第二章 材料與方法
第四節 DNA 片段的製備與純化
以得到的 PolyA mRNA 為模板，利用不同的引子對進行下列步驟：
4.1 反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應
(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)
【試劑】
1. SuperScript
TM
One-Step RT-PCR Systems (Invitrogen, Cat. 10928 -042) 2. SBE 特異性引子 (10 μM)3. 0.1% DEPC-treated 水
【步驟】
於 0.2 mL 離心管中依序加入 25 μL 2X Reaction Mix (0.4 mM dNTP、2.4 mM MgSO
4
)、10 pg-1μg polyA mRNA、10 μM 的 sense 及 antisense primer 各 1μL及 1 μL RT/Platinum Taq Mix，最後加水至 50 μL 混合均勻。進行 RT-PCR 的反應程式設定為：(1) cDNA synthesis and pre-denaturation：45℃30min、94℃ min。(2) PCR amplify -cation：2 94 ℃ 15 s (變性)、60 ℃ 30 s (煉合)、72 ℃ 1-3 min (延伸)，重複 35 次 循環。(3) Final extension：72 ℃ 10 min。反應完成後，取 2-5 μL產物 跑電泳確認。【備註】
1. 煉合溫度由引子的 Tm 值決定，一般約低於 primer Tm 的 5-10 ℃。
2. 延伸時間為 1 min/1 Kb，由欲放大的 DNA 長度決定。
3. 當 target DNA 濃度較低時，增加 PCR amplification 的 cycles 數。
4.2 聚合酶鏈鎖反應 ( polymerase chain reaction, PCR)
【
試劑】1. FastStart Taq DNA Polymerase (250 U ﹔Roche) 2. 10 X PCR buffer
3. dNTP: dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP (10 mM ﹔ABgene) 4. SBE 特異性引子(10 μM)
【步驟】
於 0.2 mL 離心管中依序加入 5 μL 10x PCR buffer、10 mM dNTP 各 1 μL、10 μM 的 sense 及 antisense primer 各 3 μL及 0.4 μL FastStartTaq DNA Polymerase ( 250 U)，混合均勻後再加入 Template DNA
(>500ng/
reaction)
，最後加無菌水至總體積為50 μL。進行 PCR 反應，條件為：(1) 95 ℃ 3 min。(2) 95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1-3 min，重複 35 次。(3) 72℃ 10 min。取 2-5 μL反應產物跑電泳確認。
【備註】
鎂離子最後濃度為 2 mM (一般建議為 1.5- 4 mM) 4.3 快速放大 cDNA 末端序列
(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)
【試劑】
Smart
TM
RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Cat.K1811-1)TE buffer﹕10 mM Tris-HCl、1 mM Na-EDTA
Tricine-EDTA buffer ：10 mM Tricine-KOH (pH8.5)、1 mM EDTA
【步驟】5’RACE 1.合成第一股 cDNA
取 1-3 μL(50 ng-1 μg)polyA mRNA加入 1 μL 5’CDS primer及 1 μL Smart II A oligo，加滅菌水至總體積為 5μL。於 70 ℃加熱 2 分鐘後，
置於冰浴 2 分鐘，再加入 Mix reaction (2 μL 5X first-strand buffer、1μL 20 mM DTT、1μL10 mM dNTP Mix、1 μL PowerScriptreversetranscriptase ( 200 U))，總體積為 10 μL。離心混合均勻，於 42 ℃下反應 1.5 小時，
以 100-250 μL Tricine-EDTA buffer (kit 附的) 稀釋，於 72 ℃反應 7 分鐘 後，離心數秒即可。測量其吸光值後，保存於 -20 ℃。
2.進行 RACE PCR
取 2.5 μL合成之第一股 cDNA，加入 5 μL 10X UniversalPrimerA Mix (UPM) 及 1 μL antisense (reverse) primer 後，混合均勻，再加入 Mix reaction (43.6 μL 滅菌水、5 μL 10X PCR buffer、1 μL dNTP Mix (10 mM)、0.4 μL Taq DNA Polymerase( 250 U))，總體積為 50 μL。進行 PCR 反應，條件為：94 ℃ 5 s、68 ℃ 10 s、72 ℃ 3 min，重複 25-35 次。取 2-5μL反應產物跑電泳確認。
圖四、5’-RACE 反應的機制
Fig. 4 Detailed mechanism of the 5'-RACE reactions.
3. Nested PCR 反應
當 primary RACE PCR 獲得的產物為 smear 現象時，利用 TE buffer 將 產物稀釋 50-100 倍作為模板，由已知的序列片段設計趨向 5’端的基因 特異性引子(GSP)，配合套組之 NUP (Nested Universal Primer A)，再次 進行 RACE PCR。取 2-5 μL反應產物跑電泳確認。
【步驟】 3’RACE：
1.合成第一股 cDNA
取 1-3 μL (50 ng-1 μg )polyA mRNA加入 1 μL 3’CDS primerA後，加滅 菌水至總體積為5 μL。於 70 ℃加熱 2 分鐘後，置於冰浴 2 分鐘，再加 入 Mix reaction (2 μL 5X first-strand buffer、1μL 20 mM DTT、1 μL 10 mM dNTP Mix、1μL PowerScriptreversetranscriptase)，總體積為 10 μL。離心混合均勻，42 ℃下反應 1.5 小時，以 100-250 μL Tricine-EDTA buffer 稀釋，於 72 ℃反應 7 分鐘後，離心數秒即可。測量其吸光值後，
保存於 -20 ℃。
2.進行 RACE PCR
取2.5 μL合成之第一股 cDNA，加入 5 μL 10X Universal Primer A Mix (UPM) 及 1 μL sence(forward)primer後，混合均勻，再加入 Mix reaction (34.5 μL 滅菌水、5 μL 10X PCR buffer、1 μL dNTP Mix (10 mM)、1μL Taq DNA Polymerase)，總體積為50 μL。進行 PCR 反應，
條件為：94 ℃ 5 s、68 ℃ 10 s、72 ℃ 3 min，重複 25-35 次。取 2-5 μL 跑電泳確認。
圖五、3’RACE反應的機制
Fig. 5 Detailed mechanism of the 3'-RACE reactions.
3.Nested PCR 反應
當 primary RACE PCR 獲得的產物為 smear 現象時，利用 TE buffer 將 產物稀釋 50-100 倍作為模板，由已知的序列片段設計趨向 3’端的基因 特異性引子(GSP)配合套組之 NUP (Nested Universal Primer A)，再次進 行 RACE PCR。取 2-5 μL反應產物跑電泳確認。
4.4 DNA 片段之純化方法
1. Ultrafree-DA (Millpore Cat. 4260 Bedford, USA) 2. PCR-M
TM
Clean Up System (Viogene Cat. PF1001) 3. Gel Extraction (Viogene Cat. EG1001)【方法】離心均為室溫操作
當得到的產物為單一條紋時，直接以 PCR-M™ Clean Up System 進行純化；若得到的產物有二條以上條紋時，先跑電泳，切下目標 產物再以 Ultrafree-DA 或 Gel Extraction 進行純化。
1.以 Modified TAE buffer (40 mM Tris-acetate、pH 8.0，0.1 mM Na- EDTA) 製膠。取適量樣品跑膠、EtBr 染色後，以 UV 確認，切下目標條紋放 入 column，5,000 xg 離心 10 分鐘，收集 Vial 中液體，測其吸光值並 取 2-5 μL跑膠確認大小後，儲存於 -20 ℃。
2.取 10-100 μL PCR產物和 0.5 mL Px buffer 混合均勻，將 spin column 置 於 2 mL 微量離心管中，加入混合物 (每次勿超過 0.7 mL) 13,000 rpm 離心 1 分鐘，丟棄流出液，此時 DNA 片段已與 column 上之 membrane 結合。接著，加入 0.5 mL WF buffer，13,000 rpm 離心 1 分鐘後，丟棄 流出液，再加入 0.7 mL WS buffer，13,000 rpm 離心 4 分鐘後，將 spin column 置於新的 1.5 mL 離心管，再加入 30-50 μL的滅菌水，放置 1-2
分鐘，13,000 rpm 離心 2 分鐘，收集含有 DNA 之溶離液，此步驟重複 二次。測溶離液之吸光值及取 2-5 μL跑膠確認大小後，儲存於 -20 ℃。
3. 將 RT-PCR、PCR 或 RACE 產物跑 1%電泳分析確認後，切下目標片 段置於 1.5 mL 微量離心管中，每管膠體不可超過 300 mg。加入 0.5 mL gel solubilization buffer (GEX)，於 60 ℃水浴中作用 10-20 分鐘，至膠 體完全溶解，冷卻至室溫。將 spin column 置於 2 mL 微量離心管中，
加入溶解的膠體 (每次勿超過 0.7 mL)，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，丟 棄流出液，此時 DNA 片段已與 column 上之 membrane 結合。加入 0.5 mL WF buffer，13,000 rpm 離心 1 分鐘後丟棄流出液，再加入 0.7 mL WS buffer，13,000 rpm 離心 30 秒後丟棄流出液，再以 13,000 rpm 離心 3 分鐘以完全去除殘留的 ethanol。將 spin column 置於新的 1.5 mL 離心 管，加入 30-50 μL的滅菌水，放置 2 分鐘， 13,000 rpm 離心 2 分鐘，
收集含有 DNA 之溶離液，測其吸光值及跑膠確認大小後，儲存於 -20
℃。