第一章 緒論 曲線，如 Figure 39.，由直線斜率求出活化能 Ea。經計算 PAL 1 活化能為 9.3 kcal/mol，PAL 2活化能約為10.1 kcal/mol，較低於綠竹不同部位PAL之活化能 分別為，竹葉：13.9 kcal/mol，筍殼：11.8 kcal/mol（謝, 2003）竹筍：15.6 kcal/mol， 可推定在相同溫度下，表現蛋白質PAL催化L-Phe 的脫氨反應速率較綠竹不同 部位的PAL快。
3.11.4 熱安定性
在許多研究中都曾發現PAL具有良好的熱耐受性之Kim et al., 1996; Kalghatgi et al., 1975），為測試綠竹的表現蛋白PAL是否也具此特性，分別將PAL 1 與PAL2 分裝置於50℃、60℃ 及 70℃ 等不同溫度下，處理10 ~60分鐘後取出，再加入 基質液於37℃反應10 分鐘，來觀察PAL 酵素對熱的安定性。結果由 Figure 40.
A 可看出表現蛋白質 PAL 1 在 50℃ 處理一小時後能維持 50% 以上的活性，
60℃下處理 20 分鐘，活性還可以維持50%，但在70℃ 下處理10 分鐘後，PAL 1 活性就只剩 1%；而由 Figure 40. B 可看出表現蛋白質 PAL 2 在 50℃ 與 60℃處理一小時後，活性仍維持50%，但在70℃ 下處理20 分鐘後，PAL 活性 就只剩3%；由上述結果顯示出，綠竹筍表現蛋白質PAL在溫度大於70℃ 時會 即易失去對熱的耐受性。
3.11.5 反應最適 pH 值
將適量酵素加入以廣用緩衝劑配置 pH 3-11 的反應基質液中，觀察表現融合蛋
白質 PAL 1 與PAL 2 於各pH 值下活性的表現，以活性最高者當基準，計算相
對比例。由 Figure 41. 得知，PAL 1 與PAL 2 皆在pH 8.0 時反應活性最高，pH 9.0 時次之，在 pH 值小於6 的環境下，表現蛋白質PAL 反應活性不到50%。而 比較不同物種與綠竹不同部位的PAL的最適 pH 值可發現，PAL在鹼性反應環境 下(pH 8.5-10) 都有較高的活性，因此在PAL活性測定方法中，緩衝液之pH値多 在8.5-9.0 之間。
3.11.6 Km 值
由於PAL為單一基質的催化酵素，因此只要將基質液L-phenylalanine 配成不同
濃度 (0.2 mM ~ 1.2 mM)，加入酵素液反應得不同反應速率，做出基質飽和曲線
與雙倒數圖，即可利用雙倒數所得迴歸曲線的斜率與截距求得 Km 值。由 Figure 42.計算得 PAL 1 的Km 為200 µM，而由 Figure 43.計算 PAL 2 的Km
為250 µM，比較綠竹各部位PAL之Km 値，發現兩個表現蛋白質的Km值皆小於
綠竹各部位PAL的Km值，顯示經大腸桿菌表現的重組蛋白質PAL對於基質L- phenylalanine 的親合力大於綠竹各部位的PAL。
第一章 緒論
3.11.7 金屬離子影響
藉由在基質液中分別加入不同濃度之1A 與2 A 族的金屬離子（K+、Ca2+、 Mg2+）與過渡金屬離子Fe2+、Mn2+、Hg2+、Ni2+）之再以適當酵素反應，由酵素 活性的變化來探討金屬離子對PAL活性的影響。K+ 與Mg2+ 對PAL 1 與 PAL 2 的影響不大，兩者活性皆能維持在 80%，但是Ca2+ 只要5 mM，就對PAL 1與
PAL 2造成顯著的抑制現象，使活性劇降至60% 以下，且隨濃度上升，活性也
愈趨下降至40%；在綠竹中，Ca2+ 對綠竹筍PAL (蘇, 2003)與筍殼(謝, 2003)也有 類似的抑制情形，但在已發表之文獻中多數物種之 PAL 受二價離子的抑制程度 較小。
由表三的結果可發現，過渡金屬Fe2+、Mn2+、Hg2+、Ni2+ 隨著濃度的增加對 PAL 1 活性的抑制現象愈顯著，其抑制程度為 Ni2+< Fe2+＜Mn2+＜Hg2+，以 Hg2+ 離 子抑制效果最強，濃度在0.5 mM 時，PAL 1 的活性就被抑制約之0%，亦即活 性只剩 30%；Hg2+ 對其他物種PAL 的活性影響也有相似情形，Ustilago maydis 之PAL 在 Hg2+ 濃度0.5 mM時活性完全被抑制，而向日葵中PAL 受Hg2+ 的抑 制效果較低。
而由表四的結果來看，PAL 2 受過渡金屬的抑制現象與PAL 1 相似，以Hg2+
離子抑制能力最大，在更微量的濃度0.1 mM 即可抑制PAL 2 近五成活性，但 值得注意的是，Ni2+ 在0.1 mM 與0.5 mM時，似乎可稍微促進PAL 2 的催化反 應，使其活性稍稍增加，但在PAL 1 中並沒有發現此現象。
3.11.8 二級代謝物對活性的影響
在反應基質液中分別加入二次代謝產物與結構相似物，用以探討二級代謝物對 PAL 活性是否具有回饋抑制現象；由於PAL 活性偵測是以A290來測定，而所加 入的代謝衍生物多帶有苯環與共軛雙鍵，因此，在290 nm下也會有若干吸光値，
若濃度過高時其吸光值會超過分光光度計所能偵測的上限，因此不能使用太高的 濃度。由 Table 15. 看出PAL的產物 trans-cinnamic acid 會對 PAL 造成回饋抑 制，當 trans- cinnamic acid 濃度達 100 µM 時 ，PAL 活性只剩下 70%， trans-cinnamic acid 的回饋抑制現象在許多物種中都曾被報告（Sarma et al., 1998;
Kim et al., 1996。曾有文獻報導禾本科植物 PAL 具有 TAL 的活性，可催化 tyrosine 經脫氨反應後可產生 p-coumaric acid，因此選用分子式相同的異構物 o-、m-、p-coumaric acid 探討其對 PAL 影響上，可發現當 p- coumaric acid 濃 度增加到 100 µM 時，PAL 1活性只剩下 60%，對 PAL 1的抑制現象最為顯著，
而其異構物 o-、m- coumaric acid 對 PAL 的抑制作用就沒有這麼明顯；caffeic acid 與 ferulic acid 只會稍微抑制 PAL 1 活性 ，但是值得注意的是 tannic acid 在極低濃度（0.001%，0.0125%）就會很顯著地抑制 PAL 活性，這種情形同樣 也在綠竹不同部位之 PAL 出現 (謝，2003；蘇，2003)。
第一章 緒論 由 Table 15. 可看出產物 trans-cinnamic acid 會對 PAL 2 造成回饋抑制，
當trans-cinnamic acid 濃度100 µM 時，PAL 2 活性只剩下 70%。當 p-coumaric acid濃度增加到 100 µM 時，PAL 活性只剩下 30 %，其抑制現象較 PAL 1 顯 著，而其異構物 o-、m-coumaric acid 對 PAL 2 只有稍微抑制作用；caffeic acid 也會造成 PAL 活性明顯下降，但是效果較 p-coumaric acid 輕微；caffeic acid 與 ferulic acid 在隨著濃度增高，只會稍微抑制 PAL 2 活性 ；而 tannic acid 對
PAL 2 也是在極低濃度就可抑制 50% 的活性。綜合上述所得結果，二次代謝途
徑上的產物確實會對綠竹的表現蛋白質 PAL 造成抑制作用，使其活性下降，顯 見二級代謝中間產物確實有回饋抑制的現象。
3.11.9 化學修飾劑對活性影響
將常見的蛋白質化學修飾劑加入基質液中，加入適量酵素液，探討 PAL 活
性是否會被化學修飾而有所改變。由 Table 14. 可得知 抗氧化劑與硫醇基修飾化合物：
β-mercaptoethanol：對 PAL 1 與 PAL 2的抑制現象不明顯，在濃度 14.3 mM 下，兩者還保有 90 % 的活性，在低濃度時 (3.6 mM, 7.2 mM) 有促進 PAL 活 性之功用。
Dithiothreitol (DTT)：功能類似 β-mercaptoethanol，但 DTT 多了一個 -SH 與 –OH 基團，DTT 只有在較高濃度 9.5 mM，才會將表現蛋白質 PAL 活性抑 制至 60 % 以下，其抑制 PAL 活性的效果較 β-mercaptoethanol 強。有文獻指 出 ： cysteine 的 –SH 基 團 會 與 活 性 區 上 的 親 電 性 基 團 3,5-dihydro-5- methylidene - imidazol-4-one (MIO) 產生不可逆反應，造成 Histidine ammonia lyase 活性下降（Poppe et al., 2001。而 β-mercaptoethanol 與 DTT 這兩個藥劑 也都帶有 –SH 基團，因此可能也會去攻擊活性催化區 MIO 環造成 PAL 之活 性下降。由於 DTT 結構上較 β-mercaptoethanol 多一個 –SH 基團，因此對於 PAL 活性之影響大於β-mercaptoethanol。
Vinylpyridine（C7H7N）：可修飾 cysteine；由結果顯示vinylpyridine 在 0.25 mM下，就可將抑制掉 PAL 1 近五成的活性，而 PAL 2的活性只剩 31%。 Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)： 會對 serine 進行修飾。結果顯示在 9.5 mM PMSF濃度下，PAL 1 只剩 64% 活性，而 PAL 2 則剩下約 79 % 活性。
Diethylpyrocarbonate (DEPC)： 可修飾 histidine 及 tyrosine residues，造成 RNase 失活。在 9.5 mM DEPC濃度下，PAL 1 與 PAL 2 受 DEPC 修飾，兩者 約喪失近八成的活性。
由上述結果推測 serine、histidine、cysteine 及 tyrosine residues 在酵素催化 反應是不可或缺的。曾有文獻指出，將 PAL 活性區上的保守序列，進行定點突 變後，以酵素活性分析方式檢測各突變株的表現蛋白質，可發現突變株 (Y110F)
第一章 緒論