緒論 次，再用 CI 萃取一次，回收水層。加入 1/10 體積之 3 M sodium acetate (pH 7.0) ，

第一章 緒論 次，再用 CI 萃取一次，回收水層。加入1/10 體積之3 M sodium acetate (pH 7.0)， 與 2 倍體積之酒精，於室溫下放置 30 分鐘，即可看到絲狀物出現，直接以 12,000 rpm 離心分鐘，沈澱再以70% 酒精清洗，乾燥後，回溶於40~50 mL 無 菌水中，置於 -20℃ 保存。

2.14 大腸桿菌之表現載體

PAL 1/pBluescript SK(-)、PAL 2/pBluescript SK(-)：為本實驗室保存綠竹 PAL 1 與 PAL 2 基因全長序列所用的質體。pTrcHisA：為表現載體，其上具有 trc promotor 可表現接於其下游之外源基因，圖譜如圖 2.2 所示，為 invitrogen 公 司之產品。

圖 2.2、表現載體 pTrcHisA 之圖譜 Fig.2.2 Map of the pTrcHisA expression vector

表現載體 pTrcHisA 具有 trp (trp-lac) promoter與rrnB antiterminator，可提 高外來基因之表現，同時可以表現 lac repressor protein，當轉形菌株生長至 mid-log phase 時，添加適量的 IPTG 誘導表現外源基因；而在 open reading frame 前有 minicistron 序列，可以增加外源基因進行轉譯的效率；N 端有一段 (His)6-tag的序列有利所表現蛋白之純化工作，並且帶有 enterokinase (EK) cleave site 可以去除N 端融合約3 kDa 的片段。其宿主為大腸桿菌Top 10。

大腸桿菌

JM109：作為質體保存、增殖之宿主。

A

第一章 緒論

Top10：為表現載體 pTrcHisA 之宿主，用於大量表現重組蛋白之菌株。

上述菌株之基因型 (genotype) 表示如下：

菌株 基因型

JM109 e14-(McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rK- mK+) supE44 relA1 (lac-proAB) F’ traD36 proAB lacI^qZM15

Top10 F-, mcrA .(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ.M15 .lacX74 deoR recA1 araD139(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG

2.15 表現載體之建構

選用pTrcHisA載體系統(Invitrogene 公司之產品)作為苯丙胺酸脫氨裂解酶基 因的表現載體，於大腸桿菌Top10中表現。建構表現系統時，以帶有限制酶切位 (BamHI 與 EcoRI)的引子經聚合酶鏈鎖(polymerase chain reaction)反應產生大量 PAL 1 與 PAL 2 DNA 片段，接著以限制酶 BamHⅠ與EcoRⅠ分別處理表現載體 pTrcHisA、PAL 1 與 PAL 2 序列，再將處理過的PAL1與PAL2分別與處理過的表 現載體接和、轉形進入表現宿主大腸桿菌Top 10，最後以限制酶及定序分析所接 入的序列無誤後，再進行重組蛋白最佳誘導條件之探討

2.15.1.苯丙胺酸裂解酶基因接入表現載體

表現載體建構策略，設計四段分別包含BamHI 與EcoRI 限制酶切位的專一性引 子 (圖 2.3)，利用PCR反應增殖放大出的PAL 1 與PAL 2 全長片段，以BamHI 與 EcoRI 限制酶分別切割PAL1 、PAL2 及 pTrcHisA，再將處理過的DNA片段分別 接合(ligation)到pTrcHisA載體的His•Tag序列的下游，形成表現載體 pTrcHisA /PAL1 與 pTrcHisA /PAL 2，經誘導可產生在N 端具有連續6 個Histidine的 PAL 融合蛋白質。

For PAL1

BamHI EcoRI

第一章 緒論

P5 P6

5' CGC GGA TCC ATG CCG CGC GAG GAT3‘ 5' CCG GAA TTC GCA GAT GGG CAG TGG CTC 3'

For PAL2

P7 P8

5’ CGC GGA TCC ATG GAG TGC GAG AAT G 3’ 5’ CCG GAA TTC ATT AGT TGA TGG GCA 3’

圖 2.3 含有限制酶切位的專一性引子與 pTrcHisA 部分載體

2.15.2 聚合酶鏈鎖反應

聚 合 酶 鏈 鎖 反 應(polymerase chain reaction， 簡 稱 PCR)是 利 用 pfu DNA polymerase之耐高溫及PCR溫度控制器，在微量離心管中，將DNA template 高 溫加熱打開雙股螺旋後，兩個互補股末端接合上設計之primers，進行n 次之反 應就可得到 2ⁿ 倍之 DNA，於短時間內獲得大量欲增生之 DNA 片段。將離心 管置入 PCR 溫度控制器中進行聚合鏈鎖反應，其反應程式如下：聚合酶鏈鎖 反應完成後，將離心管移置4 ℃暫存或進行電泳分析。

30 cycle

95℃ 94℃ 61℃ 74℃ 74℃ 4℃

5分鐘 1分鐘 0.5分鐘 3.5分鐘 1分鐘 60分鐘

2.15.3 質體 DNA 之小量分離

取1.5 mL 菌液，加於微量離心管中，以6,000 rpm 離心2 min後，倒去上清，

以微量吸管頭儘可能吸去殘留液體。沉澱加入0.1 mL MP I (25 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA, pH 8.0; 50 mM glucose)，劇烈震盪，將沉澱完全打散。慢慢加 入 0.2 mL MP II (0.2 N NaOH; 1% SDS; 使用前以 10 N NaOH, 10% SDS 稀釋混 合配製)，蓋上管蓋後將管子反覆上下搖動，注意不可震盪！此時溶液應漸澄清 且黏度增加；將離心管置冰浴中。加入 0.15 mL MP III (3 M 醋酸鉀溶液，pH 5.2，置冰浴中)，混合均勻，亦不可劇烈震盪，置冰浴中 5 min。以12,000 rpm 離 心5 min。小心吸出上清至另一離心管，加入2 倍體積之純酒精 (或 0.6 倍體積 之isopropanol)，混合均勻，置室溫 2 min。以12,000 rpm 離心10 min。倒去上 清液，沉澱以70% 酒精洗二次，每次各離心 1 min。沉澱以SpeedVac 乾燥後，

以 30 µL TE-8.0 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA, pH 8.0)溶解。進行洋菜膠 體電泳，視色帶位置，檢測DNA片段大小是否正確。

2.15.4 DNA 片段之分離純化 A. Gel Extraction Kit (Viogene)

將PCR產物進行洋菜膠體電泳。將DNA片段以小刀自洋菜膠體割下。秤膠體 重量，並加入膠體三倍體積之Buffer GEX (100 mg 膠體視為100 µL)。置於50 ℃

BamHI

第一章 緒論