肆、結果

一、

針對 35 位帕金森氏症患者的 Parkin cDNA 分表現子 1~7、表現 子7~12 兩段進行 PCR 增幅，純化後進行定序分析。除了先前的 S167N (AGC>AAC)多型性(表現子 4)、Ex5del 缺失突變(表現子 5)、R334C (CGC>TGC)突變(表現子 9)、V380L (GTA>CTA)多型性(表現子 10) (管, 2007)外，亦發現 Ex2-3del (表現子 2~3)及新穎的 c.1084intron⁺ (插 入子9)插入突變(圖三~五)。

(一) S167N G>A 與 V380L G>C 多型性

表現子4 的 S167N (AGC>AAC)多型性的異型合子定序結果顯示 於圖三A 左。此多型性會使限制酶 AlwNI (CAGNNNCTG)切位消失，

包含 S167N 多型性等位基因因為切位喪失，含多型性之表現子 4 片 段經切割後，168 bp 和 98 bp 兩片段轉變為 266 bp 的片段(圖三 A 右)。

表現子 10 的 V380L (GTA>CTA)多型性的異型合子定序結果顯示於 圖三B 左。此多型性會新增限制酶 Bsp1286I (GDGCHC)切位，包含 V380L 多型性的表現子 10 片段經切割後，會由 165 bp 的片段被切割 成108 bp 和 57 bp 兩片段(圖三 B 右)。S167N 與 V380L 多型性的族

群分析，共檢測了 506 位帕金森氏症患者與 508 位正常人，結果詳述 於後。

(二) R334C C>T 突變

表現子9 的 R334C (CGC>TGC)突變的定序顯示於圖四 A 左。此 突變未新增任何限制酶切位，故設計突變基因專一增幅聚合酶連鎖反

應，來做突變的確認及族群分析。突變基因專一增幅的產物為 175

bp，PCR 反應正控制組的產物為 278 bp (表三)。帕金森氏症患者 H496

為R334C 的異型合子，其 PCR 產物同時出現 278、175 bp 片段(圖四 A 右，lane CT)。本研究檢測 362 位帕金森氏症患者與 226 位正常人 的表現子9 片段，除 H496 外，並未於其他樣品發現此突變。

(三) Ex2-3del、Ex5del 缺失突變

帕金森氏症患者 H61、H1534 的定序顯示於圖四 B。將 Parkin cDNA 定序結果與 NCBI 所列的 Parkin mRNA 序列(NM_004562)互相 比對後發現帕金森氏症患者H61 為表現子 2~3 缺失突變、患者 H1534 則為表現子5 缺失突變。

(四) c.1084intron⁺插入突變

此插入突變與內含子9 上的-6g>a (IVS9 g>a) 的多型性點相關(圖五 B 左)。此多型性會使限制酶 XhoI (CTCGAG)切位消失，包含-6g>a 多型 性等位基因因切位喪失，含多型性之內含子9 片段經切割後，199 bp 和101 bp 兩片段轉變為 300 bp 的片段(圖五 B 右)。利用線上搜尋進 行Alternative Splice Site Predictor (ASSP; http://es.embnet.org/~mwang /assp.html)，由結果發現 IVS9 (-6g>a)的多型性點會提高此內含子 9 插 入序列其cryptic splice acceptor site 的分數(由 5.795 提高至 6.092)(圖 五C)，可能是造成內含子 9 插入突變機率增加的主要原因。

二、Parkin 基因 S167N、V380L 多型性與台灣族群 PD 感受性

PD 患者與正常人族群的 parkin 基因 S167N 與 V380L 多型性分 析結果詳見於表五。依等位基因頻率及樣品總數(觀察值)，算出期望 之基因數(預期值)，經 chi-square 分析後，兩多型性遺傳情形皆處於

哈溫平衡。結果顯示 V380L 之 C 等位基因頻率在病人族群中明顯較 正常人族群低(7.9 vs. 10.7%, P = 0.037)，且和低帕金森氏症感受性相 關(odds ratio: 0.71, 95% confidence interval: 0.53-0.97, P = 0.029)。

三、Parkin Ex5del 缺失突變淋巴細胞株的粒線體功能分析

(一) Caspase-3 活性分析

分別以0、50、100 nM 濃度之 staurosporine 或去血清處理 PD 患 者與正常人淋巴細胞24 小時，進行 Caspase-3 活性分析，結果顯示於 圖六。正常人淋巴細胞株經 0、50、100 nM staurosporine 或去血清處 理後，Caspase-3 活性分別是 0.54、1.51、1.86、0.58 μM，PD 病人淋 巴細胞株則分別是1.21、4.62、4.87、1.62 μM，不論是在未處理或各 種處理下，病人淋巴細胞株的 Caspase-3 活性都顯著高於正常人淋巴 細胞(P = 0.000~0.027)(圖六 A)。病人淋巴細胞株不論是在何種處理 下，Caspase-3 活性都顯著高於沒有處理的細胞(P = 0.000~0.004)。正 常人淋巴細胞株去血清處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.543)，

但正常人淋巴細胞株在50、100 nM staurosporine 處理下，Caspase-3 活性則顯著高於沒有處理的細胞(P = 0.000~0.009)(圖六 B)。

(二)粒線體膜電位分析

依上述[三-(一)]方式處理 PD 患者與正常人淋巴細胞 24 小時，利 用JC-1 red/green fluorescence 比值進行粒線體膜電位分析，結果顯示 於圖七。正常人淋巴細胞株經0、50、100 nM staurosporine 或去血清 處理後，red/green fluorescence 比值分別是 11.37、9.12、6.27、12.33，

PD 病人淋巴細胞株則分別是 7.67、4.42、4.20、7.02，不論是在未處

理或各種處理下，病人淋巴細胞株的red/green fluorescence 比值都顯 著低於正常人淋巴細胞(P = 0.004~0.008) (圖七 A)。病人淋巴細胞株

在50、100 nM staurosporine 處理下，red/green fluorescence 比值都顯 著低於沒有處理的細胞(P = 0.000)，病人淋巴細胞株去血清處理及未 處理間則未見顯著差異(P = 0.310)。正常人淋巴細胞株在 50、100 nM staurosporine 處理下，red/green fluorescence 比值都顯著低於沒有處理 的細胞(P = 0.002~0.036)，正常人淋巴細胞株去血清處理及未處理間 則未見顯著差異(P = 0.315) (圖七 B)。

(三)淋巴細胞的存活率分析

依上述[三-(一)]方式處理 PD 患者與正常人淋巴細胞 24 小時，利 用 Trypan blue 進行細胞的存活率分析，結果顯示於圖八。正常人淋 巴細胞株經0、50、100 nM staurosporine 或去血清處理後，細胞存活 率分別是86.8、78.2、75.7、85.2 %，PD 病人淋巴細胞株則分別是 79.8、

63.7、51.2、71.8 %，在 50、100 nM staurosporine 或去血清處理下，

病 人 淋 巴 細 胞 株 的 細 胞 存 活 率 都 顯 著 低 於 正 常 人 淋 巴 細 胞(P = 0.025~0.047)，在未處理下，病人淋巴細胞株的細胞存活率與正常人 淋巴細胞間則未見顯著差異(P = 0.167) (圖八 A)。病人淋巴細胞株在 50、100 nM staurosporine 處理下，細胞存活率都顯著低於沒有處理的

細胞(P = 0.002~0.026)，病人淋巴細胞株去血清處理及未處理間則未 見顯著差異(P = 0.091)。正常人淋巴細胞株各種處理及未處理間皆未 見顯著差異(P = 0.099~0.747) (圖八 B)。

四、PD 患者 HTRA2 基因突變

PD 患者(87 位)包含表現子 1~8 的 cDNA 經 PCR 增幅、純化後進

行定序分析。結果發現表現子1 的 R36W (CGG>TGG)、表現子 2 的 T215M (ACG>ATG)等改變胺基酸的變異(圖九)。

(一) R36W C>T 突變

帕金森氏症患者 H1663 表現子 1 的 R36W (CGG>TGG)突變的異 型合子定序結果顯示於圖九A 左。此多型性會使限制酶 HpaII (CCGG)

切位消失，包含 R36W 突變等位基因因為切位喪失，含突變之表現子

1 片段經切割後，183 bp 和 34 bp 兩片段轉變為 217 bp 的片段(圖九 A 右)。本研究檢測 461 位帕金森氏症患者 R36W 突變情形，結果共發 現2 位 PD 患者(H1663、H378)有 R36W 突變。

(二) T215M C>T 突變

帕金森氏症患者 H570 表現子 2 的 T215M (ACG>ATG)突變的異

型合子定序結果顯示於圖九B 左。此多型性會使限制酶 TaiI (ACGT )

切位消失，包含 T215M 突變等位基因因切位喪失，含突變之表現子

2 片段經切割後，170 bp 和 105 bp 兩片段轉變為 275 bp 的片段(圖九 B 右)。本研究檢測 476 位帕金森氏症患者的表現子 2 片段，除 H570 外，並未於其他PD 樣品發現此突變。

(三) R36W 突變的家族分析

將 R36W 突變的 PD 患者 H1663 及其家人(父親、母親及妹妹)基 因組DNA 使用 PCR-RFLP 進行家族的 R36W 突變檢測。結果顯示患 者與其母親皆為異型合子突變，而其父親與妹妹則不帶此突變(圖 十)。

五、HTRA2 突變之功能分析

(一) EGFP 標記的 HTRA2 cDNA 選殖

野生型(WT)及 R36W 突變的 cDNA，經 PCR 移除終止密碼並引 入 KpnI 限制酵素切位後，置入 EGFP-N1 質體(圖十一)。經 KpnI、HpaII

限制酵素切割圖譜分析確認選殖成功的野生型及 R36W 重組質體(圖

十二)。

(二) EGFP 標記的 HTRA2 cDNA 表現

利用Lipofectamine 將野生型及 R36W、T215M 突變(由大學部學 妹 謝 謹 霞 完 成) 的 HTRA2-EGFP 重組質體轉移入 HEK-293T 及 SK-N-SH 細胞表現。二天後蒐集細胞，利用 GFP 抗體進行西方轉漬

分析，觀察細胞中 HTRA2-EGFP 融合蛋白表現情形，結果顯示於圖 十三。兩種細胞不論是總蛋白(上)或是細胞質液與粒線體的次細胞分

層 蛋 白( 下 ) ， 皆 可 偵 測 到 約 70 kDa 的 前 軀 及 61 kDa 的 成 熟 HTRA2-EGFP 融合蛋白，而且總蛋白及次細胞分層蛋白中，R36W 突 變型的61 kDa 成熟蛋白表現量較野生型低，T215M 突變型則呈現異 常的分子量變化。

(三) HTRA2-EGFP 融合蛋白的螢光顯微鏡觀察

利用Lipofectamine 將野生型及突變型 HTRA2-EGFP 重組質體轉 移入 HEK-293T 及 SK-N-SH 細胞表現。二天後將細胞染色，步驟完 成後使用Leica TCS SP2 螢光顯微鏡觀察細胞形態、綠螢光融合蛋白 的表現情形與表現位置等。結果顯示於圖十四。兩種細胞表現一致，

野生型及 R36W、T215M 突變型 HTRA2-EGFP 融合蛋白細胞中表現 位置相似，皆分佈在粒線體。

(一) S167N、V380L 多型性及 R334C 突變的序列比對

由 NCBI 搜 尋 各 種 哺 乳 動 物 (Human 、 Pan troglodytes 、 Mus musculus、Rattus norvegicus) parkin 基因序列進行 S167N、V380L 多

型性及R334C 突變的序列比對，結果顯示於圖十五 A。僅 R334C 突 變點在各物種間具有高度保留性。

(二) R36W 及 T215M 突變的序列比對

由NCBI 搜尋各種哺乳動物(Human、Bos taurus、Mus musculus、

Rattus norvegicus) HTRA2 基因序列進行 R36W、T215M 突變的序列 比對，結果顯示於圖十五 B。R36W 及 T215M 突變點在各物種間皆 具有高度保留性。