緒論

第一章 緒論

1-1 一氧化氮在生物體之重要性

一氧化氮(nitric oxide, NO)在 1980 年以前，被視為一種空氣汙染 物，不僅會破壞臭氧層、並且會轉化成硝酸而導致酸雨。然而在 1980 年之後，研究學者發現內皮細胞釋放一種內皮放鬆因子(endothelium- derived relaxing factor, EDRF) ¹，使得血管平滑肌放鬆、血管擴張。之 後，科學家證實 EDRF 即是一氧化氮，具有調控如此重要的細胞功能

2。此重大發現讓科學家開始對一氧化氮逐漸重視，並且投入大量研 究，近年也發現一氧化氮參與了很多生理及病理過程，可以使血管擴 張、抑制血小板的凝聚、抑制平滑肌細胞的增生、調節細胞凋亡、亦 是神經傳導物質之一³。

生物體內一 氧化氮的生成是 由一氧化氮合成 酶 (Nitric Oxide Synthases, NOS)，在 NADPH 及氧氣存在下，可將 ^L-arginine 催化成

L-citrulline，並釋放一氧化氮，其反應如下圖^{4, 5}。

圖 1-1 一氧化氮合成酶催化機制

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依一氧化氮合成酶(NOS)的功能，可分為 nNOS、iNOS、eNOS 這三 種不同的異構物：(1)神經細胞一氧化氮合成酶(neuronal NOS, nNOS)，

位於神經突觸細胞及骨骼肌等，一氧化氮可作為神經傳遞因子，與記 憶形成及學習等有關；(2)誘導性一氧化氮合成酶(inducible NOS, iNOS)，位於巨噬細胞中或平滑肌細胞中，當有外來病原體入侵時，

會釋放出大量 NO 來殺死病原體，與免疫系統反應有關，也可促進膠 原合成及血管生成；(3)內皮細胞一氧化氮合成酶(endothelial NOS, eNOS)，存在於血管內皮細胞中和其他組織中，與血管舒張有關 ^4,

6,39。

1-2

一氧化氮在生物體內的儲存及運輸方式

一氧化氮為一自由基分子，半衰期極短，大約只有 7 秒鐘 ⁷。若 直接暴露於生物體內，容易與體內的氧氣或超氧化物(O2−

)反應，形成 N2O 和 OONO⁻ (peroxynitrite) ⁸，這些物質則會導致細胞凋亡、癌症

表 1-1 一氧化氮合成酶之三種型態與生理作用⁶

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等疾病。因此目前認為 NO 在生物體中無法單獨以自由基方式存在。

近年來，發現生物體內之 NO 是以兩種形式儲存及傳遞，分別是 S-nitrosothiols (RSNO) ⁹，和 Dinitrosyl iron complexes (DNICs) ¹⁰。針 對 RSNO 及 DNICs 的介紹如下：

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總和¹²。

另外 dimeric DNICs，在結構中具有兩個{Fe(NO)2}核心，稱作 RREs (Roussin’s Red Esters)，具有逆磁性特性，故無 EPR 訊號。

DNICs 在生物體中作用的形式又可依分子量，區分為兩類：

(1) Protein-bound DNICs (2) Low molecular weight DNICs (LMW DNICs)。通常 LMW DNICs 較 protein-bound DNICs 更不穩定，容易 釋放出 NO。一般認為 protein-bound DNICs 為 NO 儲存形式；

LMW-DNICs 為 NO 運輸形式。

根據文獻(圖 1-4)，得知 RSNO 可作為 NO donor，當與 Fe²⁺反應 時，RSNO 中 S–N 會先斷裂，生成SR 和NO，兩種自由基再進一步 與 Fe²⁺反應，形成 DNIC 與 RRE。其中 DNIC 與 RRE 可藉由過量的 RSNO、RSH 以及氧化反應，互相轉換 ¹³。藉由此結果得知，DNIC 存在體內之穩定性和環境中氧氣濃度、硫醇類濃度有極大的關係。另 外 DNICs 也可轉換回 RSNO (圖 1-4)。

圖 1-3 DNICs 與 RREs 之結構

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Protein-bound DNICs

一氧化氮具有高度反應性，容易與生物體內[Fe-S] cluster 之金屬 蛋白作用，將其降解成 protein-bound DNICs，並且在 EPR g~2.03 有 DNICs 的特徵吸收訊號，同時蛋白質活性被抑制。體內含鐵硫簇的蛋 白 質 包 括 ： 琥 珀 酸 脫 氫 酶 (succinate dehydrogenase) 、 固 氮 酵 素 (nitrogenase) 、琥珀酸-Q 還原酶 (succinate-Q reductase) 、粒線體烏 頭 酸 酶 (mitochondrial aconitase) 、 胞 質 順 烏 頭 酸 酶 (cytosolic aconitase) 、 高 電 位 鐵 硫 蛋 白 質 (HiPIP) 、 第 三 型 核 酸 內 切 酶 (endonuclease III)等 ¹⁴。

Cowan 教授將 Chromatium vinosum 光合細菌的高電位鐵硫蛋白 質(high-potential iron protein, HiPIP)分離並與 NO donor (diethylamine NONOate)反應，將產物藉由 EPR 觀測有 g~2.03 的特徵峰，得知含鐵 硫蛋白質被降解成 protein-bound DNICs。同時整個蛋白質也從折疊，

圖 1-4 RSNO 與 Fe²⁺形成 DNICs 與 RREs ¹²

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轉變成未摺疊狀態，導致鐵硫蛋白質功能喪失。所以 DNICs 可視為 保護細胞方式¹⁵。

大腸桿菌中的同型二聚體(homodimeric)蛋白 SoxR，被認為具防 禦之功能，擁有[2Fe-2S] cluster，是氧化還原敏感物質。當大腸桿菌 中有較多的一氧化氮時，[2Fe-2S] cluster 會被修飾，從 inactive form (Fe³⁺/Fe²⁺)轉變為 active form (Fe³⁺/Fe³⁺)。當 SoxR 被活化後，會使 SoxS 基因大量轉錄使得大量生成 SoxS 蛋白，而 SoxS 蛋白會再使 SoxRS 基因轉錄，所得之金屬蛋白質可消除一氧化氮¹⁶。

圖 1-5 HiPIP 與 NO 反應導致蛋白質降解過程¹⁵

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圖 1-6 大腸桿菌中 SoxR 與一氧化氮反應之過程¹⁶

生物體中不同種類之 protein-bound DNICs 的例子如下，其配位 環境分別由 S、N、O 所組成，並且在 EPR 上分別有特徵訊號(表 1-2)。

小分子 DNICs (Low molecular weight DNICs)

DNICs 的配位基可由氮，硫或氧所組成，分子量較蛋白質小。至 今，已有多種 LMW DNICs 被合成出來(圖 1-7)，依據配位基的不同，

表 1-2 生物中不同種類之 protein-bound DNICs 與 EPR

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使得{Fe(NO)2} core 有不同氧化態及 EPR 訊號。以下分別針對硫、氧、

氮的 DNICs 作介紹^11,17,18,19。

1. 配位基為 SR⁻，為典型且多數的 DNICs，其電子結構為{Fe(NO)2}⁹， 並具有特徵 EPR 訊號 g 值為 2.03。當典型的 DNICs 經過還原，會導 致兩個(SR⁻)橋接兩個{Fe(NO)2}⁹ 核心，形成[Fe(μ-SR)(NO)2]2 稱為 RRE，由於兩個核心的鐵離子會有 antiferromagnetic coupling 的現象，

故 EPR 上無訊號。以下面為例：

廖文峯教授在 2012 年文獻中(圖 1-8)，選用 t-butylthiol 配位基接 與 DNICs，得到[(S^tBu)2Fe(NO)2]⁻，其電子結構為{Fe(NO)2}⁹，藉由添 加 1 當量的 KC8還原，形成[PPN]2[Fe(μ-SR)(NO)2]，此 dianionic reduced RREs 電子結構為{Fe(NO)2}¹⁰{Fe(NO)2}¹⁰；添加 0.5 當量的還原劑，

圖 1-7 小分子雙亞硝基鐵錯合物

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則有[PPN]2[Fe(μ-SR)(NO)2]^–之形成，屬於{Fe(NO)2}¹⁰{Fe(NO)2}⁹ 的 reduced RREs 。 而 RREs 可 再 經 由 氧 化 劑 的 添 加 再 氧 化 回 [(S^tBu)2Fe(NO)2]。此結果顯示，生物體內[Fe-S]蛋白 nitrosylation 過程 中，{Fe(NO)2}¹⁰{Fe(NO)2}⁹ reduced RREs，{Fe(NO)2}¹⁰{Fe(NO)2}¹⁰ 是有機會存在²⁰。

2. 配位基為 OR⁻，電子結構為{Fe(NO)2}⁹，並具有特徵 EPR 訊號 g 值 為 2.03。其還原之結果與典型含硫的 DNICs 類似，兩個(OR⁻)橋接兩 個{Fe(NO)2}⁹ 核心，形成[Fe(μ-OR)(NO)2]2。由於兩個核心的鐵離子 會 antiferromagnetic coupling 的情形，故 EPR 上無訊號。以下面為例：

將以 phenolate 所形成之{Fe(NO)2}⁹ 的 DNICs(圖 1-9) ²⁰，選用 KC8還 原，電子結構會轉變成{Fe(NO)2}¹⁰{Fe(NO)2}¹⁰ 的 RSSR，形成兩個 Fe(NO)2 core。又在 DNIC 或 RSSR 添加 t-butylthiol，此時因為 SR⁻

圖 1-8 含硫之 DNICs 與 RREs 之間的轉換²⁰

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電子貢獻能力較 OR⁻來的強，並且為較 soft donor 配位基，因此硫基 團會容易取代氧基團，形成更穩定的 DNICs。

1-3 含氮之 DNICs

文獻上，以氮(NR)為配位基通常較少見，其電子結構為中性 {Fe(NO)2}¹⁰，EPR 上沒有訊號。若是為 NR⁻之配位基形成的 DNICs，

則電子結構為{Fe(NO)2}⁹，並具有特徵 EPR 訊號 g 值為 2.03。以下 面為例：

文獻上(圖 1-10)，Lippard 教授選用 β-diketiminate 配位基，以 Li 將 配 位 基 還 原 後 ， 與 [PPN][FeI2(NO)2] 起 始 物 反 應 ， 得 到 [(Ar-nacnac)Fe(NO)2]的產物，與起始物同為{Fe(NO)2}⁹之電子組態。

以 Cp*2Co 可將此 DNIC 還原，得到{Fe(NO)2}¹⁰ 組態的[TBA][(Ar- nacnac)Fe(NO)2]。[TBA][(Ar-nacnac)Fe(NO)2]在空氣下會發生單電子

圖 1-9 含氧之 DNICs 與 RREs 之轉換²⁰

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氧化，恢復成較穩定的[(Ar-nacnac)Fe(NO)2]。為了探討兩錯合物 NO 轉 移 的 過 程 ， 利 用 [Fe^II(TPP)Cl] 作 為 NO 接 受 者 。 結 果 顯 示 [(Ar-nacnac)Fe(NO)2] 在 升 溫 或 光 照 的 條 件 下 ， 會 進 行 交 換 生 成 [Fe^II(NO)TPP]及氯離子配位的 MNIC；而[TBA][(Ar-nacnac)Fe(NO)2] 在反應中會先進行電子轉移，再發生上述 NO 的交換。由上述結果可 知，DNIC 核心電子密度較多時，容易直接進行電子轉移，優先於 NO 的轉移²¹。

廖文峯教授在低溫下合成出六配位的 neutral {Fe(NO)2}⁹錯合物 (圖 1-11)，[(1-MeIm)2(η²-ONO)Fe(NO)2] (1-MeIm = 1-methylimidazole)，

並在 EPR 上有觀測 g = 2.013 有訊號產生，有別以往四配位 DNICs，

g 值為 2.03。藉由變溫實驗，發現六配位 DNIC 會轉換成四配位之 [(HIm)(ONO)Fe(NO)2] (HIm = limidazole)，而且彼此之間會相互轉換。

再經由 X-ray 繞射分析以及 EPR 證實²²。由結果顯示六配位之 DNICs 有機會存在於生物體內，但因熱力學不穩定，會迅速轉變成四配位 DNICs，因此通常只能捕捉四配位 DNICs。

圖 1-10 [(Ar-nacnac)Fe(NO)2]之還原機制²¹

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Kim 教授在 2012 年文獻 ²³，選用廖文峯教授所開發 neutral {Fe(NO)2}¹⁰ 的 (TMEDA)Fe(NO)2 (TMEDA = N,N,N’,N’-tetramethyl- ethyleneduamune)，其配位基為兩個 N donor。並且在−80 ºC 下與氧氣 反應，由 UV 光譜中 560 (580)、460 (420) nm 有新訊號生成，另外紅 外線吸收光圖譜中 NO 訊號，由灌入氧氣前 1630、1687 cm⁻¹，轉變 為 1589、1805 cm⁻¹。其中 1589 cm⁻¹與文獻上過氧化亞硝酸根陰離子 中 N=O 訊號類似(圖 1-12)。

再經由 EXAFS 推估中心鐵為五配位(圖 1-13)，為過氧化亞硝酸 錯合物 [(TMEDA)Fe(NO)(ONOO)]形成。接著利用生物體中過氧化亞

圖 1-11 六配位與四配位 DNICs 之轉換²²

圖 1-12 (TMEDA)Fe(NO)2灌入 O2之 UV 及 IR ²³

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硝酸根陰離子將酪胺酸蛋白質硝酸化的概念，添加類似酪胺酸蛋白質 結構的 2,4-二第三丁基酚(2,4-tret-butylphenol, DBP)，藉由 GC 偵測硝 化後的產物(56%)，證實的確有過氧化亞硝酸根陰離子中間產物的生 成(圖 1-14)。此項結果發現，DNICs 在生物體內不僅單作為 NO 的儲 存及傳遞，另外在氧氣存在下形成過氧化亞硝酸根陰離子，可能在生 物體中扮演其他生理上的功能，更值得去探討。

圖 1-13 (TMEDA)Fe(NO)2灌入 O2之 EXAFS ²³

圖 1-14 (TMEDA)Fe(NO)2灌入 O2後將 phenol nitration ²³

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1-4 過氧化亞硝酸根陰離子(peroxynitrite, ONOO

⁻

)

當一氧化氮與超氧陰離子(superoxide anion, O2−

)接觸，會很快速 結合形成具有強氧化能力的 ONOO^{− 24}。

ONOO⁻為極不穩定的高反應性含氧物種，活性大於 O2−和 NO，

因此對生物體所造成之傷害更為嚴重。ONOO⁻半衰期為一秒鐘，因 此可以擴散數個毫米，甚至通過細胞膜，和巨大生物分子反應，造成 脂質、蛋白質、DNA 之傷害 ²⁵。例如：攻擊粒線體電子傳遞，造成 DNA 與酵素損害，破壞細胞膜完整性，與細胞凋亡(apoptosis) ²⁶。另 外 ONOO⁻有較高之 PK 值，一旦和酸結合後會釋出OH 和NO2。OH 會造成脂質氧化，胺基酸殘基發生芳香環的羥基化(hydroxylation)

27。

ONOO⁻可直接與硫醇反應，產生硫醇的二聚物。而且在過渡金 屬的催化下，可對芳香族進行硝基化反應(圖 1-16)。研究報告指出

圖 1-15 過氧化亞硝酸根陰離子之生成

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ONOO⁻對酪胺酸(tyrosine)進行硝化的反應，會對生理組織造成傷害，

如動脈粥樣硬化病變(atherosclerosis lesion)，可由偵測體內 3-硝基酪 胺酸的含量來判斷，因此被當為生物指標(biomarker) ⁴⁰。

圖 1-16 酪胺酸硝基化^{27, 28}

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在文檔中 二席夫鹼雙亞硝基鐵錯合物之鑑定及其反應性 (頁 13-28)