一、研究樣品
分子遺傳研究所使用的 PD 患者與正常人血液的基因組 DNA 與 cDNA 樣品均由林口長庚醫院神經內科所提供。所有患者經吳逸如醫
師及陳瓊美醫師的診斷後，徵求患者或家屬同意始進行血液採樣。PD
樣品選取的標準為：含有兩個以上PD 典型症狀包括靜止性震顫、僵
直、姿態反射障礙、和運動遲緩。然而，任何可能因腦外傷、腦炎或 服用抗精神性藥物等已知因子所引起帕金森氏症候群的個體則排除 在外。同時也蒐集年齡、性別比率相當的正常人之血液樣品，作為控 制組以供對照。
二、細胞培養
進行基因功能檢測實驗則是採用HEK-293T、SK-N-SH細胞以及 林口長庚醫院神經內科所提供的PD患者與正常人淋巴細胞株進行實 驗。細胞皆培養於37℃、5% CO2且溼度穩定之細胞培養箱中，
HEK-293T及SK-N-SH細胞培養液為包含10% FBS、1.0 mM sodium pyruvate、1.5 g/l sodium bicarbonate、100 U/ml penicillin、100 U/ml
streptomycin的DMEM medium (Gibco)，細胞以1:5或1:10進行繼代培 養。PD患者與正常人淋巴細胞株培養液為包含20% FBS、1.0 mM sodium pyruvate、1.5 g/l sodium bicarbonate、100 U/ml penicillin、100 U/ml streptomycin的RPMI 1640 medium (Gibco)，每隔一至兩天添加 5 或 10 ml 新鮮培養液，每兩週進行 1:3-1:4 繼代培養，以 1,200 rpm，離心 5 分鐘，去除上清液，收集細胞換至新 T75 細胞培養瓶。
三、西方轉漬法(Western blot)
蛋白質先經Bio-Rad Protein Assay 定量後，取等量蛋白質加入適 量sample buffer (50 mM Tris, pH6.8 - 2% SDS - 10% glycerol - 2.5%
β-mercaptoethanol - 0.005% bromophenolblue)，在沸水中預熱 5~10 分 鐘後取出，置於冰上準備進行10% SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE) 以分離蛋白質。待電泳完，再利用XCell II TM Blot Module (Invitrogen) 及transfer buffer (25 mM Tris - 0.2 M glycine - 20% methanol)將蛋白轉 漬至硝化纖維膜(nitrocellulose membrane, Whatman)上。之後浸泡於 blocking buffer (10% skim milk - PBS)置 4℃中隔夜。Blocking 完成後 以wash buffer (10 mM Tris-HCl pH8.0 - 0.05% Tween 20)清洗硝化纖 維膜三次，每次 15 分鐘。加入一級抗體於室溫下作用 2 小時後，以
(HRP) conjugated 二級抗體，於室溫作用 1.5 小時。之後以 wash buffer 清洗膜三次，每次 15 分鐘。最後加入冷光呈色試劑(Millipore)於膜 上，以冷光儀及ImagerReader LAS-3000 軟體偵測蛋白表現。蛋白質 萃取實驗重複進行兩次，每次萃取的蛋白液重複兩次西方轉漬分析。
四、Parkin cDNA 增幅及定序
設計引子對(表二)，針對 PD 患者的 Parkin Exons 1~7 及 Exons 7~12 進行 cDNA 增幅及定序。取 100 ng 的 cDNA，置於 25 μl 的 PCR
反應中，反應溶液中包括50 ng 的引子對、1.5 mM MgCl2、200 μM dNTPs、0.5 U 熱穩定性 DNA 聚合酶(Promega)。PCR 以熱循環儀 (OmniGene, HYBRID)進行，反應條件為 94℃作用 6 分鐘使 DNA 雙 股裂解，接著進行裂解溫度94℃ 30 秒、煉合溫度 54/58℃ 45 秒及延 長溫度72℃ 90 秒的 55 個循環，最後以 72℃作用 10 分鐘。反應完畢 後以洋菜膠電泳分離、純化(gel extraction kit，Viogene)後，以雷射螢 光DNA 自動定序儀進行定序分析(源資國際生物科技公司)。
五、Parkin 基因 S167N、V380L 多型性與台灣族群 PD 感受性分析
將 PD 患者(506 位)及正常人族群(508 位)的基因組 DNA 樣本進
行PCR-RFLP，將所得到的結果統計後再進行 Parkin 基因多型性與台 灣族群PD 感受性之分析。
(一)聚合酶連鎖反應(PCR)
取100 ng 的基因組 DNA，置於 25 μl 的 PCR 反應中，放大 Parkin 基因的S167N 與 V380L 多型性點所在的表現子片段。PCR 反應的引 子對及條件列於表三。PCR 產物以 1.4%洋菜膠體電泳檢查片段大小。
(二)限制酶片段長度多型性分析(RFLP)
取2 μl PCR 產物，加入表三所列針對各多型性點所設計的限制 酵素，與反應溶液均勻混合(10 µl 切割反應)，在水浴槽中反應 2 小時
到隔夜。之後以1.6 ~ 2.0%洋菜膠體電泳檢查片段大小，檢查各樣品 的多型性基因型。
(三)統計分析
計算各樣品群多型性基因型數目，利用 Chi-square test (χ2)檢測 各多型性點是否符合哈溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)，並比較 多型性基因型分佈、等位基因頻率，在帕金森氏症族群與正常人族 群間，是否有顯著差異。並使用JMP 5.1 軟體計算出罹病的相對危險
六、台灣族群Parkin 基因 R334C 突變檢測
將 PD 患者(362 位)及正常人(226 位)的基因組 DNA 樣本使用 allele specific PCR 進行族群的 R334C 突變檢測。設計突變點 R334C (CGC＞TGC)專一增幅的正向引子(9F-3，表三)，其 3’端與變異點互 補，與反向引子 9R 配對，來增幅含 R334C 突變點由正向引子 9F-3 到反向引子9R 的片段(增幅片段 175 bp)。另一正向引子 9F 亦與反向 引子9R 配對，作為 PCR 反應的 internal control (增幅片段 278 bp)。
每次PCR 反應皆需要有正控制組(樣品 H496 經基因組 DNA 定序驗證 為R334C 異型合子變異)，引子的序列、增幅片段的長度及 PCR 反應 的條件詳列於表三，PCR 的產物以 1.4%洋菜膠體電泳檢查。
七、Parkin Ex5del 缺失突變淋巴細胞株的粒線體功能分析
將PD 患者與正常人淋巴細胞培養於培養瓶(1×107 cells in 10 ml medium)或 12 孔盤培養皿中(1×106 cells in 1 ml medium)。24 小時後，
分別以0、50、100 nM 濃度之 staurosporine 或去血清處理 24 小時，
並進行下列實驗。每種藥物處理實驗進行三次，每次實驗進行二重複 測量。
(一) Caspase-3 活性分析
將培養瓶中細胞混勻並離心收集細胞，以PBS清洗兩次，收集細
胞pellets 。 利 用 Caspase-3 Assay Kit, Fluorimetric (SIGMA) 偵 測 caspase-3活性，活化的caspase-3切割受質Ac-DEVD-AMC後發出螢 光，因此可利用偵測AMC的螢光量來推測細胞中活化的caspase-3之 相對量，AMC的螢光量愈高顯示細胞中活化的caspase-3之相對量愈 高。首先於細胞pellets中加入適當體積lysis buffer，於冰上作用15~20 分鐘後，利用液態氮連續冷凍解凍六次打破細胞以萃取蛋白質。4℃
離心14,000 × g、10~15分鐘後取上清液。定量後取 25 µg置於96孔不 透光黑盤中，加入Ac-DEVD-AMC受質在室溫下反應2~2.5小時後，
利用螢光儀(Molecular Devices-Fluorescent microplate reader-Gemini XPS)以excitation 360 nm及emission 460 nm進行測試。
(二)粒線體膜電位分析
將12 孔 盤 培 養 皿 中 細 胞 混 勻 離 心 收 集 細 胞 ， 利 用 JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit進行測試，加入JC-1試 劑在37℃下反應15分鐘。離心400 × g、5分鐘後移除上清液，加入300 µl assay buffer將cell pellets懸浮後，取100 µl置於96孔不透光黑盤中，
XPS) 偵 測 紅 螢 光 (excitation 550 nm、 emission 600 nm) 及 綠 螢 光 (excitation 485 nm、emission 535 nm)。在健康的細胞中，JC-1染劑可
以進入粒線體將粒線體染成紅色，而在進行細胞凋亡時粒線體膜電位 崩解造成JC-1染劑無法進入粒線體，只能留在細胞質液中染成綠色。
藉由計算紅螢光及綠螢光的比值可反應出細胞凋亡的程度及粒線體 膜電位變化，當進行細胞凋亡時紅螢光及綠螢光的比值將呈現降低的 趨勢。
(三)淋巴細胞的存活率分析
將12 孔盤培養皿中細胞混勻取 20 µl，和 20 µl 0.4% Trypan blue (Gibco)混合後，利用自動細胞計數器(Invitrogen)分別計算活細胞(亮) 及死細胞(藍色)數量來求得細胞的存活率。
八、HTRA2 cDNA 增幅及定序
設計引子對(表二)，增幅 HTRA2 cDNA。取 100 ng 的 cDNA，置 於25 μl 的 PCR 反應中，反應溶液中包括 50 ng 的引子對、1.5 mM MgCl2、200 μM dNTPs、0.5 U 熱穩定性 DNA 聚合酶(Takara La Taq)。
PCR 以熱循環儀(OmniGene, HYBRID)進行，反應條件為 94℃作用 6 分鐘使DNA 雙股裂解，接著進行裂解溫度 94 30℃ 秒、煉合溫度 66 ℃
60 秒及延長溫度 72 60℃ 秒的55 個循環，最後以 72℃作用 10 分鐘。
PCR 產物的洋菜膠電泳分離、純化、定序如上述(四、Parkin cDNA 增幅及定序)。
九、台灣 PD 族群 HTRA2 基因 R36W 及 T215M 突變檢測
將 PD 患者的基因組 DNA 樣本使用 PCR-RFLP 進行族群的 R36W、T215M 突變檢測。
(一)聚合酶連鎖反應(PCR)
取100 ng 的基因組 DNA，置於 25 μl 的 PCR 反應中，放大 HTRA2 基因R36W 及 T215M 突變所在的表現子片段。PCR 反應的引子對及 條件列於表四。PCR 產物以 1.4%洋菜膠體電泳檢查片段大小。
(二)限制酶片段長度多型性分析(RFLP)
取2 μl PCR 產物，加入表四所列針對各突變點所設計的限制酵 素，與反應溶液均勻混合(10 µl 切割反應)，在水浴槽中反應 2 小時到 隔夜。之後以1.6 ~ 2.0%洋菜膠體電泳檢查片段大小，進行族群的突 變檢測。
(三) R36W 突變的家族分析
針對 R36W 突變的 PD 患者(H1663)收集其家人(父親、母親及妹 妹)基因組 DNA，使用 PCR-RFLP 進行家族的 R36W 突變檢測。
十、HTRA2 基因 R36W 及 T215M 突變的功能分析
(一) pEGFP-N1-HTRA2 重組質體的建構
利用 R36W 及 T215M 異型合子的 PD 病人 cDNA，進行 PCR，
增幅 HTRA2 cDNA 序列，其中反向引子(表二)的設計用以移除 HTRA2 cDNA 序列上的終止密碼並引入 KpnI 限制酵素切位，以利於
之後將此HTRA2 cDNA 序列接到 EGFP-N1 質體。上述 PCR 增幅的 HTRA2 cDNA 片段經純化後接合入 pGEM-T Easy 載體，並以電穿孔 (electroporation) (BIO-RAD, GENE PULSERII) 方 式 轉 形 (transformation)入 E. coli 轉形勝任細胞內。挑選單一菌落，以鹼性溶 菌法(Sambrook et al., 1989)小量抽取質體 DNA，進行限制酵素切割圖 譜分析與cDNA 定序。確認無誤後，利用 Plasmid Midi Kit (Geneaid) 大量製備選殖成功的野生型及R36W、T215M 突變型重組質體 DNA。
再以 KpnI 切出 HTRA2 cDNA，純化後置入 pEGFP-N1 載體的 KpnI 切位。接合好的pEGFP-N1-HTRA2 重組 DNA 的轉形、質體 DNA 小 量抽取如上述。經 KpnI、HpaII、TaiI 限制酵素切割圖譜分析確認後，
進行質體 DNA 的大量製備與保存，其中 T215M 突變型重組質體 cDNA 構築及限制酵素切割圖譜分析由大學部學妹謝謹霞所完成。
(二)轉染(transfection)
接種5×106 (HEK-293T)或 3×106 (SK-N-SH)細胞至 10 cm 培養皿 中。第二天，進行EGFP-N1 (載體)、pEGFP-N1-HTRA2/WT (野生型 基因)及 pEGFP-N1-HTRA2/R36W、pEGFP-N1-HTRA2/T215M (突變 型基因)的轉染。取 36 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，加入 1.5 ml
去血清且不含抗生素之OptiMEM 培養液(Gibco)，混合均勻。再取 36 μg 質體 DNA，加入 1.5 ml OptiMEM 培養液，混合均勻。接著將已作
用 5 分鐘的 Lipofectamine - OptiMEM 混合液加入質體 DNA - OptiMEM 混合液。20 分鐘後加入上述 3 ml 的 Lipofectamine - 質體 DNA - OptiMEM 混合液到上述 10 cm 培養皿的細胞中，置於 37℃、
5% CO2 且溼度穩定之細胞培養箱中培養 6 小時。之後換掉含
Lipofectamine 的培養液，改以完全培養液培養二天。另外，以不含質 體DNA 的轉染當做轉染控制組。
(三)次細胞分層及西方轉漬分析
轉染二天後離心收集細胞，以PBS 清洗兩次，收集細胞 pellets。
用26G 的針筒來回推拉 25~30 次直到 75~80%的細胞已經打破(取 2~3 µl 細胞懸浮液利用顯微鏡觀察)。離心 1,000 × g、10 分鐘後移除 pellets (含未破細胞及細胞核)，將上清液離心 10,000 × g、15~20 分鐘後，分 別蒐集上清液及pellets。上清液以 14,000 × g 離心 15~20 分鐘，所得 上清液即為細胞質液fraction。Pellets 以 hypotonic buffer 清洗數次，
每次以10,000 × g 離心 15~20 分鐘，最後保留的 pellets 即為粒線體。
加入50 µl RIPA buffer 至粒線體 pellets，超音波震盪 30 下後，以 14,000
× g 離心 15~20 分鐘，所得上清液即為粒線體 fraction。細胞質液 fraction 及粒線體 fraction 經蛋白質定量後，分別取 20 µg 細胞質液 fraction 及 5 µg 粒線體 fraction，利用西方轉漬及 EGFP 抗體，分析細 胞中野生型與突變型HTRA2-EGFP 融合蛋白表現的情形。
(四)螢光顯微鏡觀察
接 種 1×105 HEK-293T 及 SK-N-SH 細 胞 至 包 含 coverslips [poly-L-lysine (100 μg/ml, Sigma)處理過]的 12 孔細胞培養盤中。第二
天進行 EGFP-N1 (載體)、pEGFP-N1-HTRA2/WT (野生型基因)及 pEGFP-N1-HTRA2/R36W、pEGFP-N1-HTRA2/T215M (突變型基因) 的轉染，配製Lipofectamine 2000 (3 μl) - OptiMEM (100 μl)及質體 DNA (3 μg) - OptiMEM (100 μl)溶液。Lipofectamine - OptiMEM 溶液
混勻5 分鐘後加入質體 DNA - OptiMEM 溶液。20 分鐘後加到 12 孔
盤細胞中。培養6 小時後改以完全培養液培養。二天後進行染色，其
方法如下：先將400 nM mitotracker red 染劑加到培養液中，37℃避光 作用60 分鐘。mitotracker red 染劑作用 40 分鐘後同時加入 0.1 μg/ml Hoechst33342 核染劑到培養液作用 20 分鐘。染色完成後移除培養液，
方法如下：先將400 nM mitotracker red 染劑加到培養液中，37℃避光 作用60 分鐘。mitotracker red 染劑作用 40 分鐘後同時加入 0.1 μg/ml Hoechst33342 核染劑到培養液作用 20 分鐘。染色完成後移除培養液，