第三章 實驗方法
10.2 Dionex UltiMate 3000 Rapid Separation LC system
Mobile phase A: 0.1% FA in milli-Q H2O Mobile phase B: 0.1% FA in ACN
管柱
Trapping column: symmetry ® C18, 180 μm* 20 mm, 5 μm, 300 Å (Waters) Analytical column: BEH 130, 100 μm* 100 mm, 1.7 μm, 130 Å (Waters) 梯度設定
10.2 Dionex UltiMate 3000 Rapid Separation LC system
移動相35
十一、串聯式質譜參數設定 11.1 LTQ XL
使用 LTQ 質譜系統軟體 Xcalibur version 2.1 以數據相關擷取模式 (data dependent acquisition, DDA)搭配動態排除(dynamic exclusion)設定，
根據研究方向設定條件以進行質譜分析。在檢視質譜掃描(survey scan) 中掃描 350-2000 質荷比(m/z)的前驅離子，選取訊號強度高的前驅離子 進行 zoom scan 確認前驅離子價數，再進行二次質譜分析(MS/MS)。
(Scan Event 1) MS1: survey scan Scan range: 350-2000 m/z
(Scan Event 2) zoom scan: 從 MS1中選取第一強的離子進行 zoom scan Reject charge state: 1
Repeat counts: 2 Repeat duration (s): 30 Exclusion duration (s): 180
(Scan Event 3) MS2: 離子擊碎進行二次質譜掃描 Collision energy: 35%
Activation time (ms): 30
(Scan Event 4) zoom scan: 從 MS1中選取第二強的離子進行 zoom scan
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11.2 LTQ Orbitrap XL
使用 LTQ 質譜系統軟體 Xcalibur version 2.2 以數據相關擷取模式 (data dependent acquisition, DDA)搭配動態排除(dynamic exclusion)設定，
根據研究方向設定條件以進行質譜分析。在檢視質譜掃描(survey scan) 中掃描 300-1600 質荷比(m/z)的前驅離子，選取訊號強度高進行二次質 譜分析(MS/MS)。
(Scan Event 1) MS1: survey scan Scan range: 300-1600 m/z
(Scan Event 2) MS2: 從 MS1中選取第一強的離子進行二次質譜掃描 Reject charge state: 1
Repeat counts: 1 Repeat duration (s): 30 Exclusion duration (s): 60 Exclusion size: 500 Collision energy: 35%
Activation time (ms): 30
(Scan Event 3) MS2: 從 MS1中選取第二強的離子進行二次質譜掃描
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11.3 應用於無標記(Label-Free)之 LTQ Orbitrap XL
使用 LTQ 質譜系統軟體 Xcalibur version 2.2 以數據相關擷取模式 (data dependent acquisition, DDA)搭配動態排除(dynamic exclusion)設定，
根據研究方向設定條件以進行質譜分析。在檢視質譜掃描(survey scan) 中掃描 300-1600 質荷比(m/z)的前驅離子，選取訊號強度高進行二次質 譜分析(MS/MS)。在無標記研究中，動態排除(dynamic exclusion)設定有 兩種數值，第一種是將重複鑑定次數(repeat counts)設為 1，而排除滯留 時間(exclusion duration)設為 60 秒；第二種是將重複鑑定次數(repeat counts)改為 10，而排除滯留時間(exclusion duration)改為 30 秒。
(Scan Event 1) MS1: survey scan Scan range: 300-1600 m/z
(Scan Event 2) MS2: 從 MS1中選取第一強的離子進行二次質譜掃描 Reject charge state: 1
Repeat counts: 1/10 Repeat duration (s): 30 Exclusion duration (s): 60/30 Exclusion size: 500
Collision energy: 35%
Activation time (ms): 30
(Scan Event 3) MS2: 從 MS1中選取第二強的離子進行二次質譜掃描
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十二、蛋白質資料庫搜尋(Data Analysis)
軟體版本 MSConvert
Mascot Daemon version 2.3.0 (Matrix Science) 方法
將經質譜分析得到的檔案(.raw)先使用 MSConvert 轉檔成.mgf 檔，再送 入 Mascot Daemon 軟體進行蛋白質身分鑑定。
以 LTQ XL 分析之 Mascot Daemon 參數設定
Database: IPI_mouse_.v3.87 (59,534 sequences; 26,627,161 residues) Enzyme: trypsin, lys-C
Max. missed cleavage site: 1
Fixed modification: carbamidomethyl (C)
Variable modification: oxidation (M), phospho (ST), phospho (Y) Peptide charge: 2+, 3+ and 4+
Peptide mass tolerance: 1.5 Da Fragment mass tolerance: 0.6 Da Instrument type: ESI-Trap
以 LTQ Orbitrap XL 分析之 Mascot Daemon 參數設定
Database: IPI_mouse_.v3.87 (59,534 sequences; 26,627,161 residues) Enzyme: trypsin, lys-C
Max. missed cleavage site: 1
Fixed modification: carbamidomethyl (C)
Variable modification: oxidation (M), phospho (ST), phospho (Y) Peptide charge: 2+, 3+ and 4+
Peptide mass tolerance: 10 ppm Fragment mass tolerance: 0.6 Da Instrument type: ESI-Trap
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第四章 實驗結果與討論
一、蛋白質濃度測定
首先將樣品進行蛋白質濃度測定，本實驗使用 Bradford protein assay 進行測量，其是藉由 Coomassie® Brilliant Blue G-250 染劑來定量蛋白質，
於不同酸鹼環境染劑會呈現不同顏色，在酸性下呈茶色，當染劑與蛋白質
而過濾膜有不同的 molecular weight cut-off (MWCO)，在此是選用 3 kDa 的
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故在進行後續實驗之前須再次進行蛋白質濃度測定，經由 Bradford protein assay 與 BSA 檢量線推測(表 6 及圖 35)。以離心過濾法去鹽後得到的控制
41 圍在 3-10 的 IPG (immobilized pH gradient)膠條，以 Agilent 3100 OFFGEL fractionator 進行分離，其原理是利用固定電流緩慢增加電壓使得已純化的 磷酸化胜肽能在 IPG 膠條間遷移，直到在特定酸鹼值下，磷酸化胜肽的淨 電荷為零即為此胜肽之等電點，其不受電場影響而停留在該區間不再遷移，
此時樣品從膠條釋出並存在該酸鹼值上層的緩衝溶液裡，分離完成後從液 相中回收樣品，在此將 24 個孔槽以 2 個合為 1 管，共回收 12 管，圖 36 為經 Microsoft Excel 的 Agilent 3100 OFFGEL fractionator plotter 巨集程式 繪出在分離過程中記錄儀器運作的參數變化，圖 35 (A)是以離心過濾法經 proteins)和獨特的胜肽數目(# of unique peptides)，從胜肽中找出非磷酸化胜 肽 數 目 (# of non-phosphopeptides) 和 獨 特 的 磷 酸 化 胜 肽 (# of unique phosphopeptides)，並統計每一條磷酸化胜肽含有多少磷酸化位點 (# of phosphopeptide sites)，舉例來說，一條雙磷酸化胜肽中含有兩個磷酸化修
42 (peptides/phosphorylation sites identified)、修飾(modification)、比對資料庫 之胜肽分數(peptide score)以及比對到的蛋白質名稱以及序號(accession number)，於修飾中 2Phospho (ST)表示此條磷酸化胜肽含有 2 個位於絲胺 酸(S)或蘇胺酸(T)的磷酸化修飾，而 Oxidation (M)表示含有 1 個甲硫胺酸 (methionine, M)的氧化修飾。
2.3 去鹽策略之互補性(Complementarity)分析
從 LTQ XL/LTQ Orbitrap XL 結果顯示兩種去鹽方法共可以鑑定到 265/1231 個磷酸化蛋白質與 491/2953 段磷酸化胜肽。在 LTQ Orbitrap XL 結果中丙酮沉澱法可以鑑定到 71.8%磷酸化蛋白質與 61.3%磷酸化胜肽，
43 trypsin 進行蛋白質水解，水解後依序進行 SDB 去鹽、HAMMOC 磷酸化胜 肽純化以及再次 SDB 去鹽，並將樣品分成三等份，各以 1.2 mg 進行 sIEF、
SCX 與 HILIC 分離以降低樣品複雜度，以 C18 離心管柱去鹽，最後送入 液相層析串聯式質譜分析，並以 Mascot Daemon 軟體進行磷酸化蛋白質身 分鑑定。
3.1 等電點聚焦電泳(Solution Isoelectric Focusing Electrophoresis, sIEF)
Excel 的 Agilent 3100 OFFGEL fractionator plotter 巨集程式繪出在分離過程 中記錄儀器運作的參數變化，當 kVHours 達到 50 kVh，即表示分離完成，在此花費約 27 小時完成分離。經 sIEF 分離後，以 C18 離心管柱去鹽，去 除遮蔽質譜訊號之干擾物，再送入 LC-MS/MS，並經 Mascot 與資料庫比 對。將鑑定結果統計成表 7 與表 8，表中列出鑑定的總圖譜數、獨特的蛋 白質/胜肽/非磷酸化胜肽/磷酸化胜肽數目、磷酸化位點以及特異性；圖 37
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3.2 強陽離子交換層析法(Strong Cation Exchange Chromatography,
SCX)
45 譜訊號之干擾物，再送入 LC-MS/MS，並經 Mascot 與資料庫比對。將鑑 定結果統計成表 14 與表 15，表中列出鑑定的總圖譜數、獨特的蛋白質/胜
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3.4 分離策略之互補性(Complementarity)分析
從 LTQ XL/LTQ Orbitrap XL 結果顯示三種不同分離方法一共可以鑑 定到 297/1367 個磷酸化蛋白質與 365/3264 段磷酸化胜肽。在 LTQ Orbitrap XL 結果中 sIEF 可以鑑定到 64.7%磷酸化蛋白質與 55.5%磷酸化胜肽，SCX (LPS-treated)各別經離心過濾法去鹽，各取 0.2 mg 使用 Lys-C 與 trypsin 進 行蛋白質水解，水解後依序進行 SDB 去鹽、HAMMOC 純化以及再次 SDB 去鹽，最後各自送入液相層析串聯式質譜分析(LTQ Orbitrap XL)，並以 Mascot 進行磷酸化蛋白質身分鑑定以及定量分析。
在此比較兩種不同質譜參數設定對磷酸化蛋白質身分鑑定與定量分 析之差異，第一種簡稱為常用分析質譜設定(repeat counts: 1, exclusion duration: 60)，其是將 dynamic exclusion 設定中的重複鑑定次數(repeat counts)設為 1 次，repeat duration 設為 30 秒，而排除滯留時間(exclusion
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duration)設為 60 秒，此設定針對相同胜肽之前驅離子在 30 秒內只會進行 1 次 MS/MS 分析，便將此離子送入排除列表(exclusion list)滯留 60 秒，若於 60 秒後相同 m/z 離子仍存在，則可再次進行 MS/MS 分析；第二種簡稱為 變動分析質譜設定(repeat counts: 10, exclusion duration: 30)，其是將重複鑑 定次數改為 10 次，而排除滯留時間改為 30 秒，此設定針對相同胜肽之前 驅離子在 30 秒內可重複進行 MS/MS 分析最多 10 次，若已達到 10 次則不 再進行 MS/MS 分析，並送入排除列表滯留 30 秒，30 秒後相同 m/z 離子才 可再次進行 MS/MS 分析。
4.1 磷酸化蛋白質身分鑑定
理論上在常用分析質譜設定下(repeat counts: 1, exclusion duration: 60)，
對於同一條磷酸化胜肽的 MS/MS 圖譜數目會比變動分析質譜設定(repeat counts: 10, exclusion duration: 30)較少，進而增加不同磷酸化蛋白質鑑定的 機會，因此有較多的磷酸化胜肽與磷酸化蛋白質鑑定數目。將磷酸化胜肽 質與 1641/1517 段獨特的磷酸化胜肽，其中包含 2169/2012 個磷酸化位點，
而在變動分析質譜設定下，控制組/LPS 刺激組共可鑑定到 448/472 個獨特 的磷酸化蛋白質與 954/1024 段獨特的磷酸化胜肽，其中包含 1347/1509 個 磷酸化位點。圖 49 是兩種不同質譜參數分析下，磷酸化蛋白質與磷酸化 胜肽之 Venn diagram，無論是控制組或 LPS 刺激組，都以常用分析質譜設 定鑑定到較多獨特的磷酸化蛋白質與磷酸化胜肽。因此在定性分析上，以 常用分析質譜設定(repeat counts: 1, exclusion duration: 60)有較佳的鑑定結 果。
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4.2 磷酸化蛋白質定量分析
將比對資料依據 spectral counting 方式進行相對定量分析，挑選相同磷 酸化蛋白質之 MS/MS 圖譜數，將 LPS 刺激組除以控制組得到一個比值 (spectral counts)，當比值大於 1 或不可相除者，則表示此磷酸化蛋白質在 LPS 刺激組中含量較多，即是上調蛋白質；若比值小於 1 者，則表示此磷 酸化蛋白質在控制組中含量較多，即是下調蛋白質。理論上在變動分析質 譜設定(repeat counts: 10, exclusion duration: 30)，同一條磷酸化胜肽的 MS/MS 圖譜數目 會 比 常用分析質譜設 定下(repeat counts: 1, exclusion 質譜設定(repeat counts: 10, exclusion duration: 30)有較可信的定量結果。
4.3 生物資訊分析
在此將上述 114 個具有差異表現的磷酸化蛋白質送入 Gene Go 生物資 訊軟體分析，找到數個具有差異表現的蛋白質在 Immune Response_CD28 Signaling 生物路徑中 (圖 51)，這個結果顯示透過 HAMMOC 純化方法搭 配 LC-MS/MS label-free 定量方式，可以找出具有參與特定生物功能的差異 表現磷酸化蛋白質。
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第五章 結論與未來展望
本篇利用脂族羥基酸修飾的金屬氧化物層析法(aliphatic hydroxyl acid-modified metal oxide chromatography, HAMMOC)純化磷酸化胜肽並搭 配 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 分 析 技 術 (liquid chromatography tandem mass 酸化位點)，並以 label-free 進行控制組與刺激組之相對定量分析，挑選 114 個差異表現的磷酸化蛋白質。
結果顯示選用 HAMMOC 搭配 LC-MS/MS 適合深入研究磷酸化蛋白質 體學的定性和定量分析。期望未來能以 HAMMOC 純化方法搭配同重元素 相對與絕對定量標定(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)進行相對定量分析，並挑選出具有差異表現的磷酸化蛋白質，以探 討相關生物資訊。
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附圖
圖 1、磷酸化與去磷酸化(Phosphorylation-Dephosphorylation)循環
圖 2、O-phosphates 之磷酸化
O-phosphates 是修飾在絲胺酸(serine, Ser)、蘇胺酸(threonine, Thr)或酪胺酸 (tyrosine, Tyr)位置，各別簡稱為 pS、pT 與 pY。
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圖 3、常見分析磷酸化蛋白質方式
首先將蛋白質從細胞或組織中萃取出來，選擇合適的水解酵素將蛋白質水 解成胜肽，接著藉由純化技術分離磷酸化胜肽與非磷酸化胜肽，最後將磷 酸化胜肽送入質譜儀分析，鑑定磷酸化位點，更可以進一步了解相關的生 物資訊分析。
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圖 4、純化磷酸化蛋白質與磷酸化胜肽示意圖
現今成功開發純化方法分為兩群，即化學衍生法及親和性層析法，化學衍生法又可分為β-elimination 與 PAC，而親和性層 析法也可分為免疫沉澱法、固定相金屬親和層析法、金屬氧化物親和層析法與固定相金屬親和層析連續洗脫法。
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圖 5、以 β-elimination 純化磷酸化胜肽
以磷酸化絲胺酸(pS)為例，藉由 β-elimination 將磷酸化絲胺酸(pS)衍生化，
採用 Michael addition 方法將生物素(biotin tag)標記於脫去磷酸基團的胜肽 上，透過含有親和素(avidin)的層析管柱純化已脫去磷酸基團的磷酸化蛋白 質或磷酸化胜肽。
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圖 6、以 Phosphoramidate Chemistry (PAC)純化磷酸化胜肽
以磷酸化絲胺酸(pS)為例，先藉由碳二亞胺濃縮反應使得半胱胺酸(cysteine) 修飾在磷酸基團上，修飾上半胱胺酸的磷酸化胜肽會以共價鍵與碘乙酰胺 樹脂鍵結，最後以酸液洗滌釋放已修飾的磷酸化胜肽。
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圖 7、固定相金屬親和層析法(IMAC)示意圖
(A) 將樣品加入已平衡好的 IMAC 管柱中。(B) 加入洗液，以去除非特異性鍵結，磷酸化胜肽仍與 IMAC beads 鍵結。
(C) 加入洗脫液體，將磷酸化胜肽洗脫而出。
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圖 8、固定相金屬親和層析法(IMAC)之螯合基
(A) 三螯合基 iminodiacetic acid (IDA)(B) 四螯合基 nitrilotriacetic acid (NTA)
圖 9、含有羧基(-COOH)側鏈的胺基酸
(A)天冬胺酸(aspartic acid, Asp, D)(B)麩胺酸(glutamic acid, Glu, E)
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圖 10、去胺基化(Deamidation)
去胺基化反應屬於與 glycine (Gly)有關的自發反應，以 asparagine (Asn)為
去胺基化反應屬於與 glycine (Gly)有關的自發反應，以 asparagine (Asn)為