的分子量，如圖 22 (A)所示；藉由產物離子掃描模式可在 MS2 圖譜中由碎片產物離子訊號推算胜肽序列及磷酸位點；一般常用的碎裂模式為碰撞誘導裂解(collision-induced dissociation, CID)，以圖 22 (B)為例，在圖中有前驅離子丟失磷酸化修飾的訊號([M+2H-H3PO4]2+)，藉此可知此胜肽序列含有磷酸化修飾，經由 b-ions 和 y-ions 推算 MS2 圖譜對應的胜肽序列為 GTGQsSDDsSDIWDDTALIK。在圖 22 (C)中顯示不同 b-ions 和 y-ions 對應之 m/z 值，在 y-5 碎片離子中單純只有 TALIK 胺基酸組合 (545.3657 Da)，且在 T (theronine)上並未多出 80 Da 的訊號，因此推得在 theronine 上並無磷酸修飾；而在 y-11 碎片離子得到 1356.6083 Da 的訊號，為 SDIWDDTALIK 胺基酸序列加上一個磷酸化修飾所得(1276.6999 + 79.9 =1356.6083)，在 S (serine)上多了一個磷酸化修飾(+80 Da, HPO3)，此外在進行碰撞誘導解離時也有丟失磷酸修飾的訊號(-98 Da, H3PO4)，故有 1258.6083 Da (1356.6083–98=1258.6083)離子訊號，依此類推得知在胜肽序列 GTGQsSDDsSDIWDDTALIK 中第五個與第八個胺基酸位置之絲胺酸皆有磷酸化修飾。因磷酸化修飾較不穩定，在 CID 下易發生中性磷酸化修飾 (-98 Da, H3PO4 或-80 Da, HPO3)丟失，加上中性丟失峰(neutral loss fragments) 強度於 MS2 圖譜中抑制其他碎片離子訊號，如圖 23 (A)所示 74，造成直接判定磷酸化修飾及位點有限制，也讓胜肽序列鑑定困難度增加。. 5.3.2 Neutral Loss MS3 (NL-MS3)及 Multistage Activation (MSA)模式在離子阱(ion trap)質譜儀中，因離子阱本身具有保留(trap)離子功能，在碰撞誘導裂解(CID)時亦可選用 neutral loss MS3 (NL-MS3)及 multistage activation (MSA)模式 74，以期望能得到更佳的磷酸化胜肽碎片離子訊號，如圖 24 所示，兩種模式之間差別在不同的中性丟失離子分析路徑。 NL-MS3 模式是於 MS2 掃描裡發現有中性磷酸丟失的離子，如圖 21 (C) 所示，便進行選取(isolate)中性磷酸丟失的離子，並再次碰撞誘導裂解(CID)，將產生已丟失磷酸修飾的碎片離子送入偵測器檢測，即可鑑定已丟失磷酸修飾的胜肽序列，如圖 23 (B)所示 74。 17.

(30) MSA 模式又可稱為 pseudo MS3，當碰撞誘導裂解產生的中性磷酸丟失離子時，不必進行選取(isolate)，而是直接對中性磷酸丟失離子進行再次碰撞誘導裂解，將第一次與再次裂解後的碎片離子一同送入偵測器檢測，如此一來能在同一張圖譜中得到 MS2 及 MS3 所有的碎片離子訊號，更可以降低訊號抑制機率，因此大大提升靈敏度，如圖 23 (C)所示 74。. 5.3.3 前驅離子掃描(Precursor Ions Scan)模式除上述分析模式之外，以 Applied Biosystems Sciex 的 QTRAP 質譜儀分析時，亦可選用前驅離子掃描模式取代檢視質譜掃描，並搭配產物離子掃描模式(product ions scan)偵測磷酸化胜肽. 75,76. ，前驅離子掃描模式如圖. 21 (B)所示。分析方式是先進行負電模式的前驅離子掃描，於第一個質量分析器(Q1)掃描所有胜肽離子，並將所有離子送入氣體碰撞室裂解，以 CID 模式下裂解的碎片離子中，若含有相差 79 Da 的碎片離子 (即為 PO3－官能基)，則讓此碎片離子通過第三個質量分析器(linear ion trap)送至偵測器進行檢測，如此可推知前驅離子中有磷酸化修飾離子；透過前驅離子掃描得知分析物中含有磷酸修飾的胜肽前驅離子，便進行正電模式的產物離子掃描，產物離子掃描模式如同前述，即可在 MS2 圖譜推算磷酸化胜肽序列。. 5.3.4 高能量碰撞裂解(High-Energy Collision Dissociation, HCD)及電子轉移裂解(Electron Transfer Dissociation, ETD)模式在鑑定磷酸化胜肽時，亦可選擇高能量碰撞裂解及電子轉移裂解。 HCD 模式裂解得到的碎片離子仍保有完整的磷酸化資訊，且產生的 b-ions 和 y-ions 訊號強度較 CID 強，如圖 23 (D)所示 74，但此碰撞模式不適合分析含有酪胺酸(tyrosine, Tyr, Y)的磷酸化胜肽，因 HCD 碰撞特性使磷酸化酪胺酸(pY)容易斷裂，而偵測到 216 Da 的 pY-immonium ion (圖 25)。 ETD 模式是藉由低電子親和力的陰離子化合物與胜肽前驅離子碰撞，陰離子產生電子轉移，在降低一個價數的情形下，前驅離子裂解成 c-ions 和 z-ions，此碰撞模式能保有完整磷酸化修飾，故適合鑑定磷酸化位點 77。在數種鑑定磷酸化胜肽的裂解模式中，有文獻研究指出 CID 和 HCD 對於二價的離子有良好的鑑定結果；而在胜肽離子中常見的價數為正二價，因 18.

(31) ETD 碰撞模式使得前驅離子在裂解過程裡加上一個電子，如此一來總價數降低至正一價，但在數據相關擷取模式(DDA)設定中不分析正一價離子，因此 ETD 適於鑑定三價或三價以上的離子，如圖 23 (E、F)所示 74。. 5.3.5 數據分析處理運用質譜儀系統分析磷酸化胜肽，搭配合適的統計運算分析軟體整合質譜數據，以得知磷酸化胜肽資訊。生物資訊軟體是透過分析數據與資料庫比對，以推測胜肽相關訊息，在分析磷酸化胜肽時，於可變修飾(variable modifications) 選項中增加 Phospho (ST)和 Phospho (Y)的設定，以比對磷酸化胜肽。常用資料庫比對軟體有 Mascot、Proteome Discoverer、ProteinPilotTM 等等。以圖 22 (C)為例，以 Mascot 搜尋與資料庫比對後，顯示各個 b-ions 和 y-ions 所對應之 m/z 值。現今質譜儀技術及各種純化方法蓬勃發展，提升鑑定更多磷酸化修飾的機會，因而對生物資訊有更進一步的了解。. 5.4 差異蛋白質體學(Differential Proteomics) 蛋白質體學研究蛋白質身分之外，蛋白質定量分析也相當重要，蛋白質於不同生理狀態有不同的表現，藉由定量分析了解其功能和生理機制之關聯，並找尋生物標記(biomarker)進而對病理預防與治療有更進一步發展。定量方式分為兩類－gel-based 與 gel-free，兩者差異在有無使用膠體； gel-based 定量方法有二維凝膠電泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D-PAGE)及二維差異凝膠電泳(two-dimensional differential in gel electrophoresis, 2D-DIGE)78，即是選用膠體分離蛋白質，並可直接辨識膠體上蛋白質含量差異，此類可搭配質譜鑑定蛋白質身分；而 gel-free 可分成三類(圖 26)，第一類是代謝物標記(metabolic labeling)，如細胞培養胺基酸穩定同位素標定(stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC)79，於第一代活體細胞培養加入含同位素的培養基，經數代後，細胞內則有同位素標記；第二類是化學同位素標記(chemical stable isotope labeling)，即是在蛋白質或胜肽下添加化學同位素進行標記，可細分兩種，一在 MS 圖譜定量分析，如雙甲基化標記(dimethyl labeling)80 或同位素親和標定(isotope-coded affinity tags, ICAT)81 等，另一種為等重標記(isobaric 19.

(32) tags)在 MS/MS 圖譜同時定量與定性分析，如同重元素相對與絕對定量標記(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)82,83 或串聯質譜標記(tandem mass tag, TMT)84；第三是無標記定量(label-free quantitation)85，不須標記，單純以訊號強度、面積或二次質譜圖張數進行定量分析。以下介紹現今常用的定量方法，同重元素相對與絕對定量標記及無標記定量。. 5.4.1 同重元素相對與絕對定量標定 (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ) 同重元素相對與絕對定量標定是一種化學標記方法，現今 iTRAQ 試劑一次能標記四到八個樣品，此試劑可分成三個基團(圖 27)，分別為報導基團(reporter group)、平衡基團(balance group)與反應基團(reactive group)。反應基團(NHS-)能夠與胜肽的自由胺基(free amine)鍵結，在胜肽中胺端 (N-terminal)與離胺酸(lysine, K)皆具有自由胺基。報導基團與平衡基團是由不同同位素組合的同重元素，若標記四個樣品，其報導基團質量為 114-117 Da，而平衡基團質量為 31-28 Da，則四個試劑中報導基團與平衡基團總質量皆為 145 Da，因此由檢視質譜掃描能在 MS 圖譜中看到有相同質荷比的前驅離子，再套用產物離子掃描模式經第一段質量分析器選出前驅離子，並碰撞碎裂後之產物離子送入第二段質量分析器掃描，便能在 MS/MS 圖譜中得到胜肽碎片訊號，與資料庫比對即可鑑定蛋白質身分，同時於低質量範圍的報導基團之譜峰強度或面積可做不同樣品之相同蛋白質間的相對含量分析。圖 28 為標定方法流程圖，先將各個樣品各別標記上試劑，並將所有樣品混合均勻，最後再送入串聯式質譜儀進行分析。. 5.4.2 無標記定量方法(Label-Free Quantitation) 無標記定量方法不需任何試劑即可做蛋白質定量分析，此法常搭配自下而上分析方法(bottom-up method)與串聯式質譜儀鑑定蛋白質相對含量。首先不同樣品各自透過蛋白酶將蛋白質水解成較小片段的胜肽，各別經過液相層析分離並送入串聯式質譜儀，即可得含有序列資訊的圖譜，經由資料庫比對可得蛋白質身分，而在 MS 圖譜中的譜峰強度、面積或 MS/MS 圖譜張數(spectral counting)即可做為此蛋白質在不同樣品間相對含量分析 20.

(33) 的依據(圖 29)，若蛋白質在樣品中含量較多，則在 MS 圖譜中有較高的譜峰強度、較大的譜峰面積或者是較多張的 MS/MS 圖譜數。對於應用在磷酸化胜肽分析時，其方式與上述相同，但仍須使用磷酸化胜肽純化技術。無標記定量方法的優點在於不受限樣品數目、成本便宜且動態範圍 (dynamic range)廣，但定量的準確度會因各別的實驗過程而有偏差。. 六、研究動機基於蛋白質磷酸化與生物體內化學反應有密不可分的關聯，期望藉由有效又準確的分析技術鑑定不同狀態之磷酸化修飾，進一步了解疾病並找出相關治療與預防方法。現今多採用質譜儀分析技術搭配自下而上分析方法偵測磷酸化修飾與位點，但會遇到許多困難：第一，生物體內磷酸化表現量稀少且可逆；第二，質譜儀廣泛使用正電模式，造成磷酸化胜肽難以游離，且易被高含量的非磷酸化胜肽抑制訊號；第三，常選用碰撞誘導裂解(CID)進行碰撞，而磷酸化前驅離子容易丟失磷酸(H3PO4, 98 Da)成為高強度的中性丟失譜峰，因此常常無法推測確切的磷酸化胜肽序列及位點。克服上述難題鑑定磷酸化胜肽序列及位點為首要目的，可利用多種碰撞模式具有不同的特性，或搭配純化方法以減少非磷酸化胜肽的干擾，藉此找尋出磷酸化位點以及磷酸化胜肽序列資訊。現今已開發出許多策略純化磷酸化蛋白質/胜肽，如 IMAC、MOAC 等，透過純化策略搭配質譜分析技術能鑑定到更完整的磷酸化資訊。本研究結合脂族羥基酸修飾的金屬氧化物層析法(HAMMOC)與液相層析串聯式質譜分析技術 (LC-MS/MS) 研究磷酸化蛋白質體學。首先由脂多醣 (lipopolysaccharide, LPS)刺激小鼠巨噬細胞株(RAW 264.7)萃取出來的蛋白質，以丙酮沉澱法與離心過濾法進行蛋白質去鹽，取毫克含量的蛋白質藉由 Lys-C 與胰蛋白酶(trypsin)進行蛋白質水解，水解後的複雜胜肽運用 HAMMOC 純化以及等電點聚焦電泳(sIEF)分離，並搭配 LC-MS/MS 分析，比較不同去鹽方法之磷酸化研究；接著於 HAMMOC 純化後，以等電點聚焦電泳(sIEF)、強陽離子交換層析法(SCX)以及親水性作用層析法(HILIC) 降低樣品複雜度，並比較不同分離策略之磷酸化研究；最後，採用無標記定量方法進行磷酸化蛋白質體相對定量分析。圖 30 為實驗總流程圖。 21.

(34) 第二章實驗材料一、樣品 RAW 264.7 (Murine macrophage cell line, 小鼠巨噬細胞株)，由工業技術研究院曾湘文博士提供。. 二、藥品與試劑 Acetic acid (J.T Baker) Acetone (J.T Baker) AcetonitrileHPLC grade (Merck KGaA) Ammonium formate (NH4HCO2) (Sigma-Aldrich) Bovine serum albumin (Sigma-Aldrich) Coomassie® Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad Laboratories Inc.) Cover fiuid (mineral oil) (Agilent Technologies) D,L-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich) D,L-Lactic acid (Wako) Formic acid (J.T. Baker) Glycerol (Sigma-Aldrich) Iodoacetamide (Sigma-Aldrich) Lysyl endopeptidase (Lys-C) (Wako) Methanol HPLC grade (Merck KGaA) OFFGEL ampholyte buffer 3-10 (GE Healthcare Bio-Sciences AB) Piperidine (Sigma-Aldrich) Phosphoric acid (H3PO4) (Merck KGaA) Potassium chloride (KCl) (J.T Baker) Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) (Sigma-Aldrich) Sequencing grade modified trypsin (Promega) Triethylammonium bicarbonate buffer (Sigma-Aldrich) Trifluoroacetic acid HPLC grade (Alfa Aesar) Urea (J.T Baker) 22.