台灣族群帕金森氏症Parkin及HTRA2基因變異的分子遺傳及功能研究

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(1)國立台灣師範大學生命科學系碩士論文. 台灣族群帕金森氏症Parkin及HTRA2 基因變異的分子遺傳及功能研究 Molecular Genetic and Functional Studies of Parkin and HTRA2 Gene Variations in Taiwanese Parkinson’s Disease. 研究生：吳春嫺 Chun-Hsien Wu 指導教授：李桂楨博士 Guey-Jen Lee-Chen 中華民國九十八年七月.

(2) 誌謝. 在師大兩年的求學生涯中，每天都過著豐富充實的生活，感謝師大提供這樣的資源，讓我有機會在多年職場生涯後能重溫求學生活的樂趣，並重新充實自我。本研究的完成，首先要感謝恩師李桂楨老師，感謝您的有教無類，即便是對已大學畢業多年並對分生領域極度陌生的我，您都願意給我學習的機會，您深厚的學養與專業的指導，讓我在研究過程中受益良多，更讓我有堅持下去與努力的勇氣。感謝林口長庚紀念醫院神經內科吳逸如醫師及陳瓊美醫師適時給予指導與建議，讓研究得以順利進行，使論文更臻完善。也感謝林口長庚紀念醫院所有血液樣本及淋巴細胞株的提供者，讓我們能順利完成實驗。在研究生涯中，我也仰賴許多人的指導與幫助。感謝實驗室學長姊李姊、秀觀學姊、怡辰學姊、郡潔學姊、士寰學長、佩瑛學姊、金玨學姊、志信學長、玄竺學長、昇翰學長、雰茹學姊、芷英學姊、雅今學姊、奕村學長在實驗上耐心的協助與建議；還有我的同學品蓉、軒浩，你們的陪伴讓我覺得自己絕非孤軍奮戰；還有淑婷、慈蓬、詩涵、佩茹、婷中、亦鈞、謹霞、菀玲、麗芬……等，感謝你們平時給.

(3) 我的幫助，在我實驗繁忙無暇買中餐時體貼的幫我買便當，給我加油打氣；也感謝蘇老師實驗室的柏安學長、俊彥學長、俞鈞……等，感謝你們在實驗上的建議與藥品器材的協助。也感謝待我如父的蘇醫師、林老師，感謝您們的鼓勵與幫助，讓我有勇氣重回校園追求自己的夢想。最後，謹將此篇論文獻給我最親愛的家人：爸爸、媽媽、姊姊及弟弟，有你們做為我最強而有力的精神支柱，我才能毫無後顧之憂的完成碩士學業，謝謝您們！.

(4) 目錄目錄............................................................................................................. I 中文摘要 ................................................................................................. VI Abstract..................................................................................................VII 圖表目錄 .............................................................................................. VIII 壹、緒論 ....................................................................................................1 一、帕金森氏症..................................................................................1 (一)臨床病徵 ................................................................................1 (二)神經病理學 ............................................................................2 (三)致病原因 ................................................................................2 (四)致病途徑 ................................................................................3 二、帕金森氏症的遺傳分析..............................................................4 三、Parkin 基因 ..................................................................................5 (一) Parkin 的構造與表現............................................................6 (二) Parkin 的功能........................................................................7 (三) Parkin 基因變異與帕金森氏症 ...........................................8 四、HTRA2 基因................................................................................8 (一) HTRA2 的構造與表現 .........................................................9 (二) HTRA2 的功能 ...................................................................10 (三) HTRA2 基因變異與帕金森氏症 .......................................10 I.

(5) (四) HTRA2 與其它神經退化性疾病 .......................................11 貳、研究目的 ..........................................................................................12 參、研究材料與方法 ..............................................................................13 一、研究樣品....................................................................................13 二、細胞培養....................................................................................13 三、西方轉漬法(Western blot) ........................................................14 四、Parkin cDNA 增幅及定序.........................................................15 五、Parkin 基因 S167N、V380L 多型性與台灣族群 PD 感受性分析................................................................................................15 (一)聚合酶連鎖反應(PCR)........................................................16 (二)限制酶片段長度多型性分析(RFLP)..................................16 (三)統計分析 ..............................................................................16 六、台灣族群 Parkin 基因 R334C 突變檢測..................................17 七、Parkin Ex5del 缺失突變淋巴細胞株的粒線體功能分析 .......17 (一) Caspase-3 活性分析............................................................18 (二)粒線體膜電位分析 ..............................................................18 (三)淋巴細胞的存活率分析 ......................................................19 八、HTRA2 cDNA 增幅及定序 ......................................................19 九、台灣 PD 族群 HTRA2 基因 R36W 及 T215M 突變檢測.......20 II.

(6) (一)聚合酶連鎖反應(PCR)........................................................20 (二)限制酶片段長度多型性分析(RFLP)..................................20 (三) R36W 突變的家族分析......................................................21 十、HTRA2 基因 R36W 及 T215M 突變的功能分析 ...................21 (一) pEGFP-N1-HTRA2 重組質體的建構................................21 (二)轉染(transfection) ................................................................22 (三)次細胞分層及西方轉漬分析 ..............................................22 (四)螢光顯微鏡觀察 ..................................................................23 肆、結果 ..................................................................................................25 一、PD 患者 Parkin 基因突變 .........................................................25 (一) S167N G>A 與 V380L G>C 多型性..................................25 (二) R334C C>T 突變 ................................................................26 (三) Ex2-3del、Ex5del 缺失突變 ..............................................26 (四) c.1084intron+插入突變 .......................................................26 二、Parkin 基因 S167N、V380L 多型性與台灣族群 PD 感受性 27 三、Parkin Ex5del 缺失突變淋巴細胞株的粒線體功能分析 .......27 (一) Caspase-3 活性分析............................................................28 (二)粒線體膜電位分析 ..............................................................28 (三)淋巴細胞的存活率分析 ......................................................29 III.

(7) 四、PD 患者 HTRA2 基因突變 ......................................................30 (一) R36W C>T 突變 .................................................................30 (二) T215M C>T 突變................................................................30 (三) R36W 突變的家族分析......................................................31 五、HTRA2 突變之功能分析..........................................................31 (一) EGFP 標記的 HTRA2 cDNA 選殖....................................31 (二) EGFP 標記的 HTRA2 cDNA 表現....................................32 (三) HTRA2-EGFP 融合蛋白的螢光顯微鏡觀察....................32 六、突變及多型性的序列比對........................................................32 (一) S167N、V380L 多型性及 R334C 突變的序列比對 ........33 (二) R36W 及 T215M 突變的序列比對 ...................................33 伍、討論 ..................................................................................................34 一、Parkin 基因突變 ........................................................................34 (一) Ex2-3del、Ex5del 缺失突變 ..............................................34 (二) R334C C>T 突變 ................................................................35 (三) c.1084intron+插入突變 .......................................................36 (四) S167N、V380L 多型性與台灣族群 PD 感受性 ..............36 (五) Parkin Ex5del 缺失突變淋巴細胞株的粒線體功能分析.37 二、HTRA2 基因突變......................................................................40. IV.

(8) (一) R36W C>T 突變 .................................................................40 (二) T215M C>T 突變................................................................41 (三) HTRA2 基因 R36W 及 T215M 突變的功能分析 ............41 陸、參考文獻 ..........................................................................................43 柒、附錄圖表 ..........................................................................................54. V.

(9) 中文摘要 PARK2 與 PARK13 分別與體染色體隱性遺傳及偶發性帕金森氏症(Parkinson's disease；簡稱 PD)相關。PARK2 基因產物 Parkin 具 ubiquitin E3 ligase 功能，而 PARK13 基因產物 HTRA2 則與細胞凋亡相關。本研究延續先前的 PARK2 cDNA 定序(管, 2007)，分析台灣帕金森氏症患者 Parkin 的基因變異。結果共發現二個缺失突變 (Ex2-3del、Ex5del)、一個點突變(R334C)、兩個多型性(S167N、V380L) 及一個新穎的內含子 9 插入突變(c.1084intron+)，此插入突變與內含子 9 上的-6g>a (IVS9 g>a)的多型性點相關。進一步對所蒐集的病人與性別、年齡相當的正常人進行 S167N、V380L 的病例-對照組分析，結果顯示 V380L C 等位基因頻率在病人族群中明顯較正常人族群低，且和低帕金森氏症感受性相關。Ex5del 缺失突變與正常人淋巴細胞的分析結果顯示，病人淋巴細胞的 Caspase-3 活性顯著高於正常人，粒線體膜電位分析結果亦顯示病人淋巴細胞的細胞凋亡顯著高於正常人，在 staurosporine 或去血清處理下，病人淋巴細胞存活率顯著低於正常人。在 HTRA2 基因分析方面，HTRA2 cDNA 定序結果發現二個新穎的點突變(R36W 與 T215M)。進一步建構 EGFP 標記的 cDNA 質體，表現於 HEK-293T 及 SK-N-SH 細胞，次細胞分層、西方轉漬、螢光顯微鏡分析結果顯示，R36W 與 T215M 蛋白皆有成熟型蛋白生成且座落於粒線體，但 R36W 蛋白成熟型表現量較野生型低，T215M 蛋白則表現異常分子量的前軀及成熟蛋白。. VI.

(10) Abstract PARK2 and PARK13 are involved in autosomal recessive juvenile parkinsonism and sporadic Parkinson’s disease (PD), respectively. The PARK2 gene product Parkin has ubiquitin E3 ligase activity, whereas PARK13 gene product HTRA2 is located in the mitochondrial intermembrane space and released into the cytosol during apoptosis. In the present study PARK2 mutations were analyzed in a cohort of Taiwanese PD patients by using direct cDNA sequencing. Two deletions (Ex2-3del and Ex5del), one point mutation (R334C), one insertion (c.1084intron+) and two reported SNPs (S167N and V380L) in Parkin were identified. The c.1084intron+ was due to a novel g-a transition SNP at position -6 of a cryptic splice acceptor site within IVS9 (-6g>a). The association of Parkin polymorphisms S167N and V380L with PD were analyzed using a case-control study. Although the difference is not significant, the V380L C allele was notably lower in PD patients than the controls, and a trend toward decrease in risk of developing PD was evident. In lymphoblastoid cells, caspase-3 activity and loss of mitochondrial membrane potential in cells with Ex5del were significantly higher than that of the control cells. Treatment of staurosporine significantly increases cell death in the cells with e Ex5del. Screening of the HTRA2 cDNA revealed two novel point mutations (R36W and T215M). The EGFP-tagged HTRA2 constructs were prepared for transient expression in HEK-293T and SK-N-SH cells. Subcellular fractionation, Western blot and fluorescence microscopy examination revealed that both R36W and T215M mature proteins localized to mitochondria. However, the amount of R36W mature protein is less than that of wild type. Also unusual precursor and mature proteins were observed with T215M mutation. VII.

(11) 圖表目錄圖一、Parkin 蛋白結構及基因突變。...................................................54 圖二、HTRA2 蛋白結構及基因突變。 ................................................55 圖三、Parkin 基因 S167N 與 V380L 多型性檢測。 ............................56 圖四、Parkin 基因 R334C、Ex2-3del、Ex5del 突變檢測。 ...............57 圖五、Parkin 基因 c.1084intron+突變檢測。 .......................................58 圖六、Ex5del 缺失突變淋巴細胞株的 Caspase-3 活性分析。 ...........59 圖七、Ex5del 缺失突變淋巴細胞株的粒線體膜電位分析。..............60 圖八、Ex5del 缺失突變淋巴細胞株的細胞存活率分析。..................61 圖九、HTRA2 基因 R36W 與 T215M 突變檢測。..............................62 圖十、H1663 患者家族 HTRA2 R36W 突變分析。 ............................63 圖十一、HTRA2-EGFP 重組質體的構築。 .........................................64 圖十二、HTRA2-EGFP 重組質體的限制酵素圖譜分析。 .................65 圖十三、HTRA2-EGFP 融合基因表現的西方轉漬分析。 .................66 圖十四、共軛焦顯微鏡觀察 HTRA2-EGFP 融合基因在 HEK-293T、 SK-N-SH 細胞內表現位置。..................................................67 圖十五、多型性及突變的序列比對。 ..................................................69 表一、帕金森氏症的遺傳因子 ..............................................................70 表二、增幅 Parkin、HTRA2 cDNA 的引子對、條件及定序引子 .....71 VIII.

(12) 表三、Parkin 基因突變及多型性 PCR 引子對及檢測試驗 .................72 表四、HTRA2 基因突變 PCR 引子對及檢測試驗...............................73 表五、Parkin 基因 S167N、V380L 多型性基因型、等位基因頻率及與疾病相關性 ..................................................................................74. IX.

(13) 壹、緒論. 一、帕金森氏症. 帕金森氏症(Parkinson's disease，以下簡稱 PD)為僅次於阿茲海默氏症(Alzerheimer's disease)的漸進性神經退化性疾病， 65 歲以上的人口超過 1%受到此疾病所影響。在 1817 年首度由 James Parkinson 醫師敘述此疾病，其症狀最初被敘述為一種震顫性麻痺(shaking palsy)，在當時尚不清楚其病理變化。. (一)臨床病徵 PD 患者通常在中晚年發病，患者發病後其病況會隨著時間每況愈下。帕金森氏症患者主要的臨床病徵包含靜止性震顫 (resting tremor)、僵直(rigidity)、行動遲緩(bradykinesia)、步伐不穩(postural instability)等(Conley and Kirchner, 1999)。病患靜止性震顫頻率為每秒四到七次，通常會在休息時發生，常是罹病的初期症狀。肢體僵直的症狀常由肢體近端開始發展，動作時所需花費的力氣較平常人多，軀幹旋轉能力變差。有行動遲緩症狀的病患，其自主動作的執行變慢且維持動作出現困難，動作的速度範圍與振幅都會降低。而步伐不穩是指病患在嘗試站立或轉身時，無法維持平衡而容易跌倒 1.

(14) (Marjama-Lyons and Koller, 2001)。帕金森氏症的症狀會隨著病程的演進而加重，隨著病情的發展最終會導致患者的行動能力完全喪失，必須仰賴輪椅，甚至有的會無法行動而臥病在床(Hoehn and Yahr, 1967)。. (二)神經病理學 PD 病患主要的病理特徵是多巴胺神經元(dopaminergic neuron)在中腦黑質之緻密區(substantia nigra pars compacta, SNc)與其他腦幹神經核有退化死亡的現象，因而造成黑質紋狀體路徑 (nigrostriatal pathway)的多巴胺(dopamine)分泌不足而引起臨床症狀(Dauer and Przedborski, 2003)。這些多巴胺神經元是基底核(basal ganglia)重要的組成份子，而基底核位於腦部，主要是負責人體的微調及協調運動。除了 SNc 處會有多巴胺神經元死亡的病理特徵外，亦發現有一種嗜伊紅性的細胞質內蛋白質包涵體，在神經元的細胞質中形成球狀的 Lewy body，有時則在神經元突起處呈鈁錘絲狀的構造分佈，稱為 Lewy neuritis (Gibb and Lees, 1991)。這些包涵體分佈在帕金森氏症病患 SNc 處殘存的多巴胺神經元中，主要成分為 α-synuclein、ubiquitin 與 neurofilament (Conley and Kirchner, 1999)。. (三)致病原因 2.

(15) PD 的遺傳現象最早於 1880 年被 Gowers 注意到，Gowers 發現其所治療的病人中，約有 15%的病人其家族內也有罹患帕金森氏症的親屬。依據目前研究文獻顯示，約有 5~10%的 PD 病人具有家族遺傳的現象，遺傳的方式有體染色體顯性及體染色體隱性兩種。除基因突變外，流行病學、神經病理學與先前的研究都傾向於「多因子病因理論」，包括遺傳變異導致的敏感性差異、環境毒素的長期暴露、老化等(Scherman et al., 1989)。在各種帕金森氏症病因理論中，以遺傳與環境因子交互作用造成疾病的多因子病因理論最為被接受，PD 患者由於先天遺傳了某些基因的缺陷或多型性，而使得他們對於特定環境因子的感受性較大，易引起黑質多巴胺神經元的退化，最終導致帕金森氏症(Bertram et al., 2005; Schapira, 2006)。此外，曾有研究顯示，黑質細胞數量會隨著年齡增加而有所減少(Gibb and Lees, 1991)，顯示年齡的增加亦為帕金森氏症的危險因子。然而多數的 PD 病患屬於偶發型(sporadic)，確切病因目前並不明確，少數的家族遺傳性帕金森氏症則與基因突變有關 (Farrer, 2006)。. (四)致病途徑目前研究發現可能的致病途徑包括蛋白質品質控管改變、氧化壓. 3.

(16) 力與粒線體功能不良以及 kinase 的活性受到干擾。蛋白質的聚集以及 ubiquitin proteasome system 的功能不良會導致蛋白質品質控管受到干擾。許多文獻也指出粒線體的功能不良會造成 PD 黑質緻密區多巴胺神經元的退化，粒線體 complex I 的活性受損被認為與 PD 有極大關聯(Schapira et al., 1989)。另外有些活性異常的 kinase 也被證實參與 PD 疾病的形成。這些途徑可能藉由引發神經發炎反應，加速細胞凋亡、細胞自我吞噬、細胞內 Glutamate 產生的細胞毒殺等作用，最終導致神經細胞死亡而引起 PD 的發生(Schulz, 2008)。. 二、帕金森氏症的遺傳分析. 近幾年來，許多證據顯示遺傳因素在家族性帕金森氏症上扮演重要的角色，家族性帕金森氏症病人約佔所有 PD 患者的 5~10%，且這些家族性帕金森氏症患者發病時通常較年輕，屬於早發型帕金森氏症 (EOPD，發病年齡＜50) (Elbaz et al., 1999)，病程進展較快且臨床上及病理上的特徵都較不典型(Bertram et al., 2005)。此外，在多個 PD 家族研究也發現兄弟姐妹中罹患 PD 的風險與正常人相比有顯著的提升 (Lazzarini et al., 1994; Payami et al., 1994)。研究的證據指出，遺傳基因在此疾病的致病機轉上佔有重要的角色(Lev and Melamed, 2001)。直至目前為止，至少已有數個基因座被發現和帕金森氏症相關，且部 4.

(17) 分的致病基因也已被確認(表一) (Belin and Westerlund, 2008)，包括 4q21-23 的 α-synuclein (PARK1) (Polymeropoulos et al., 1997) 、 6q25.2-27 的 Parkin (PARK2) (Kitada et al., 1998)、4p14 的 UCHL1 (PARK5) (Leroy et al., 1998a)、1p35-p36 的 PINK1 (PARK6) (Hatano et al., 2004)、1p36 的 DJ-1 (PARK7) (Bonifati et al., 2003)及 12p11.2-q13.1 的 LRRK2 (PARK8) (Zimprich et al., 2004)、1p35-p36 的 ATP13A2 (PARK9) (Schultheis et al., 2004) 以及 2p12 的 HTRA2 (PARK13) (Gray et al., 2000)。其中，PARK1、PARK5 與 PARK8 基因突變與體染色體顯性遺傳的帕金森氏症 (autosomal dominant Parkinson's Disease；簡稱 ADPD)相關；Parkin、PINK1 及 DJ-1 基因突變則與體染色體隱性遺傳的青少年型帕金森氏症候群 (autosomal recessive juvenile Parkinsonism；簡稱 ARJP)相關(reviewed by Wood-Kaczmar et al., 2006)。. 三、Parkin 基因. 體染色體隱性遺傳的青少年型帕金森氏症候群於 1973 年首先於日本被 Yamamura 等人描述(Yamamura et al., 1973)，Parkin 基因的突變為目前引起 ARJP 最常見的基因。Parkin 基因缺陷所致的 ARJP，患者發病年齡通常在 40 歲之前，然而臨床病徵卻與其他 PD 患者相 5.

(18) 似，並且對 L-dopa 的治療有極為明顯的療效，神經元喪失及神經膠質過多局限於黑質及 locus ceruleus，不同於一般 PD 的是神經病理學上並無 Lewy Body 的出現(Kitada et al., 1998; Lucking et al., 1998, 2000)。. (一) Parkin 的構造與表現 Parkin 基因長度約 1.4 Mb，具有 12 個表現子，譯碼出一分子量約為 52 kDa、共 465 個胺基酸組成的蛋白質(Kitada et al., 1998)。Parkin 蛋白在人類許多組織中都有表現，尤其以腦部黑質神經元的細胞突起與細胞本體處的轉錄最為豐富。 Parkin 蛋白質的結構主要由 N 端的一個 UBL (ubiquitin-like domain)、C 端的二個被 IBR (in-between RING) domain 所分隔開的 RING (rare interesting gene) finger domains (RING1 及 RING2)，以及一個銜接 UBL 及 RING1 的 UPD (unique Parkin domain)所構成(Kitada et al., 1998; Morett and Bork, 1999; Kahle et al., 2000) (圖一 A)。 RING1-IBR-RING2 結構負責與 E2 鍵結，RING-IBR-RING (RBR)的結構僅在真核細胞中被發現且具有高度保留性(Beasley et al., 2007)。研究 IBR 的三級結構發現 IBR domain 有二個鋅的結合部位 (Zinc-binding sites)，鋅的結合對 IBR domain 的正確摺疊極為重要，. 6.

(19) 正確摺疊的 IBR domain 是適當的蛋白間的交互作用以及進行 ubiquitination 時所必需的(Beasley et al., 2007)。UBL-UPD 結構則是負責目標蛋白質的辨識及鍵結。當 Parkin 基因突變使 RING1-IBR-RING2 及 UBL-UPD 的結構改變而無法與 E2 及目標蛋白質鍵結時，Ubiquitination 運作機制可能受阻，使得目標蛋白質無法被 26S proteasome 分解，因此造成目標蛋白質不正常累積而導致神經元細胞的死亡。. (二) Parkin的功能從蛋白質結構來看， Parkin 基因所轉錄的蛋白質與 UPS (Ubiquitin-Proteasome System)有關，具有E3 ubiquitin ligase的功能 (Tanaka et al., 2001)，E3在UPS作用中擔任專一性地辨識受質蛋白，並將ubiquitin從E2結合酶(conjugating enzyme)催化轉移到受質蛋白上 (Hochstrasser, 2006) (圖一A)。研究顯示Parkin基因突變的ARJP患者失去ubiquitin ligase的活性導致蛋白堆積，引起選擇性的神經細胞死亡但並無Lewy Body的出現(Shimura et al., 2000)。近來的研究也顯示，正在進行細胞分裂的SH-SY5Y細胞中，Parkin會進入粒線體中。Parkin 可以強化粒線體DNA的轉錄及複製並促使粒線體進行分化，當Parkin gene發生突變時則會使進入粒線體的Parkin蛋白減少(Kuroda et al.,. 7.

(20) 2006)。此外Parkin也參與了粒線體型態的調控(Poole et al., 2008)。. (三) Parkin 基因變異與帕金森氏症有關 Parkin 的突變研究，最早是在日本 ARJP 家族中發現表現子 3~7 的缺失突變及 T240R、Q311X 點突變(Hattori et al., 1998a, 1998b; Kitada et al., 1998)。之後，針對不同族群 Parkin 的突變分析陸續被報導(Brice et al., 1998; Leroy et al., 1998b; Lucking et al., 1998, 2000; Tassin et al., 1998; Nisipeanuet al., 1999)。目前，報導過的 Parkin 基因突變包括表現子缺失(deletion)、重複(duplication)、插入(insertion)、錯譯突變(missense mutation)、無意義突變(nonsense mutation)、剪接位突變(alternative splicing site mutation)等(The human Gene Mutation Database, http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/- gene.php?gene=PARK2) 。圖一 B 顯示已被報導過的 Parkin 突變在蛋白質結構上的相對位置 (Mandemakers et al., 2007)。在許多 Parkin 突變研究中發現，PD 病人若只有一個等位基因缺失，會有遺傳上的「半不足性」 (haploinsufficiency)，造成蛋白質的表現量或酵素活性只有正常人的一半，雖不至於直接造成疾病，卻可能有較高的罹病風險(West et al., 2002)，此可能為引發早發性 PD 原因。. 四、HTRA2 基因 8.

(21) HTRA2 (high temperature requirement A2)是一種粒線體的 serine protease，與細胞執行計畫性的細胞死亡(programmed cell death)或稱作細胞凋亡(apoptosis)有關，近來的研究顯示 HTRA2 基因的突變可能會增加偶發性 PD 罹病的風險(Strauss et al., 2005)。. (一) HTRA2 的構造與表現 HTRA2 基因長度約 4.0 kb，具有 8 個表現子，譯碼出一分子量約為 50 kDa、共 458 個胺基酸組成的 preprotein (Gray et al., 2000)。 HTRA2 蛋白在人類細胞中的內質網、粒線體以及細胞核都有出現，當細胞執行細胞凋亡時，HTRA2 會由粒線體釋放到細胞質液中，藉由與 IAP (inhibitors of apoptotic protein) 的結合，來促進依賴 cytochrome c 的 caspase 活化路徑，造成細胞凋亡。 HTRA2 preprotein 的結構(圖二 A)主要由 mitochondrial targeting sequence (MTS, 胺基酸 1-40)、transmembrane domain (TM, 胺基酸 105-123 )、IAP (inhibitors of apoptotic protein) binding motif (IBM, 胺基酸 134-137, AVPS)、serine protease domain (胺基酸 166-342)以及 PDZ domain (胺基酸 364-445)所組成。Serine protease domain 的活性部位包含由 His198、Asp228、Ser306 所組成的 catalytic triad，PDZ domain 則媒介蛋白間的交互作用(Seong et al., 2004)。 9.

(22) (二) HTRA2 的功能從蛋白質結構來看，HTRA2 基因所轉錄的蛋白質與粒線體進行細胞凋亡的過程有關。研究顯示 full-length 的 preprotein 進入粒線體後，Hax1 (Bcl 2-family-related protein，為壓制淋巴球及神經元進行細胞凋亡所必需)會將 HTRA2 proprotein (已切除 N 端 31 個胺基酸)呈獻給粒線體的 Parl protease，加速 HTRA2 proprotein 的 autocatalytic processing，再切除 N 端 102 個胺基酸，成為具有活性的 mature HTRA2 protein，並立即進入粒線體膜間腔(intermembrane space)保護細胞免於進行細胞凋亡(Chao et al., 2008)。但是一旦細胞受到各種細胞凋亡的刺激及粒線體功能受損時，HTRA2 會由粒線體釋放到細胞質液 (cytosol)中，藉由抑制 IAP 的活性來促進依賴 cytochrome c 的 caspase 活化路徑，造成細胞凋亡(Suzuki et al., 2001)。. (三) HTRA2 基因變異與帕金森氏症有關 HTRA2 的突變研究，最早是在德國 4 個偶發性 PD 患者中發現一個異型合子的錯譯突變 G399S。另外也發現一個多型性點 A141S 的改變，此改變頻率在 PD 患者中明顯比正常人高(P < 0.05)，顯示與罹患 PD 有關(Strauss et al., 2005)。此二種突變皆會使 HTRA2 蛋白喪失正常功能，在受到壓力的環境下細胞死亡會增加。在 2008. 10.

(23) 年，Bogaerts et al. (圖二 B)報導一個新發現的錯譯突變 R404W，此突變可能會將 HTRA2 凍結為不活化的型式。. (四) HTRA2 與其它神經退化性疾病有一些證據支持 HTRA2 在其它神經退化性疾病中可能扮演特定角色，這些證據包括 HTRA2 被發現會與 presenilin-1 產生交互作用 (Gupta et al., 2004)。HTRA2 也會與 β-amyloid 產生作用(Park et al., 2004)。此外 HTRA2 也會累積在 PD、DLB、MSA 等疾病腦中含有 α-synuclein 的包涵體處，暗示 HTRA2 可能與 α-synucleinopathies 的致病原因有關(Kawamoto et al., 2008)。. 11.

(24) 貳、研究目的. 帕金森氏症大約對百分之一 65 歲以上的人口造成影響，已逐漸成為全球性老年化社會的重大醫療保健課題，因此各方對帕金森氏症致病機轉的相關研究亦是刻不容緩。針對台灣族群的 PD 患者進行相關致病基因的遺傳分析與功能研究，不但可以建立台灣 PD 族群的分子遺傳資料庫，也可以作為提供臨床上診斷、諮詢及疾病治療的參考。先前本實驗室對 PD 患者 cDNA 樣品進行 Parkin 基因突變的篩檢 (管, 2007)，本研究將繼續對新蒐集的 PD 樣品進行 Parkin cDNA 定序，並進一步對所有篩檢到的變異，進行病例-對照組分析，同時也利用攜帶 Ex5del 缺失突變的淋巴細胞株進行粒線體功能研究。由於未曾有台灣 PD 病患的 HTRA2 基因突變研究被報導，本研究亦利用 cDNA 定序進行 HTRA2 基因突變的分析，並對所找到的 R36W、 T215M 變異做 HTRA2 cDNA 轉染的功能研究。. 12.

(25) 參、研究材料與方法. 一、研究樣品. 分子遺傳研究所使用的 PD 患者與正常人血液的基因組 DNA 與 cDNA 樣品均由林口長庚醫院神經內科所提供。所有患者經吳逸如醫師及陳瓊美醫師的診斷後，徵求患者或家屬同意始進行血液採樣。PD 樣品選取的標準為：含有兩個以上 PD 典型症狀包括靜止性震顫、僵直、姿態反射障礙、和運動遲緩。然而，任何可能因腦外傷、腦炎或服用抗精神性藥物等已知因子所引起帕金森氏症候群的個體則排除在外。同時也蒐集年齡、性別比率相當的正常人之血液樣品，作為控制組以供對照。. 二、細胞培養. 進行基因功能檢測實驗則是採用HEK-293T、SK-N-SH細胞以及林口長庚醫院神經內科所提供的PD患者與正常人淋巴細胞株進行實驗。細胞皆培養於37℃、5% CO2且溼度穩定之細胞培養箱中， HEK-293T及SK-N-SH細胞培養液為包含10% FBS、1.0 mM sodium pyruvate、1.5 g/l sodium bicarbonate、100 U/ml penicillin、100 U/ml 13.

(26) streptomycin的DMEM medium (Gibco)，細胞以1:5或1:10進行繼代培養。PD患者與正常人淋巴細胞株培養液為包含20% FBS、1.0 mM sodium pyruvate、1.5 g/l sodium bicarbonate、100 U/ml penicillin、100 U/ml streptomycin的RPMI 1640 medium (Gibco)，每隔一至兩天添加 5 或 10 ml 新鮮培養液，每兩週進行 1:3-1:4 繼代培養，以 1,200 rpm，離心 5 分鐘，去除上清液，收集細胞換至新 T75 細胞培養瓶。. 三、西方轉漬法(Western blot). 蛋白質先經 Bio-Rad Protein Assay 定量後，取等量蛋白質加入適量 sample buffer (50 mM Tris, pH6.8 - 2% SDS - 10% glycerol - 2.5% β-mercaptoethanol - 0.005% bromophenolblue)，在沸水中預熱 5~10 分鐘後取出，置於冰上準備進行 10% SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE) 以分離蛋白質。待電泳完，再利用 XCell II TM Blot Module (Invitrogen) 及 transfer buffer (25 mM Tris - 0.2 M glycine - 20% methanol)將蛋白轉漬至硝化纖維膜(nitrocellulose membrane, Whatman)上。之後浸泡於 blocking buffer (10% skim milk - PBS)置 4℃中隔夜。Blocking 完成後以 wash buffer (10 mM Tris-HCl pH8.0 - 0.05% Tween 20)清洗硝化纖維膜三次，每次 15 分鐘。加入一級抗體於室溫下作用 2 小時後，以 wash buffer 清洗膜三次，每次 15 分鐘。接著加入 horseradish peroxidase 14.

(27) (HRP) conjugated 二級抗體，於室溫作用 1.5 小時。之後以 wash buffer 清洗膜三次，每次 15 分鐘。最後加入冷光呈色試劑(Millipore)於膜上，以冷光儀及 ImagerReader LAS-3000 軟體偵測蛋白表現。蛋白質萃取實驗重複進行兩次，每次萃取的蛋白液重複兩次西方轉漬分析。. 四、Parkin cDNA 增幅及定序. 設計引子對(表二)，針對 PD 患者的 Parkin Exons 1~7 及 Exons 7~12 進行 cDNA 增幅及定序。取 100 ng 的 cDNA，置於 25 μl 的 PCR 反應中，反應溶液中包括 50 ng 的引子對、1.5 mM MgCl2、200 μM dNTPs、0.5 U 熱穩定性 DNA 聚合酶(Promega)。PCR 以熱循環儀 (OmniGene, HYBRID)進行，反應條件為 94℃作用 6 分鐘使 DNA 雙股裂解，接著進行裂解溫度 94℃ 30 秒、煉合溫度 54/58℃ 45 秒及延長溫度 72℃ 90 秒的 55 個循環，最後以 72℃作用 10 分鐘。反應完畢後以洋菜膠電泳分離、純化(gel extraction kit，Viogene)後，以雷射螢光 DNA 自動定序儀進行定序分析(源資國際生物科技公司)。. 五、Parkin 基因 S167N、V380L 多型性與台灣族群 PD 感受性分析. 將 PD 患者(506 位)及正常人族群(508 位)的基因組 DNA 樣本進 15.

(28) 行 PCR-RFLP，將所得到的結果統計後再進行 Parkin 基因多型性與台灣族群 PD 感受性之分析。. (一)聚合酶連鎖反應(PCR) 取 100 ng 的基因組 DNA，置於 25 μl 的 PCR 反應中，放大 Parkin 基因的 S167N 與 V380L 多型性點所在的表現子片段。PCR 反應的引子對及條件列於表三。PCR 產物以 1.4%洋菜膠體電泳檢查片段大小。. (二)限制酶片段長度多型性分析(RFLP) 取 2 μl PCR 產物，加入表三所列針對各多型性點所設計的限制酵素，與反應溶液均勻混合(10 µl 切割反應)，在水浴槽中反應 2 小時到隔夜。之後以 1.6 ~ 2.0%洋菜膠體電泳檢查片段大小，檢查各樣品的多型性基因型。. (三)統計分析計算各樣品群多型性基因型數目，利用 Chi-square test (χ2)檢測各多型性點是否符合哈溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)，並比較多型性基因型分佈、等位基因頻率，在帕金森氏症族群與正常人族群間，是否有顯著差異。並使用 JMP 5.1 軟體計算出罹病的相對危險程度(Odds ratio)。 16.

(29) 六、台灣族群 Parkin 基因 R334C 突變檢測. 將 PD 患者(362 位)及正常人(226 位)的基因組 DNA 樣本使用 allele specific PCR 進行族群的 R334C 突變檢測。設計突變點 R334C (CGC＞TGC)專一增幅的正向引子(9F-3，表三)，其 3’端與變異點互補，與反向引子 9R 配對，來增幅含 R334C 突變點由正向引子 9F-3 到反向引子 9R 的片段(增幅片段 175 bp)。另一正向引子 9F 亦與反向引子 9R 配對，作為 PCR 反應的 internal control (增幅片段 278 bp)。每次 PCR 反應皆需要有正控制組(樣品 H496 經基因組 DNA 定序驗證為 R334C 異型合子變異)，引子的序列、增幅片段的長度及 PCR 反應的條件詳列於表三，PCR 的產物以 1.4%洋菜膠體電泳檢查。. 七、Parkin Ex5del 缺失突變淋巴細胞株的粒線體功能分析. 將 PD 患者與正常人淋巴細胞培養於培養瓶(1×107 cells in 10 ml medium)或 12 孔盤培養皿中(1×106 cells in 1 ml medium)。24 小時後，分別以 0、50、100 nM 濃度之 staurosporine 或去血清處理 24 小時，並進行下列實驗。每種藥物處理實驗進行三次，每次實驗進行二重複測量。. 17.

(30) (一) Caspase-3 活性分析將培養瓶中細胞混勻並離心收集細胞，以PBS清洗兩次，收集細胞 pellets 。利用 Caspase-3 Assay Kit, Fluorimetric (SIGMA) 偵測 caspase-3活性，活化的caspase-3切割受質Ac-DEVD-AMC後發出螢光，因此可利用偵測AMC的螢光量來推測細胞中活化的caspase-3之相對量，AMC的螢光量愈高顯示細胞中活化的caspase-3之相對量愈高。首先於細胞pellets中加入適當體積lysis buffer，於冰上作用15~20 分鐘後，利用液態氮連續冷凍解凍六次打破細胞以萃取蛋白質。4℃ 離心14,000 × g、10~15分鐘後取上清液。定量後取 25 µg置於96孔不透光黑盤中，加入Ac-DEVD-AMC受質在室溫下反應2~2.5小時後，利用螢光儀(Molecular Devices-Fluorescent microplate reader-Gemini XPS)以excitation 360 nm及emission 460 nm進行測試。. (二)粒線體膜電位分析將 12 孔盤培養皿中細胞混勻離心收集細胞，利用 JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit進行測試，加入JC-1試劑在37℃下反應15分鐘。離心400 × g、5分鐘後移除上清液，加入300 µl assay buffer將cell pellets懸浮後，取100 µl置於96孔不透光黑盤中，利用螢光儀(Molecular Devices-Fluorescent microplate reader-Gemini 18.

(31) XPS) 偵測紅螢光 (excitation 550 nm 、 emission 600 nm) 及綠螢光 (excitation 485 nm、emission 535 nm)。在健康的細胞中，JC-1染劑可以進入粒線體將粒線體染成紅色，而在進行細胞凋亡時粒線體膜電位崩解造成JC-1染劑無法進入粒線體，只能留在細胞質液中染成綠色。藉由計算紅螢光及綠螢光的比值可反應出細胞凋亡的程度及粒線體膜電位變化，當進行細胞凋亡時紅螢光及綠螢光的比值將呈現降低的趨勢。. (三)淋巴細胞的存活率分析將 12 孔盤培養皿中細胞混勻取 20 µl，和 20 µl 0.4% Trypan blue (Gibco)混合後，利用自動細胞計數器(Invitrogen)分別計算活細胞(亮) 及死細胞(藍色)數量來求得細胞的存活率。. 八、HTRA2 cDNA 增幅及定序. 設計引子對(表二)，增幅 HTRA2 cDNA。取 100 ng 的 cDNA，置於 25 μl 的 PCR 反應中，反應溶液中包括 50 ng 的引子對、1.5 mM MgCl2、200 μM dNTPs、0.5 U 熱穩定性 DNA 聚合酶(Takara La Taq)。 PCR 以熱循環儀(OmniGene, HYBRID)進行，反應條件為 94℃作用 6 分鐘使 DNA 雙股裂解，接著進行裂解溫度 94℃ 30 秒、煉合溫度 66℃ 19.

(32) 60 秒及延長溫度 72℃ 60 秒的 55 個循環，最後以 72℃作用 10 分鐘。 PCR 產物的洋菜膠電泳分離、純化、定序如上述(四、Parkin cDNA 增幅及定序)。. 九、台灣 PD 族群 HTRA2 基因 R36W 及 T215M 突變檢測. 將 PD 患者的基因組 DNA 樣本使用 PCR-RFLP 進行族群的 R36W、T215M 突變檢測。. (一)聚合酶連鎖反應(PCR) 取 100 ng 的基因組 DNA，置於 25 μl 的 PCR 反應中，放大 HTRA2 基因 R36W 及 T215M 突變所在的表現子片段。PCR 反應的引子對及條件列於表四。PCR 產物以 1.4%洋菜膠體電泳檢查片段大小。. (二)限制酶片段長度多型性分析(RFLP) 取 2 μl PCR 產物，加入表四所列針對各突變點所設計的限制酵素，與反應溶液均勻混合(10 µl 切割反應)，在水浴槽中反應 2 小時到隔夜。之後以 1.6 ~ 2.0%洋菜膠體電泳檢查片段大小，進行族群的突變檢測。. 20.

(33) (三) R36W 突變的家族分析針對 R36W 突變的 PD 患者(H1663)收集其家人(父親、母親及妹妹)基因組 DNA，使用 PCR-RFLP 進行家族的 R36W 突變檢測。. 十、HTRA2 基因 R36W 及 T215M 突變的功能分析. (一) pEGFP-N1-HTRA2 重組質體的建構利用 R36W 及 T215M 異型合子的 PD 病人 cDNA，進行 PCR，增幅 HTRA2 cDNA 序列，其中反向引子(表二)的設計用以移除 HTRA2 cDNA 序列上的終止密碼並引入 KpnI 限制酵素切位，以利於之後將此 HTRA2 cDNA 序列接到 EGFP-N1 質體。上述 PCR 增幅的 HTRA2 cDNA 片段經純化後接合入 pGEM-T Easy 載體，並以電穿孔 (electroporation). (BIO-RAD,. GENE. PULSERII) 方式轉形. (transformation)入 E. coli 轉形勝任細胞內。挑選單一菌落，以鹼性溶菌法(Sambrook et al., 1989)小量抽取質體 DNA，進行限制酵素切割圖譜分析與 cDNA 定序。確認無誤後，利用 Plasmid Midi Kit (Geneaid) 大量製備選殖成功的野生型及 R36W、T215M 突變型重組質體 DNA。再以 KpnI 切出 HTRA2 cDNA，純化後置入 pEGFP-N1 載體的 KpnI 切位。接合好的 pEGFP-N1-HTRA2 重組 DNA 的轉形、質體 DNA 小量抽取如上述。經 KpnI、HpaII、TaiI 限制酵素切割圖譜分析確認後， 21.

(34) 進行質體 DNA 的大量製備與保存，其中 T215M 突變型重組質體 cDNA 構築及限制酵素切割圖譜分析由大學部學妹謝謹霞所完成。. (二)轉染(transfection) 接種 5×106 (HEK-293T)或 3×106 (SK-N-SH)細胞至 10 cm 培養皿中。第二天，進行 EGFP-N1 (載體)、pEGFP-N1-HTRA2/WT (野生型基因)及 pEGFP-N1-HTRA2/R36W、pEGFP-N1-HTRA2/T215M (突變型基因)的轉染。取 36 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，加入 1.5 ml 去血清且不含抗生素之 OptiMEM 培養液(Gibco)，混合均勻。再取 36 μg 質體 DNA，加入 1.5 ml OptiMEM 培養液，混合均勻。接著將已作用 5 分鐘的 Lipofectamine - OptiMEM 混合液加入質體 DNA OptiMEM 混合液。20 分鐘後加入上述 3 ml 的 Lipofectamine - 質體 DNA - OptiMEM 混合液到上述 10 cm 培養皿的細胞中，置於 37℃、 5% CO2 且溼度穩定之細胞培養箱中培養 6 小時。之後換掉含 Lipofectamine 的培養液，改以完全培養液培養二天。另外，以不含質體 DNA 的轉染當做轉染控制組。. (三)次細胞分層及西方轉漬分析轉染二天後離心收集細胞，以 PBS 清洗兩次，收集細胞 pellets。加入適量不含清潔劑的 hypotonic buffer 置於冰上作用 30 分鐘後，利 22.

(35) 用 26G 的針筒來回推拉 25~30 次直到 75~80%的細胞已經打破(取 2~3 µl 細胞懸浮液利用顯微鏡觀察)。離心 1,000 × g、10 分鐘後移除 pellets (含未破細胞及細胞核)，將上清液離心 10,000 × g、15~20 分鐘後，分別蒐集上清液及 pellets。上清液以 14,000 × g 離心 15~20 分鐘，所得上清液即為細胞質液 fraction。Pellets 以 hypotonic buffer 清洗數次，每次以 10,000 × g 離心 15~20 分鐘，最後保留的 pellets 即為粒線體。加入 50 µl RIPA buffer 至粒線體 pellets，超音波震盪 30 下後，以 14,000 × g 離心 15~20 分鐘，所得上清液即為粒線體 fraction。細胞質液 fraction 及粒線體 fraction 經蛋白質定量後，分別取 20 µg 細胞質液 fraction 及 5 µg 粒線體 fraction，利用西方轉漬及 EGFP 抗體，分析細胞中野生型與突變型 HTRA2-EGFP 融合蛋白表現的情形。. (四)螢光顯微鏡觀察接種 1×105 HEK-293T 及 SK-N-SH 細胞至包含 coverslips [poly-L-lysine (100 μg/ml, Sigma)處理過]的 12 孔細胞培養盤中。第二天進行 EGFP-N1 (載體)、pEGFP-N1-HTRA2/WT (野生型基因)及 pEGFP-N1-HTRA2/R36W、pEGFP-N1-HTRA2/T215M (突變型基因) 的轉染，配製 Lipofectamine 2000 (3 μl) - OptiMEM (100 μl)及質體 DNA (3 μg) - OptiMEM (100 μl)溶液。Lipofectamine - OptiMEM 溶液. 23.

(36) 混勻 5 分鐘後加入質體 DNA - OptiMEM 溶液。20 分鐘後加到 12 孔盤細胞中。培養 6 小時後改以完全培養液培養。二天後進行染色，其方法如下：先將 400 nM mitotracker red 染劑加到培養液中，37℃避光作用 60 分鐘。mitotracker red 染劑作用 40 分鐘後同時加入 0.1 μg/ml Hoechst33342 核染劑到培養液作用 20 分鐘。染色完成後移除培養液，將細胞以 PBS 潤洗兩次後直接使用 Leica TCS SP2 螢光顯微鏡觀察細胞形態、綠螢光融合蛋白的表現情形與表現位置等。. 24.

(37) 肆、結果. 一、PD 患者 Parkin 基因突變. 針對 35 位帕金森氏症患者的 Parkin cDNA 分表現子 1~7、表現子 7~12 兩段進行 PCR 增幅，純化後進行定序分析。除了先前的 S167N (AGC>AAC)多型性(表現子 4)、Ex5del 缺失突變(表現子 5)、R334C (CGC>TGC)突變(表現子 9)、V380L (GTA>CTA)多型性(表現子 10) (管, 2007)外，亦發現 Ex2-3del (表現子 2~3)及新穎的 c.1084intron+ (插入子 9)插入突變(圖三~五)。. (一) S167N G>A 與 V380L G>C 多型性表現子 4 的 S167N (AGC>AAC)多型性的異型合子定序結果顯示於圖三 A 左。此多型性會使限制酶 AlwNI (CAGNNNCTG)切位消失，包含 S167N 多型性等位基因因為切位喪失，含多型性之表現子 4 片段經切割後，168 bp 和 98 bp 兩片段轉變為 266 bp 的片段(圖三 A 右)。表現子 10 的 V380L (GTA>CTA)多型性的異型合子定序結果顯示於圖三 B 左。此多型性會新增限制酶 Bsp1286I (GDGCHC)切位，包含 V380L 多型性的表現子 10 片段經切割後，會由 165 bp 的片段被切割成 108 bp 和 57 bp 兩片段(圖三 B 右)。S167N 與 V380L 多型性的族 25.

(38) 群分析，共檢測了 506 位帕金森氏症患者與 508 位正常人，結果詳述於後。. (二) R334C C>T 突變表現子 9 的 R334C (CGC>TGC)突變的定序顯示於圖四 A 左。此突變未新增任何限制酶切位，故設計突變基因專一增幅聚合酶連鎖反應，來做突變的確認及族群分析。突變基因專一增幅的產物為 175 bp，PCR 反應正控制組的產物為 278 bp (表三)。帕金森氏症患者 H496 為 R334C 的異型合子，其 PCR 產物同時出現 278、175 bp 片段(圖四 A 右，lane CT)。本研究檢測 362 位帕金森氏症患者與 226 位正常人的表現子 9 片段，除 H496 外，並未於其他樣品發現此突變。. (三) Ex2-3del、Ex5del 缺失突變帕金森氏症患者 H61、H1534 的定序顯示於圖四 B。將 Parkin cDNA 定序結果與 NCBI 所列的 Parkin mRNA 序列(NM_004562)互相比對後發現帕金森氏症患者 H61 為表現子 2~3 缺失突變、患者 H1534 則為表現子 5 缺失突變。. (四) c.1084intron+插入突變帕金森氏症患者 H1282 內含子 9 插入突變的定序顯示於圖五 A。 26.

(39) 此插入突變與內含子 9 上的-6g>a (IVS9 g>a) 的多型性點相關(圖五 B 左)。此多型性會使限制酶 XhoI (CTCGAG)切位消失，包含-6g>a 多型性等位基因因切位喪失，含多型性之內含子 9 片段經切割後，199 bp 和 101 bp 兩片段轉變為 300 bp 的片段(圖五 B 右)。利用線上搜尋進行 Alternative Splice Site Predictor (ASSP; http://es.embnet.org/~mwang /assp.html)，由結果發現 IVS9 (-6g>a)的多型性點會提高此內含子 9 插入序列其 cryptic splice acceptor site 的分數(由 5.795 提高至 6.092)(圖五 C)，可能是造成內含子 9 插入突變機率增加的主要原因。. 二、Parkin 基因 S167N、V380L 多型性與台灣族群 PD 感受性. PD 患者與正常人族群的 parkin 基因 S167N 與 V380L 多型性分析結果詳見於表五。依等位基因頻率及樣品總數(觀察值)，算出期望之基因數(預期值)，經 chi-square 分析後，兩多型性遺傳情形皆處於哈溫平衡。結果顯示 V380L 之 C 等位基因頻率在病人族群中明顯較正常人族群低(7.9 vs. 10.7%, P = 0.037)，且和低帕金森氏症感受性相關(odds ratio: 0.71, 95% confidence interval: 0.53-0.97, P = 0.029)。. 三、Parkin Ex5del 缺失突變淋巴細胞株的粒線體功能分析. 27.

(40) (一) Caspase-3 活性分析分別以 0、50、100 nM 濃度之 staurosporine 或去血清處理 PD 患者與正常人淋巴細胞 24 小時，進行 Caspase-3 活性分析，結果顯示於圖六。正常人淋巴細胞株經 0、50、100 nM staurosporine 或去血清處理後，Caspase-3 活性分別是 0.54、1.51、1.86、0.58 μM，PD 病人淋巴細胞株則分別是 1.21、4.62、4.87、1.62 μM，不論是在未處理或各種處理下，病人淋巴細胞株的 Caspase-3 活性都顯著高於正常人淋巴細胞(P = 0.000~0.027)(圖六 A)。病人淋巴細胞株不論是在何種處理下，Caspase-3 活性都顯著高於沒有處理的細胞(P = 0.000~0.004)。正常人淋巴細胞株去血清處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.543)，但正常人淋巴細胞株在 50、100 nM staurosporine 處理下，Caspase-3 活性則顯著高於沒有處理的細胞(P = 0.000~0.009)(圖六 B)。. (二)粒線體膜電位分析依上述[三-(一)]方式處理 PD 患者與正常人淋巴細胞 24 小時，利用 JC-1 red/green fluorescence 比值進行粒線體膜電位分析，結果顯示於圖七。正常人淋巴細胞株經 0、50、100 nM staurosporine 或去血清處理後，red/green fluorescence 比值分別是 11.37、9.12、6.27、12.33， PD 病人淋巴細胞株則分別是 7.67、4.42、4.20、7.02，不論是在未處. 28.

(41) 理或各種處理下，病人淋巴細胞株的 red/green fluorescence 比值都顯著低於正常人淋巴細胞(P = 0.004~0.008) (圖七 A)。病人淋巴細胞株在 50、100 nM staurosporine 處理下，red/green fluorescence 比值都顯著低於沒有處理的細胞(P = 0.000)，病人淋巴細胞株去血清處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.310)。正常人淋巴細胞株在 50、100 nM staurosporine 處理下，red/green fluorescence 比值都顯著低於沒有處理的細胞(P = 0.002~0.036)，正常人淋巴細胞株去血清處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.315) (圖七 B)。. (三)淋巴細胞的存活率分析依上述[三-(一)]方式處理 PD 患者與正常人淋巴細胞 24 小時，利用 Trypan blue 進行細胞的存活率分析，結果顯示於圖八。正常人淋巴細胞株經 0、50、100 nM staurosporine 或去血清處理後，細胞存活率分別是 86.8、78.2、75.7、85.2 %，PD 病人淋巴細胞株則分別是 79.8、 63.7、51.2、71.8 %，在 50、100 nM staurosporine 或去血清處理下，病人淋巴細胞株的細胞存活率都顯著低於正常人淋巴細胞 (P = 0.025~0.047)，在未處理下，病人淋巴細胞株的細胞存活率與正常人淋巴細胞間則未見顯著差異(P = 0.167) (圖八 A)。病人淋巴細胞株在 50、100 nM staurosporine 處理下，細胞存活率都顯著低於沒有處理的. 29.

(42) 細胞(P = 0.002~0.026)，病人淋巴細胞株去血清處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.091)。正常人淋巴細胞株各種處理及未處理間皆未見顯著差異(P = 0.099~0.747) (圖八 B)。. 四、PD 患者 HTRA2 基因突變. PD 患者(87 位)包含表現子 1~8 的 cDNA 經 PCR 增幅、純化後進行定序分析。結果發現表現子 1 的 R36W (CGG>TGG)、表現子 2 的 T215M (ACG>ATG)等改變胺基酸的變異(圖九)。. (一) R36W C>T 突變帕金森氏症患者 H1663 表現子 1 的 R36W (CGG>TGG)突變的異型合子定序結果顯示於圖九 A 左。此多型性會使限制酶 HpaII (CCGG) 切位消失，包含 R36W 突變等位基因因為切位喪失，含突變之表現子 1 片段經切割後，183 bp 和 34 bp 兩片段轉變為 217 bp 的片段(圖九 A 右)。本研究檢測 461 位帕金森氏症患者 R36W 突變情形，結果共發現 2 位 PD 患者(H1663、H378)有 R36W 突變。. (二) T215M C>T 突變帕金森氏症患者 H570 表現子 2 的 T215M (ACG>ATG)突變的異 30.

(43) 型合子定序結果顯示於圖九 B 左。此多型性會使限制酶 TaiI (ACGT ) 切位消失，包含 T215M 突變等位基因因切位喪失，含突變之表現子 2 片段經切割後，170 bp 和 105 bp 兩片段轉變為 275 bp 的片段(圖九 B 右)。本研究檢測 476 位帕金森氏症患者的表現子 2 片段，除 H570 外，並未於其他 PD 樣品發現此突變。. (三) R36W 突變的家族分析將 R36W 突變的 PD 患者 H1663 及其家人(父親、母親及妹妹)基因組 DNA 使用 PCR-RFLP 進行家族的 R36W 突變檢測。結果顯示患者與其母親皆為異型合子突變，而其父親與妹妹則不帶此突變(圖十)。. 五、HTRA2 突變之功能分析. (一) EGFP 標記的 HTRA2 cDNA 選殖野生型(WT)及 R36W 突變的 cDNA，經 PCR 移除終止密碼並引入 KpnI 限制酵素切位後，置入 EGFP-N1 質體(圖十一)。經 KpnI、HpaII 限制酵素切割圖譜分析確認選殖成功的野生型及 R36W 重組質體(圖十二)。. 31.

(44) (二) EGFP 標記的 HTRA2 cDNA 表現利用 Lipofectamine 將野生型及 R36W、T215M 突變(由大學部學妹謝謹霞完成 ) 的 HTRA2-EGFP 重組質體轉移入 HEK-293T 及 SK-N-SH 細胞表現。二天後蒐集細胞，利用 GFP 抗體進行西方轉漬分析，觀察細胞中 HTRA2-EGFP 融合蛋白表現情形，結果顯示於圖十三。兩種細胞不論是總蛋白(上)或是細胞質液與粒線體的次細胞分層蛋白 ( 下 ) ，皆可偵測到約 70 kDa 的前軀及 61 kDa 的成熟 HTRA2-EGFP 融合蛋白，而且總蛋白及次細胞分層蛋白中，R36W 突變型的 61 kDa 成熟蛋白表現量較野生型低，T215M 突變型則呈現異常的分子量變化。. (三) HTRA2-EGFP 融合蛋白的螢光顯微鏡觀察利用 Lipofectamine 將野生型及突變型 HTRA2-EGFP 重組質體轉移入 HEK-293T 及 SK-N-SH 細胞表現。二天後將細胞染色，步驟完成後使用 Leica TCS SP2 螢光顯微鏡觀察細胞形態、綠螢光融合蛋白的表現情形與表現位置等。結果顯示於圖十四。兩種細胞表現一致，野生型及 R36W、T215M 突變型 HTRA2-EGFP 融合蛋白細胞中表現位置相似，皆分佈在粒線體。. 六、突變及多型性的序列比對 32.

(45) (一) S167N、V380L 多型性及 R334C 突變的序列比對由 NCBI 搜尋各種哺乳動物 (Human 、 Pan troglodytes 、 Mus musculus、Rattus norvegicus) parkin 基因序列進行 S167N、V380L 多型性及 R334C 突變的序列比對，結果顯示於圖十五 A。僅 R334C 突變點在各物種間具有高度保留性。. (二) R36W 及 T215M 突變的序列比對由 NCBI 搜尋各種哺乳動物(Human、Bos taurus、Mus musculus、 Rattus norvegicus) HTRA2 基因序列進行 R36W、T215M 突變的序列比對，結果顯示於圖十五 B。R36W 及 T215M 突變點在各物種間皆具有高度保留性。. 33.

(46) 伍、討論. 一、Parkin 基因突變. Parkin 基因與青年型(ARJP)或早發性 PD 的相關性已在許多研究中被證實(Hedrich et al., 2004; Clark et al., 2007)，Parkin 基因突變的頻率在青年型 PD 患者中多達 50% (Lucking et al., 2000)，而台灣地區 Parkin 基因缺失突變的報導也顯示台灣族群 PD 患者存在 Parkin 基因的缺失變異(Lu et al., 2001; Wu et al., 2002; Shyu et al., 2005)，故本實驗延續先前的研究(管, 2007)，對長庚醫院提供之 PD 患者 cDNA 進行 Parkin 基因定序的工作。結果發現已報導過的表現子 4 的 S167N (AGC>AAC)、表現子 9 的 R334C (CGC>TGC)、表現子 10 的 V380L (GTA>CTA)等改變胺基酸的變異，Ex2-3del、Ex5del 缺失突變，及未報導過的 c.1084intron+插入突變。. (一) Ex2-3del、Ex5del 缺失突變 H61 為表現子 2~3 的異型合子缺失突變(Ex2-3del)，H1534 為表現子 5 的異型合子缺失突變(Ex5del) (圖四)。Ex2-3del 缺失突變推測會造成 Parkin 蛋白 N 端 UBL domain 135 個胺基酸被移除，Ex5del 缺失突變則是造成 Parkin 蛋白 UBL domain 及 RING1 domain 之間的區 34.

(47) 域上 28 個胺基酸被移除。雖然這兩個缺失突變並不會對 Parkin 蛋白 E3 ubiquitin ligase 的活性造成影響(Matsuda et al., 2006)，但 UBL-UPD 結構是負責目標蛋白的辨識及鍵結，因此這兩個缺失突變是否會影響 ubiquitinated 受質蛋白運送到 proteosome 的過程或是其生物功能上的意義仍有待進一步的研究。本實驗中發現的缺失突變皆為異型合子，即病人仍有一個正常的等位基因，故推測遺傳上的「半不足性」 (haploinsufficiency)，可能為致病的原因之一。. (二) R334C C>T 突變 H496 為 R334C 異型合子點突變。R334C 點突變位於 Parkin 蛋白的 IBR domain，此點突變最早在歐洲家族性 PD 中被發現(Lucking et al., 2000) 。蛋白質 domain 功能的研究顯示， IBR domain 在 ubiquitination 的過程中負責召募 ubiquitination 相關的蛋白質，如 E2 蛋白 UbcH7 或 UbcH8 (Beasley et al., 2007)。蛋白質構形的研究顯示，在水溶液中 IBR domain 會摺疊形成獨特的剪刀形(scissor-like)和鉸鏈形(GAG knuckle-like)鋅離子結合位(Beasley et al., 2007)。故 IBR domain 也像 zinc-binding motif 一樣需要 2 個鋅離子的存在幫助鍵結。而 R334C 的突變蛋白會造成 IBR domain 構形的重新排列或錯誤摺疊，因此 E2 結合蛋白與 Parkin 的結合會受影響，導致 ubiquitination. 35.

(48) 過程異常(Biswas et al., 2006)。此外 R334C 的突變也會造成 Parkin 蛋白溶解度降低並促使 Parkin 蛋白回收到 aggresome-like protein aggregates 中(Wang et al., 2005)。比較特別的是，此位 Parkin gene R334C 突變的 PD 患者(H496) 同時也具有帕金森氏症相關基因 LRRK2 G2385R 變異及 ATP13A2 A746T 變異，此三種變異的互相作用或許是影響患者提早發病的原因之一。. (三) c.1084intron+插入突變本研究由 Parkin cDNA 定序中發現一個新穎的 86-bp IVS9 insertion (c.1084intron+) (圖五 A)。此插入突變會在表現子 9 之後引入二個新的胺基酸及一個 TAA stop codon，產生縮短的(truncated) Parkin 蛋白，可能會導致 RING2-associated E3 活性減弱(Matsuda et al., 2006) 或是促使 truncated Parkin 蛋白回收到 aggresome-like structure 中(Henn et al., 2005)。基因組 DNA 定序發現此插入突變可能與 IVS9 g>a 多型性變異相關。c.1084intron+插入突變所產生的 truncated Parkin 蛋白，可能與正常的 Parkin 蛋白競爭受質蛋白，形成 dominant-negative 效應，因此 c.1084intron+表現量越多，帕金森氏症感受性就會越高。. (四) S167N、V380L 多型性與台灣族群 PD 感受性 36.

(49) 在歐洲族群 160 位 PD 及 160 位正常人的研究結果顯示，S167N 和 V380L 在患者及正常族群中的基因頻率相似(Wang et al., 1999)。後續針對華人偶發性 PD 進行此兩多型性點的頻率調查，結果亦一致(Hu et al., 2000; Oliveri et al., 2001)。本實驗對台灣 506 位 PD 患者與 508 個正常人進行 S167N 和 V380L 的多型性分析，結果經統計分析 167N 等位基因在患者及正常族群中的基因頻率相似。而 V380L 經統計分析則發現 V380L 異型合子具有低帕金森氏症感受性的趨勢，雖然結果與 Wang et al., 1999; Oliveri et al., 2001; Hu et al., 2000 的報導不同，但卻與 Lucking et al., 2003 所報導的 V380 同型合子與偶發性 PD 有顯著相關的結果一致，而且本實驗中 V380L 之 C 等位基因頻率在病人族群中明顯較正常人族群低(7.9 vs. 10.7%, P = 0.037)，且和低帕金森氏症感受性相關 (odds ratio: 0.71, 95% confidence interval: 0.53-0.97, P = 0.029)。另外 2008 年 Ros 等人的報導也指出 380Leu 與 tau 蛋白致病的 progressive supranuclear palsy 疾病之低感受性有關。. (五) Parkin Ex5del 缺失突變淋巴細胞株的粒線體功能分析近來的研究顯示，不論是在果蠅(Greene et al., 2003)或是哺乳類動物(Palacino et al., 2004)模式中，Parkin 在維持粒線體功能及防止氧化壓力方面也扮演重要的角色。此外，在與粒線體有關的細胞死亡. 37.

(50) 中，Parkin 也可以防止粒線體腫脹及細胞色素 c 的釋放(Darios et al., 2003)。本實驗利用 Parkin Ex5del 缺失突變淋巴細胞株與正常人淋巴細胞株進行粒線體功能分析，實驗包括 Caspase-3 活性分析、Trypan blue 檢測細胞存活率及粒線體膜電位分析。 Caspase-3 活性分析結果顯示，不論是在未處理或各種處理下，病人淋巴細胞株的 Caspase-3 活性都顯著高於正常人淋巴細胞(P = 0.000~0.027)( 圖六 A) 。病人淋巴細胞株不論是在何種處理下， Caspase-3 活性都顯著高於沒有處理的細胞(P = 0.000~0.004)。正常人淋巴細胞株去血清處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.543)，但正常人淋巴細胞株在 50、100 nM staurosporine 處理下，Caspase-3 活性則顯著高於沒有處理的細胞(P = 0.000~0.009)(圖六 B)。粒線體膜電位分析結果顯示，不論是在未處理或各種處理下，病人淋巴細胞株的 JC-1 red/green fluorescence 比值都顯著低於正常人淋巴細胞(P = 0.004~0.008) (圖七 A)。病人淋巴細胞株在 50、100 nM staurosporine 處理下，red/green fluorescence 比值都顯著低於沒有處理的細胞(P = 0.000)，病人淋巴細胞株去血清處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.310)。正常人淋巴細胞株在 50、100 nM staurosporine 處理下，red/green fluorescence 比值都顯著低於沒有處理的細胞(P = 0.002~0.036)，正常人淋巴細胞株去血清處理及未處理間則未見顯著 38.

(51) 差異(P = 0.315) (圖七 B)。淋巴細胞的存活率分析結果顯示，在 50、100 nM staurosporine 或去血清處理下，病人淋巴細胞株的細胞存活率都顯著低於正常人淋巴細胞(P = 0.025~0.047)，在未處理下，病人淋巴細胞株的細胞存活率與正常人淋巴細胞間則未見顯著差異(P = 0.167) (圖八 A)。病人淋巴細胞株在 50、100 nM staurosporine 處理下，細胞存活率都顯著低於沒有處理的細胞(P = 0.002~0.026)，病人淋巴細胞株去血清處理及未處理間則未見顯著差異(P = 0.091)。正常人淋巴細胞株各種處理及未處理間皆未見顯著差異(P = 0.099~0.747) (圖八 B)。由上述 Caspase-3 活性分析、粒線體膜電位分析及 Trypan blue 檢測細胞存活率實驗可發現，利用 staurosporine 藥物引發細胞進行細胞凋亡時或是細胞在缺血清的壓力下，Ex5del 缺失突變淋巴細胞株比正常人淋巴細胞株更無法阻止細胞走向細胞凋亡的命運，顯示 Parkin 在維持粒線體功能方面確實扮演重要的角色，Ex5del 缺失突變的 Parkin 可能無法維持正常的粒線體功能，因此加速細胞進行細胞凋亡。過去的研究也指出，具有 Parkin 缺失的小鼠其紋狀體之粒線體細胞呼吸能力減弱，並且伴隨有粒線體電子傳遞鏈上複合體 I 及複合體 IV 的減少(Palacino et al., 2004)；而 Parkin 同型合子突變的 PD 患者， 39.

(52) 其白血球粒線體則有複合體 I 及複合體 IV 活性降低的現象(Muftuoglu et al., 2003)。此外在 Kuroda 等人 2006 年的研究也指出，在 SH-SY5Y 細胞中過度表現野生型 Parkin 可以顯著強化粒線體膜電位，反之，表現子 3 及表現子 4 突變型 Parkin 則無此作用。此結果可與我們的結果相互印證。. 二、HTRA2 基因突變. HTRA2 與細胞執行計畫性的細胞死亡或稱作細胞凋亡有關 (Chao et al., 2008; Suzuki et al., 2001)。近來的研究顯示 HTRA2 基因的突變可能會增加偶發性 PD 罹病的風險(Strauss et al., 2005)。故本實驗針對長庚醫院提供之 PD 患者 cDNA 進行 HTRA2 基因定序的工作。結果發現未報導過的表現子 1 的 R36W (CGG>TGG)及表現子 2 的 T215M (ACG>ATG)改變胺基酸的變異(圖九)。. (一) R36W C>T 突變 H1663 為表現子 1 的 R36W (CGG>TGG) 異型合子突變(圖九 A 左)。R36W 突變位在 HTRA2 蛋白的 mitochondrial targeting sequence (MTS, amino acids 1-40)上，full-length 的 preprotein 進入粒線體後會先移除 MTS domain 上 31 個胺基酸，成為 proprotein，最後進行 40.

(53) autocatalytic processing，再切除 N 端 102 個胺基酸成為具有活性的 mature HTRA2 protein，進入粒線體膜間腔執行功能。利用 in silico searches 方式(MitoProt II-v1.101)輸入 full-length 的 preprotein 胺基酸序列，分析 R36W 突變是否會影響 mitochondrial targeting sequence 的電荷或疏水性，結果顯示 R36W 並未在預測的 N 端 32 個胺基酸 MTS cleavage site 上，故 R36W 突變可能不會對 HTRA2 蛋白運送到粒線體造成影響。. (二) T215M C>T 突變 H570 為表現子 2 的 T215M (ACG>ATG)異型合子突變(圖九 B 左)。T215M 突變位在 HTRA2 蛋白的 serine protease domain (amino acids 166-342)上，T215M 突變是否會影響蛋白的 serine protease 活性或構形則需進一步利用一些蛋白質結構分析軟體來進行預測，而且 T215M 突變是否會影響 HTRA2 蛋白的功能也需進一步研究分析。. (三) HTRA2 基因 R36W 及 T215M 突變的功能分析由於 HTRA2 蛋白在細胞質中合成後會被送入粒線體中，但粒線體受損或細胞受到各種細胞凋亡的刺激時，HTRA2 又會由粒線體釋放到細胞質液中，所以本實驗也嘗試將 HTRA2-EGFP 重組質體送入 HEK-293T 及 SK-N-SH 細胞中表現並進行次細胞分層，利用西方轉 41.

(54) 漬法觀察野生型及突變型 HTRA2-EGFP 融合蛋白其前軀蛋白及成熟蛋白在粒線體及細胞質中表現的差異。結果顯示兩種細胞總蛋白(圖十三上)或是細胞質液與粒線體的次細胞分層蛋白(圖十三下)中， R36W 突變型其 61 kDa 成熟蛋白表現比野生型呈現略少的現象。由上述 in silico searches 顯示 R36W 突變可能不影響 HTRA2 蛋白運送到粒線體，因此西方轉漬所觀察到的 R36W 突變型成熟蛋白表現略少的現象，是否與 R36W 突變造成蛋白構形改變而使 HTRA2 proprotein 無法順利進行 autocatalysis 成為 mature protein 有關，仍需進一步探討。在 2008 年 Bogaerts 等人的研究中也指出 L72P 位在 HTRA2 proprotein 成為 mature protein 的過程中尚需移除的 102 個胺基酸片段上，L72P 的突變可能會影響酵素對胺基酸移除的過程。而 T215M 突變型其前軀及成熟蛋白所呈現的異常分子量變化，和 T215 是否為 serine protease domain 上的磷酸化位置可能有關，但仍需進一步探討。此外使用螢光顯微鏡觀察野生型及突變型 HTRA2-EGFP 融合蛋白在 HEK-293T 及 SK-N-SH 細胞中的表現情形與位置，結果顯示野生型及突變型 HTRA2-EGFP 融合蛋白在兩種細胞表現一致(圖十四)，野生型 HTRA2-EGFP 融合蛋白主要會分佈在粒線體，突變型 (R36W、T215M) HTRA2-EGFP 融合蛋白同樣主要分佈在粒線體，突變型與野生型的蛋白在細胞中表現位置相似，無明顯差異。. 42.

(55) 陸、參考文獻. 管郡潔(2007)。Parkin、DJ-1 基因突變及粒線體 DNA 多型性與台灣帕金森氏症的分子遺傳研究。國立台灣師範大學生命科學系九十五學年度碩士論文。 Beasley SA, Hristova VA, Shaw GS. (2007) Structure of the Parkin in-between-ring domain provides insights for E3-ligase dysfunction in autosomal recessive Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci USA 104(9): 3095-3100. Belin AC, Westerlund M. (2008) Parkinson's disease: a genetic perspective. FEBS J 275: 1377-1383. Bertram CP, Lemay M, Stelmach GE. (2005) The effect of Parkinson's disease on the control of multi-segmental coordination. Brain Cogn 57: 16-20. Biswas A, Gupta A, Naiya T, Das G, Neogi R, Datta S, Mukherjee S, Das SK, Ray K, Ray J. (2006) Molecular pathogenesis of Parkinson's disease: identification of mutations in the Parkin gene in Indian patients. Parkinsonism Relat Disord 12: 420-426 Bogaerts V, Nuytemans K, Reumers J, Pals P, Engelborghs S, Pickut B, Corsmit E, Peeters K, Schymkowitz J, Cras P, Rousseau F, Theuns J, Broeckhoven CV. (2008) Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat 29: 832-840. Bonifati V, Rizzu P, Squitieri F, Krieger E, Vanacore N, van Swieten JC, 43.

(56) Brice A, van Duijn CM, Oostra B, Meco G. (2003) DJ-1 (PARK7), a novel gene for autosomal recessive, early onset parkinsonism. Neurol Sci 24: 159-160. Brice A, Tassin J, deBroucker T. (1998) Chromosome 6-linked autosomal recessive juvenile parkinsonism in non-Japanese families. Neurology 50: A117. Chao JR, Parganas E, Boyd K, Hong CY, Opferman JT, Ihle JN. (2008) Hax1-mediated processing of HtrA2 by Parl allows survival of lymphocytes and neurons. Nature 452: 98-102. Clark LN, Haamer E, Mejia-Santana H, Harris J, Lesage S, Durr A, Bs SJ, Hedrich K, Louis ED, Cote LJ, Andrews H, Fahn S, Waters C, Ford B, Frucht S, Scott W, Klein C, Brice A, Roomere H, Ottman R, Marder K. (2007) Construction and validation of a Parkinson's disease mutation genotyping array for the Parkin gene. Mov Disord 22: 932-937. Conley SC, Kirchner JT. (1999) Parkinson's disease-the shaking palsy. Underlying factors, diagnostic considerations, and clinical course. Postgrad Med 106: 39-42, 45-36, 49-50. Darios F, Corti O, Lücking CB, Hampe C, Muriel MP, Abbas N, Gu WJ, Hirsch EC, Rooney T, Ruberg M, Brice A. (2003) Parkin prevents mitochondrial swelling and cytochrome c release in mitochondriadependent cell death. Hum Mol Genet 12: 517-526. Dauer W, Przedborski S. (2003) Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron 39(6): 889-909. Elbaz A, Grigoletto F, Baldereschi M, Breteler MM, Manubens-Bertran JM, Lopez-Pousa S, Dartigues JF, Alperovitch A, Tzourio C, Rocca 44.

(57) WA. (1999) Familial aggregation of Parkinson's disease: a population-based case-control study in Europe. Neurology 52: 1876-1882. Farrer MJ. (2006) Genetics of Parkinson disease: paradigm shifts and future prospects. Nat Rev Genet 7: 306-318. Gibb WR, Lees AJ. (1991) Anatomy, pigmentation, ventral and dorsal subpopulations of the substantia nigra, and differential cell death in Parkinson's disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry 54: 388-396. Gowers WR. (1990) A Manual of Diseases of the Nervous System. Vol. I. Diseases of the nerves and spinal cord. 3rd ed. Philadelphia: P. Blakiston's Son & Co. Greene JC, Whitworth AJ, Kuo I, Andrews LA, Feany MB, Pallanck LJ. (2003) Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkinmutants. Proc Natl Acad Sci USA 100: 4078-4083. Gray CW, Ward RV, Karran E, Turconi S, Rowles A, Viglienghi D, Southan C, Barton A, Fantom KG, West A, Savopoulos J, Hassan NJ, Clinkenbeard H, Hanning C, Amegadzie B, Davis JB, Dingwall C, Livi GP, Creasy CL. (2000) Characterization of human HtrA2, a novel serine protease involved in the mammalian cellular stress response. Eur J Biochem 267: 5699-5710. Gupta S, Singh R, Datta P, Zhang ZJ, Orr C, Lu ZX, DuBois G, Zervos AS, Meisler MH, Srinivasula SM, Fernandes-Alnemri T, Alnemri ES. (2004) The C-terminal tail of presenilin regulates Omi/HtrA2 protease activity. J Biol Chem 279: 45844-45854. Hatano Y, Sato K, Elibol B, Yoshino H, Yamamura Y, Bonifati V, Shinotoh H, Asahina M, Kobayashi S, Ng AR. (2004) PARK6-linked 45.

(58) autosomal recessive early-onset parkinsonism in Asian populations. Neurology 63: 1482-1485. Hattori N, Kitada T, Matsumine H, Asakawa S, Yamamura Y, Yoshino H, Kobayashi T, Yokochi M, Wang M, Yoritaka A, Kondo T, Kuzuhara S, Nakamura S, Shimizu N, Mizuno Y. (1998a) Molecular genetic analysis of a novel Parkin gene in Japanese families with autosomal recessive juvenile parkinsonism: evidence for variable homozygous deletions in the Parkin gene in affected individuals. Ann Neurol 44: 935-941. Hattori N, Matsumine H, Asakawa S, Kitada T, Yoshino H, Elibol B, Brookes AJ, Yamamura Y, Kobayashi T, Wang M, Yoritaka A, Minoshima S, Shimizu N, Mizuno Y. (1998b) Point mutations (Thr240Arg and Gln311Stop) [correction of Thr240Arg and Ala311Stop] in the Parkin gene. Biochem Biophys Res Commun 249: 754-758. Hedrich K, Djarmati A, Schafer N, Hering R, Wellenbrock C, Weiss PH, Hilker R, Vieregge P, Ozelius LJ, Heutink P, Bonifati V, Schwinger E, Lang AE, Noth J, Bressman SB, Pramstaller PP, Riess O, Klein C. (2004) DJ-1 (PARK7) mutations are less frequent than Parkin (PARK2) mutations in early-onset Parkinson disease. Neurology 62: 389-394. Henn IH, Gostner JM, Lackner P, Tatzelt J, Winklhofer KF. (2005) Pathogenic mutations inactivate Parkin by distinct mechanisms. J Neurochem 92: 114-122. Hochstrasser M. (2006) Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell 124: 27-34. Hoehn MM, Yahr MD. (1967) Parkinsonism: onset, progression and mortality. Neurology 17: 427-442. 46.

(59) Hu CJ, Sung SM, Liu HC, Lee CC, Tsai CH, Chang JG. (2000) Polymorphisms of the parkin gene in sporadic Parkinson’s disease among Chinese in Taiwan. Eur Neurol 44: 90-93. Kahle PJ, Leimer U, Haass C. (2000) Does failure of parkin-mediated ubiquitination cause juvenile parkinsonism? Trends Biochem Sci 25: 524-527. Kawamoto Y, Kobayashi Y, Suzuki Y, Inoue H, Tomimoto H, Budka H, Akiguchi I, Martins LM, Downward J, Takahashi R. (2008) Accumulation of HtrA2/Omi in neuronal and glial inclusions in brains with alpha-synucleinopathies. J Neuropathol Exp Neurol 67: 984-993. Kitada T, Asakawa S, Hattori N, Matsumine H, Yamamura Y, Minoshima S, Yokochi M, Mizuno Y, Shimizu N. (1998) Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature 392: 605-608. Kuroda Y, Mitsui1 T, Kunishige1 M, Shono M, Akaike M, Azuma H, Matsumoto T. (2006) Parkin enhances mitochondrial biogenesis in proliferating cells. Hum Mol Genet 15: 883–895. Lazzarini AM, Myers RH, Zimmerman TR Jr, Mark MH, Golbe LI, Sage JI, Johnson WG, Duvoisin RC. (1994) A clinical genetic study of Parkinson's disease: evidence for dominant transmission. Neurology 44: 499-506. Leroy E, Boyer R, Auburger G, Leube B, Ulm G, Mezey E, Harta G, Brownstein MJ, Jonnalagada S, Chernova T, Dehejia A, Lavedan C, Gasser T, Steinbach PJ, Wilkinson KD, Polymeropoulos MH. (1998a) The ubiquitin pathway in Parkinson's disease. Nature 395: 451-452. 47.

(60) Leroy E, Anastasopoulos D, Konitsiotis S, Lavedan C, Polymeropoulos MH. (1998b) Deletions in the Parkin gene and genetic heterogeneity in a Greek family with early onset Parkinson's disease. Hum Genet 103: 424-427. Lev N, Melamed E. (2001) Heredity in Parkinson's disease: new findings. Isr Med Assoc J 3: 435-438. Lu CS, Wu JC, Tsai CH, Chen RS, Chou YH, Hattori N, Yoshino H, Mizuno Y. (2001) Clinical and genetic studies on familial parkinsonism: the first report on a parkin gene mutation in a Taiwanese family. Mov Disord 16: 164-166. Lucking CB, Abbas N, Durr A, Bonifati V, Bonnet AM, de Broucker T, De Michele G, Wood NW, Agid Y, Brice A. (1998) Homozygous deletions in parkin gene in European and North African families with autosomal. recessive. juvenile. parkinsonism.. The. European. Consortium on Genetic Susceptibility in Parkinson's Disease and the French Parkinson's Disease Genetics Study Group. Lancet 352: 1355-1356. Lucking CB, Durr A, Bonifati V, Vaughan J, De Michele G, Gasser T, Harhangi BS, Meco G, Denefle P, Wood NW. (2000) Association between early-onset Parkinson's disease and mutations in the parkin gene. French Parkinson's Disease Genetics Study Group. N Engl J Med 342: 1560-1567. Lucking CB, Chesneau V, Lohmann E, Verpillat P, Dulac C, Bonnet AM, Gasparini F, Agid Y, Durr A, Brice A. (2003) Coding polymorphisms in the parkin gene and susceptibility to Parkinson disease. Arch Neurol 60: 1253-1256. Mandemakers W, Morais VA, De Strooper B. (2007) A cell biological perspective on mitochondrial dysfunction in Parkinson disease and 48.