第三章 結果與討論
第二節 綠豆澱粉分支酶 cDNA 之選殖
對於綠豆澱粉分支酶 cDNA 序列之選殖共分為三階段，首先利用已 知 SBE 保守區間設計的引子以 RT-PCR 方法獲得一段 SBE cDNA 序列，
再根據該段 cDNA 序列分別設計靠近 5’及 3’端之專一性引子，進行 5’
RACE 和 3’RACE 延伸兩端序列，企圖獲得全長之 cDNA 序列，結果成 功的獲得綠豆 SBE 異構型 II (
VrsbeII)
與異構型 I (VrsbeI)
之全長 cDNA，分述如下。2.1 選殖 VrsbeII cDNA
2.1.1 RT-PCR
以純化過之綠豆 polyA mRNA 為模板，利用 F1 與 R1 引子 (表六) 進 行 RT-PCR 反應，經取產物 1/25 ( 2 μL) 作電泳分析與染色，發現得到 一段主要約 0.8 kb DNA 條紋，但是訊號很弱，不足夠直接純化後作定 序，因此將產物以 PCR-M
TM
Clean Up System 作純化，當作模板，再次 利用 F1 與 R1 引子，進行 PCR 放大；經取產物 1/25 ( 2 μL)作電泳分析 與染色，結果一共獲得三個大小不同的片段，分別約為 0.8 kb、0.35 kb 與 0.1 kb，其中因為 0.8 kb 大小的片段 (圖九) 與最初 RT-PCR 得到的主 要產物大小相同 (序列代號 VrsbeII- 0.8)，因此切出並純化送定序，經 過與資料庫比對後，發現與 sbeII 最為相似，而且獲得為中間的部分；隨即根據 VrsbeII-0.8 的 3’及 5’端序列，設計出 3’RACE 和 5’RACE 所 需的引子，分別為 F2 及 R5, R6。
此外， 經過第一階段獲得的這段 VrsbeII- 0.8 cDNA，也以 TA cloning
方式放入 pGEM-T Easy vector 中，並轉形到 JM110 及 DH5α宿主。接 著，利用小量菌液培養、抽取質體 DNA，並以 EcoRI 將接入載體上之 DNA 切出，跑膠確認其大小 (圖十三)，且進一步切出、純化、送定序 確認後，便成為永久保存的部分 cDNA 株系 (partial cDNA clone；命名 為 VrsbeIIp- 0.8)。
2.1.2 3’RACE
以純化的 polyA mRNA 為模板，利用 3’-CDS primer A 引子合成第 一股 cDNA，並在 3’端的部分接上一段 DNA adapter 進行第二階段的 3’
RACE 反應。 結果雖然使用專一性 DNA adapter 之引子 (套組專用引子 UPM，為反股) 及 F1 進行 RACE PCR 反應，經取產物 1/25 ( 2 μL) 作 電泳分析與染色，並未得到單一產物 (smear)；因此，接續以 TE buffer 稀釋 50 倍後之 3’RACE 產物為模板，利用 F2 及 NUP (套組專用引子，
當作反股) 為引子進行 nested PCR，結果得到約 1.2 kb 及 0.8 kb 大小的 兩個片段 (圖十)，分別自膠體切出並純化後，經定序比對，發現此 0.8 kb 片段是屬於 1.2 kb 片段之內部序列，同時此 1.2 kb 片段 (序列代號 VrsbeII-1.2) 與前述之 VrsbeII- 0.8 有 307 bp 的重複區域 (overlap
region)，因此，得以將該 1.2 kb 此片段序列與 VrsbeII-0.8 組合並連接成 靠 3’端的一段約 1.7 kb 之 VrsbeII cDNA。
2.1.3 5’RACE
以純化的 polyA mRNA 為模板，5’-CDS primer 及 SMART II A
oligonucleotide 為引子合成第一股 cDNA，並在 5’端的部分接上一段 DNA adapter。 使用專一性 DNA adapter 之引子 (套組專用引子 UPM，為正 股) 分別與 R5, R6 進行 RACE PCR 反應，結果不是沒有產物，就是沒 有單一性產物 (smear)，推測可能原因為 5’RACE 的產物過大 (預期約 1.5 kb 左右)，Chenchik et al. (1996) 的報告中指出 RACE 的產物若大於 1-1.5 kb 成功率就會偏低。
幸而，3’RACE 獲得之 1.2 kb 序列 (VrsbeII-1.2)與 VrsbeII-0.8 組合成 的 1.7 kb，經比對發現與菜豆 (kidney bean; Phaseolus vulgaris) 的相似度 最高，因此參考菜豆澱粉分支酶 pvsbeII (Hamada et al., 2001) 之 5’端起 始序列，設計 5’端引子- F6 與 R5 (表六) 進行 RT-PCR，終於成功獲得 包含轉錄起始位置之 1.3 kb 左右的 5’端片段 (圖十一，序列代號
VrsbeII-1.3)，經定序比對後，確定為 sbeII，且與 VrsbeII-0.8 有 125 bp 的重複區域，故將此片段與 VrsbeII-0.8 左端序列連接，並和 VrsbeII-1.2 組合成假想之綠豆 SBEII 的 cDNA 全長 (
VrsbeII)
，如以下示意圖。此外，當再度由 VrsbeII-1.3 設計更靠近 5’端的引子，R18 及 R19，
進行 RACE PCR 反應 (預期大小僅約 200-250 bp)，卻仍無法得到轉譯起 始位置的上游片段。
2.2 選殖 VrsbeI cDNA
2.2.1 RT-PCR
由於前述所獲得之 VrsbeII 序列比對結果與菜豆及豌豆的相似度高，
因此將菜豆 pvsbeI (Hamada et al., 2001) 及豌豆 pea sbeII (Burton et al., 1995) cDNA 序列，並排比對找出高保留性的區域，設計合適的引子 F9, F10, R13 及 R17 引子 (表七)，試圖進一步選殖出另一個 SBE 異構型之 cDNA。
以純化過之 polyA mRNA 為模板，利用 F9 與 R13 和 F10 與 R17 二 組引子對 (表七) 進行 RT-PCR 反應，分別獲得 0.82 kb (圖十六，序列代 號 VrsbeI -0.82) 及 0.72 kb (圖十七，序列代號 VrsbeI-0.72) 大小的片 段，經定序比對後，發現 VrsbeI -0.82 屬於前段，且包含轉錄起始位置，
而 VrsbeI -0.72 屬於後段序列；因此，分別根據 VrsbeI -0.82 設計出引子 F11，根據 VrsbeI -0.72 設計出引子 R16。接著，以 F11 及 R16 為引子進 行 RT-PCR 反應，成功獲得 1.2 kb 大小的片段 (圖十八，序列代號 VrsbeI-1.2)，經定序比對，發現 VrsbeI -0.82 與 VrsbeI-1.2 片段間有 142 bp
的重複，而 VrsbeI-1.2 及 VrsbeI-0.72 的片段間有 124 bp 的重複，故將 此三片段連接組合成假想之綠豆 SBEI 的 cDNA 全長，如以下示意圖。
2.2.2 5’RACE
選殖過程中，很幸運的已由 RT-PCR 獲得轉譯起始位置的序列 (VrsbeI -0.82)，因此由此段序列設計 5’端的引子，R14 及 R15 (表七)，與 專一性 DNA adapter 之引子 (套組專用引子 UPM，為正股)，進行 RACE PCR 反應 (預期大小僅約 100-150 bp)，但仍無法得到轉譯起始位置的上 游片段。
因此，經由與已知的 SBEI 及 SBEII cDNA 比對，本論文所獲之
VrsbeII 的 5’
端上游部分似乎尚缺約 200 bp 序列，而 VrsbeI 似乎尚缺約 60 bp。 推測 5’端部分的序列可能為 GC-rich 區域，因此在 cDNA 選殖 過程中，不易得到 5’端完整序列。雖曾於 PCR 反應物中添加 GC-rich solution (5% glycerol or DMSO；Wang and Young, 2003)，以增加 PCR yield 及 specificity，仍無法獲得產物。2.3 VrsbI 與 VrsbII 全長 cDNA 序列確認
VrsbeI-1.2
VrsbeI-0.82 VrsbeI-0.72
142 bp overlap 124 bp overlap
為了確認上述反應獲得 cDNA 片段之連接全長序列為實際之 cDNA 產物，並且確認 VrsbeII 與 VrsbeI 是分別來自於不同轉錄出的 mRNA transcript 族群，因此針對所得到的 VrsbeII 與 VrsbeI cDNA 全長序列之 5’
及 3’端各設計一對引子 F6、R9 與 F 9、R21 (表六、七)，對純化的 polyA mRNA 進行 RT-PCR。結果顯示分別獲得 2.5 kb (圖十二) 及 2.2 kb (圖十 九) 大小的產物，經自膠體切下、純化、定序比對後，證實上述所獲得 之 VrsbeII 與 VrsbeI cDNA 片段，是分別屬於不同 mRNA transcript 族群，
兩條 cDNA 將可以進一步以 TA cloning 方式殖入載體中進行株系保存。