第三章 結果
第二節 聖多美分生檢驗…
1.檢體來源
檢體源自聖多美本島與普林西比島當地居民，包含：西元 2010 年聖多美瘧疾 鏡檢陽性病人 (Malaria cases) 28 人；西元 2011 年到 2013 年間，經鏡檢判定為低 寄生蟲血症 (Low-density parasitemia patients)，本文定義血液中寄生蟲數量對應等 級為 F1 和 F2 之病人，共計 377 人，與西元 2013 年因不明發燒 (Unknown febrile patients) 到醫院門診中心檢查的病人 605 人。此外在西元 2013 年普林西比島當地 居民全島篩檢 (Mass screening in Principe) 共 6,855 人中，選取所有鏡檢或快篩陽 性檢體與 100 支陰性檢體做為代表 (表 B)。
表 B 聖多美研究蒐集之檢體數量
Table B Numbers of samples which were collected from the DRSTP in this study 2010 2011 2012 2013 Total Malaria case
High–density parasitemia* 24 0 0 0
28 Low–density parasitemia** 4 0 0 0
Low–density parasitemia patient** 0 71 250 56 377 Unknown febrile patient 0 0 0 605 605 Mass screening in Principe 0 0 0 6,855 6,855
Total 28 71 250 7,516 7,865
*High–density parasitemia (F3~F10)
** Low–density parasitemia (F1~F2)
2.血片檢體收集與保存
被採檢者在進行傳統採血供鏡檢檢驗外，同時請採檢對象將手指血液滴於扇 形濾紙片 (Whatman® #903®) 上所畫圓圈之中，在蒐集好的血片外袋上標示被採檢 者的詳細資料與採檢日期，並將相關資料進行電子建檔。而血片以郵寄方式運至 臺灣後，暫時儲存於實驗室 4℃ 冰箱等待之後血片 DNA 萃取。本研究已通過聖多
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美相關衛生部門與臺大醫院倫理委員會審查。
3.血片 DNA 萃取
抽取血片 DNA 時依照採檢登記名單進行編號，利用 Genomic DNA Mini Kit (Geneaid) 進行血片 DNA 萃取。過程依循產品所附實驗流程，首先沿著血片周圍 去除多餘濾紙，將裁剪後的血片放入 1.5ml 微量離心管中，加入 500 µl 的 GT buffer 和 20 µl 的 Proteinase K，以乾浴槽維持在 60℃ 到 70℃ 之間加熱約 10 分鐘後進 行離心。之後加入 500 µl 的 GBT buffer 以乾浴槽於 60℃ 到 70℃之間加熱約 15 分鐘後離心，再加入 500 µl 乙醇 (99%)。組合產品所附 GD Column 與 2 ml 的 Collection Tube，抽取 700 µl 混合液置入 GD Column 以轉速 11,000 xg 離心 1 分鐘 後去除 Collection Tube 中的廢液，重複上述步驟直到混合液離心完畢。在 GD Column 上注入 400 µl 的 W1 Buffer 以轉速 11,000 xg 離心 1 分鐘後去除 Collection Tube 中的廢液，之後在 GD Column 中加入 600 µl 的 Wash Buffer 以轉速 11,000 xg 離心 1 分鐘後去除下方 Collection Tube 廢液，再以 11,000 xg 離心 3 分鐘。最後將 GD Column 置於乾淨且標籤完成的 1.5 ml 微量離心管上，加入 80 µl 已在 60℃預 熱的 Elution Buffer 後靜置 5 分鐘，再以轉速 11,000 xg 離心 3 分鐘，將萃取出的 DNA 放入-20℃ 冰箱中等待進一步的實驗分析。
4.巢式聚合酶鏈鎖反應 (Nested polymerase chain reaction; Nested PCR)
萃取出的 DNA 檢體將透過 Nested PCR 進行初步檢驗，Nested PCR 可減少過 程中非專一的結合進而提高實驗結果的可信度，使用引子對 (Primers Pairs) rPLU5 和 rPLU6 進行第一階段反應增幅，之後依據檢驗目標瘧原蟲種類，如：檢測惡性 瘧原蟲感染即會在第二階段利用 rFAL1 和 rFAL2 做為檢驗的引子對，針對間日瘧 原蟲、三日瘧原蟲與卵型瘧原蟲則分別使用 rVIV1/2、rMAL1/2、rOVA1/2 三組引 子對進行檢驗，詳細序列如表 C 所示 [39]。本研究對四年間所蒐集的檢體均進行 惡性瘧原蟲檢測，而普林西比篩檢中，鏡檢或快篩之陽性檢體與 100 支陰性代表 檢體，則同時檢驗目前四種最常見的瘧原蟲。
在兩階段的 PCR 中，每管檢體的反應液由 16.9 µl 的 DEPC 水、0.5 µl 的 10 mM
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dNTP Mix (dNTP Mix, Qiagen)、2.5 µl 的 10 倍 PCR Buffer、1 µl 50 mM MgCl2、0.1 µl Taq DNA polymerase (5 U/µl) (Platinum® Taq DNA Polymerse, Invitrogen)、各 1 µl 的 10 mM 引子對，以及 2 µl 的待測檢體組成，總體積為 25 µl。反應條件為：開始 步驟以 95℃ 預熱 5 分鐘，接續以 95℃ 使 DNA 變性 30 秒、56℃ 使引子對黏合 30 秒、72℃ 持續 60 秒使 DNA 進行延展，上述三步驟重複 35 個循環，最後維持 72℃ 作用 10 分鐘，使反應產物延伸完全，其中引子對 rFAL1/2 在 DNA 變性後以 60℃ 使引子對黏合 30 秒，而反應完成後產物將收藏在 4℃ 冰箱中進行保存。
Nested PCR 產物應以洋菜凝膠電泳 (Agarose Gel Electrophoresis; AGE) 觀察其結 果，首先以 0.5 倍的 TBE Buffer 配置出 2%洋菜凝膠，取 5 µl 的反應產物與 1 µl 的 6 倍 Loading Dye (EZ-Vision® Three, Amresco) 混合均勻注入凝膠的孔洞 (Well) 中，以 100V 電壓進行跑膠約 40 分鐘，結束後將凝膠片置於紫外燈下觀察與拍照 記錄。
5.定量即時聚合酶鏈鎖反應 (Quantitative real time polymerase chain reaction;
Q-PCR/real-time PCR)
在 Q-PCR 是利用反應過程中透過螢光染劑偵測與定量檢體內含產物總量。實 驗先檢測檢體中Human β-globin DNA 含量作為內部對照組 (Internal control) 以確 保萃取 DNA 濃度與之後目標產物濃度調整依據。使用引子對為 hbg F 和 hbg R，
其序列呈現於表 C [40] ，每管反應液體積共 20 µl，內含 6 µl 的 DEPC 水 (Diethypyrocarbonate treated water)、10 µl qPCR Master Mix (2X) Bio-red icyclerTM (KAPA SYBR® FAST qPCR Kit, KAPABIOSYSTEM)、10 mM 引子對各 1 µl 以及 2 µl 的待測檢體。Q-PCR 第一循環以 95℃ 預熱 15 分鐘，第二循環開始以 95℃ 15 秒使 DNA 變性、56℃ 使引子對黏合 20 秒、72℃ 持續 15 秒使 DNA 進行延展，
此循環共重複 40 次，第三循環為 95℃ 持續 2 分鐘，第四循環降至 68℃ 2 分鐘後，
再以每秒 0.5℃ 的速度上升至 90℃ 偵測其螢光值推測出熔化趨勢 (Melting curve) ，最後將反應完成後產物存放在 4℃ 冰箱中保存。根據儀器 MyiQ2 (Bio-rad) 偵測的 CT 值判定是否有成功由檢體萃取出 DNA。
由前置引子 PL1473F18 與反置引子 PL1679R18 檢測檢體，可推斷檢體是否感 染瘧原蟲，引子序列呈現於表 C。實驗中反應液體積共 20 µl，內含 6 µl 的 DEPC
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水、10 µl qPCR Master Mix (2X) Bio-red icyclerTM(KAPA SYBR® FAST qPCR Kit, KAPABIOSYSTEM)、10 mM 前置引子、反置引子各 1 µl 以及 2 µl 待測檢體。反 應第一循環以 95℃ 預熱 10 分鐘，第二循環開始以 95℃ 10 秒使 DNA 變性、50℃
使引子對黏合 5 秒、72℃ 持續 20 秒使 DNA 進行延展，此循環共重複 40 次，第 三循環為 95℃ 持續 2 分鐘，第四循環降至 68℃ 2 分鐘後，再以每秒 0.2℃ 的速 度上升至 90℃ 偵測其螢光值推測出熔化趨勢，最後將反應完成的產物存放在 4℃
冰箱中保存。除了由 MyiQ2 (Bio-rad) 儀器顯示之 CT 值推測檢體是否感染瘧原蟲 外，結果呈現之 Tm Peak 的位置對應溫度可用以判別檢體感染的瘧原蟲種類 [41]。
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表 C 巢式聚合酶鏈鎖反應與定量即時聚合酶鏈鎖反應之引子序列 Table C Primers for nested PCR and Q-PCR
Primer Sequence(5’→3’) Size
(bp) Ref Nested PCR
rPLU5 CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC
1,200
[39]
rPLU6 TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG
rFAL1 TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT
205 rFAL2 ACACAATGCACTCAATCATGACTACCCGTC
rVIV1 CGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC
120 rVIV2 ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCTTA
rMAL1 ATAACATAGTTGTACGTTAAGAATAACCGC
144 rMAL2 AAAATTCCCATGCATAAAAAATTATACAAA
rOVA1 ATCTCTTTTGCTATTTTTTAGTATTGGAGA
800 rOVA2 GGAAAAGGACACATTAATTGTATCCTAGTG
Q-PCR Hbg F ACACAACTGTGTTCACTAGC
110 [40]
Hbg R CAACTTCATCCACGTTCACC PL1473F18 TAACGAACGAGATCTTAA
206 [41]
PL1679R18 GTTCCTCTAAGAAGCTTT
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第三節 瘧原蟲親緣關係比較
1.檢體來源
從不同鏡檢寄生蟲密度族群中，選取分生實驗結果為惡性瘧陽性之檢體共 81 支，包含：2010 年聖多美本島瘧疾陽性檢體 14 支，其中 10 支為高寄生蟲血症、4 支為低寄生蟲血症病人；自西元 2011 年起蒐集 3 年低寄生蟲血症病人共 45 支；
而 2013 年所採檢不名發燒熱病人中，取鏡檢為高寄生蟲血症檢體、鏡檢為陰性但 分生檢驗仍偵測到瘧原蟲之檢體各 10 支，以及普林西比全島篩檢中鏡檢陽性檢體 2 支，檢體數量見表 D。研究同時蒐集所分析檢體的性別、年齡及居住地區等相關 人口學資訊，供最後結果討論使用。
表 D 聖多美親緣關係分析蒐集之檢體數量
Table D Numbers of samples which were collected from the DRSTP for phylogenetic analysis
2010 2011 2012 2013 Total Malaria case
High–density parasitemia* 10 0 0 0
14 Low–density parasitemia** 4 0 0 0
Unknown febrile patients
High–density parasitemia* 0 0 0 10
20 Microscopy negative sample 0 0 0 10
Low–density parasitemia patient** 0 10 25 10 45 Mass screening in Principe 0 0 0 2 2
Total 14 10 25 32 81
*High–density parasitemia (F3~F10)
** Low–density parasitemia (F1~F2)
2. 聚合酶鏈鎖反應 (Polymerase chain reaction; PCR)
將保存於-20℃冰箱的檢體 DNA，利用 PCR 方式檢測惡性瘧原蟲 MSP1 與
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MSP2 基因，所使用的引子對序列如表 E 所示 [35] 。每管反應液由 16.9 µl 的 DEPC 水、0.5 µl 的 10 mM dNTP Mix (dNTP Mix, Qiagen)、2.5 µl 的 10 倍 PCR Buffer、
1 µl 50 mM MgCl2、0.1 µl Taq DNA polymerase (5U/µl) (Platinum® Taq DNA Polymerse, Invitrogen)、各 1 µl 的 10 mM 引子對，以及 2 µl 的待測檢體組成，總 體積為 25 µl。開始步驟以 95℃ 預熱 5 分鐘進行反應，接續以 95℃ 使 DNA 變 性 30 秒、52℃ 使引子對黏合 30 秒、72℃ 持續 60 秒使 DNA 進行延展，上述三 步驟重複 35 個循環，最後維持 72℃ 作用 10 分鐘，使反應產物延伸完全，而反 應完成後產物將收藏在 4℃ 冰箱中進行保存。產物以洋菜凝膠電泳觀察其結果，
取 5 µl 的反應產物與 1 µl 的 6 倍 Loading Dye (EZ-Vision® Three, Amresco) 混合 均勻注入由 0.5 倍的 TBE Buffer 配置的 2%洋菜凝膠孔洞中，以 100V 電壓進行跑 膠約 40 分鐘，結束後將置於紫外燈下觀察與拍照記錄。
表 E 瘧原蟲裂殖體表面蛋白第一、二型親緣係比較所使用聚合酶鏈鎖反應之引子 序列
Table E Primers for PCR of phylogenetic relationship in malaria parasites strain
3.基因定序
取 10µl 檢測出為陽性 PCR 產物，與反應中所使用的引子對各 5 µl 委託明欣生 物科技有限公司 (MISSION BIOTECH) 進行基因定序。
4.序列分析
基因定序所得之序列利用軟體 Lasergene (DNASTAR®) 與 BioEdit®整理後去 除引子對，透過 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 中 BLAST
Primer Sequence(5’→3’) Size
(bp) Ref
MSP1 5’ GAAGATGCAGTATTGACAGG
200-300
[35]
MSP1 3’ GAGTTCTTTAATAGTGAACAAG MSP2 5’ GAGTATAAGGAGAAGTATGG
400-500 MSP2 3’ CCTGTACCT'TTATTCTCTGG
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(Basic Local Alignment Search Tool) 功能 [42] 進行物種比對，確定 PCR 產物是否 符合預期目標，並從 Gene bank 中搜尋過去研究曾分離出最為相近的物種，下載做 為之後親緣分析參考序列。
將所有序列進行對齊整理藉由 BioEdit 中 Clustalw 功能進行 Alignment 序列對 齊，接著使用 MEGA 6.0 軟體 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0 )，
以 Neighbor-joining 統計方式 Bootstrap 運算 1,000 次，建立親緣關係樹 (Phylogenetic tree) 分析聖多美當地惡性瘧原蟲流行株在不同居住地區、性別、年代和鏡檢等級 的分布資訊。
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第三章 結果
第一節 聖多美基礎流行病學分析
根據台灣駐聖多美瘧疾防治顧問團整理和提供的數據顯示，聖多美發燒病人 人數與瘧疾確診個案數在西元 2000 到 2010 年間均有顯著下降的趨勢，但發燒病 人個數在 2010 年之後有明顯上升趨勢，瘧疾確診病人數則有些微成長。圖一呈現 聖多美全國在 13 年間每年發燒人數、瘧疾確診病人人數與 SPR 值，結果顯示瘧疾 疫情在聖多美確實有所減緩，但只有在西元 2007、2008 與 2010 年這三年有達到 世界衛生組織 (WHO) 訂立進入瘧疾根除前期標準，即 SPR 值小於 5%，就研究分 析所示，目前聖多美全國仍處於準備進入瘧疾清除前期的防治階段。
圖二中呈現聖多美六省份與一自治區，個別發燒、瘧疾確診人數與 SPR 值等 資料，結果與聖多美全國趨勢相似。西元 2000 年到 2004 年瘧疾疫情看似微幅上 升，但在 2004 年後發燒人數與 SPR 值皆開始下降，大部分省份在 2007 年與 2008 年時 SPR 值都曾將至 5%以下，但近年來僅有 Lemba 省和 Principe 自治區持續保 持。Lemba 省於西元 2007 年時 SPR 值為 4.3%，雖然發燒人數在 2010 年也有略微 增加的趨勢，但到 2013 年止 SPR 值仍在穩定下降中。Principe 自治區則是在西元 2006 年時 SPR 值即快速降至 3.9%，雖然在 2009 年略有起伏，但整體而言 SPR 值 也是持續下降，在 2013 年其值已小於 1%。表一總結上述資料所示，聖多美當地 僅有 Lemba 省和 Principe 自治區目前已達到瘧疾清除前期的標準。
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第二節 聖多美分生檢驗
1.瘧疾陽性病人
西元 2010 年針對聖多美當地鏡檢判定為瘧疾陽性的 28 位病人進行血片濾紙 採檢，其中血液中寄生蟲含量包含等級 F2 到 F10，病人主要集中在 F7 到 F10 之
西元 2010 年針對聖多美當地鏡檢判定為瘧疾陽性的 28 位病人進行血片濾紙 採檢，其中血液中寄生蟲含量包含等級 F2 到 F10，病人主要集中在 F7 到 F10 之