本研究有三個重要發現是，第一，SCA 17 型轉殖小鼠呼吸節奏有不規 律的現象，這種呼吸變異性開始於出生後第二至第三週之間，此後，就ㄧ 直維持在這種不規則的呼吸節奏。第二，呼吸變異性在高二氧化碳環境下 會降低而趨於正常，與野生型小鼠之間沒有差別，但是這種呼吸變異性卻 不受麻醉劑的抑制。第三，轉殖小鼠對右頸靜脈投予辣椒素興奮肺迷走C 纖維，所引起的反射性反應非常微弱，呼吸暫停的時間較野生型短，所興 奮的喉返神經活性也較弱，這些結果暗示轉殖小鼠的聲門調控機制、甚至 是其呼吸功能，可能異常。
一、Whole-body barometric plethysmography 測量法的探討
呼吸的參數包含了呼吸週期、吸氣與呼氣時間、潮氣容積與換氣量。
其中，測量清醒動物的方法主要可以分兩種，非拘束式的 whole-body barometric plethysmography 與 較 為 拘 束 的 head-out plethysmography (Hoymann, 2006, 2007)。whole-body barometric plethysmography 測量的原理 是藉由，吸氣時被吸入肺部的氣體因為溫度上升而壓力增加；呼氣時，動 物所呼出的氣體被冷卻而使壓力降低(Bartlett, 1989; Bartlett and Tenney, 1970; Drorbaugh and Fenn, 1955; Epstein et al., 1980)，而利用這些壓力變化 即可計算出容積的改變，推算出呼吸運動的相關參數。而利用 head-out plethysmography 在進行測量時，將動物置於要測量的裝置內，將動物的頸 部與測量的chamber 做密封，防止漏氣，如此可以測量到位於 chamber 內 胸腔大小的變化，但缺點是很難去避免因為密封頸部對於動物所造成的壓 迫，產生不可預期的影響(Gaultier and Gallego, 2008)。相對地，若利用 whole-body barometric plethysmography 就可能可以避免拘束所帶來的影 響。也因此，我們參考了這些文獻，依據Bartlett and Tenney, 於 1970 年發
表的研究，參考並設計出我們的實驗裝置。
小鼠的但是除了呼吸運動之外，水分蒸汽壓，環境與生物體溫度，以 及生物體的移動也都會影響到壓力的變化(Drorbaugh and Fenn, 1955;
Gaultier and Gallego, 2008; Gaultier et al., 2006)。校正時所注入的氣體也無 法確保與動物室內的氣體等溫(DeLorme and Moss, 2002)。除了不同小鼠種 間的差異之外，這種校正上的誤差也很可能是我們所測量到的潮氣容積和 換氣量與其他所不同的原因之一。雖然無法直接量測到容積的變化，只能 估計潮氣容積與換氣量，但是目前這個方法是普遍認為在自由運動的動物 中，唯一能夠半定量潮氣容積與換氣量的方法(Enhorning et al., 1998;
Gaultier et al., 2003; Gaultier and Gallego, 2008; Onodera et al., 1997)。
在我們的實驗結果中，我們在六個月大的野生型小鼠與轉殖小鼠觀察 到了快速的呼吸頻率（392±60 次／分與 317±50 次／分）。與一些利用拘束 式測量的研究相較之下，我們的呼吸頻率較快。這個現象可能除了因為頸 部受到壓迫之外，拘束式的裝置還必須要有一股力量防止小鼠後退，以防 止其頭部從頸部拘束器掙脫，而這可能是造成拘束式與非拘束式測量到呼 吸頻率不同的原因(DeLorme and Moss, 2002)。然而，在過去一些以非拘束 式 plethysmography 進行的研究中，該呼吸頻率也較我們的結果為慢 (Hamelmann et al., 1997; Tankersley et al., 1997)。在 Ztm:MF1 品系的小鼠 中，利用影像記錄與慢動作重播技術並以人工計數的方式測量了其呼吸頻 率為254±28 次(Bernhard et al., 2001)。在該實驗中，作者計數的過程中已 將小鼠主動嗅氣味（sniff）的動作排除。因此，推測在小鼠呼吸的過程中，
可能有不易被觀察到之嗅氣味的行為(DeLorme and Moss, 2002)，才使結果 呈現出快速的呼吸頻率。且小鼠在以urethane 輕微麻醉之後有呼吸頻率降 低，但呼吸變異性仍存在的情形。對於urethane 使呼吸頻率降低，但呼吸 變異性仍存在的作用機制仍不是十分瞭解，但是麻醉之後會降低大腦皮質 的活動，減少意識對呼吸的控制(Gonsenhauser et al., 2004)。麻醉後的呼吸
頻率與其他相關研究較為相似。因此，推測在實驗過程中，動物的心理因 素可能也會影響了呼吸頻率的改變。
二、呼吸變異性
在我們的實驗結果中，發現野生型與轉殖小鼠的呼吸週期在出生兩週 是一樣的，剛出生的第一週，呼吸週期比較不穩，出生後 10 天呼吸不穩 的程度降低。為方便量化以評估呼吸週期不穩，本研究量化呼吸變異性 (respiratory variability)的指標是將所測量的呼吸週期轉換計算成 CV 值與 IS 值，這兩個值大代表呼吸變異性大，是常用於呼吸週期不穩的量化指標 (Viemari et al., 2005)，根據 CV 值與 IS 值，我們發現剛出生第一週，野生 型與轉殖小鼠的CV 值與 IS 值高，到第二週，這兩種實驗動物的 CV 值與 IS 值都降低，野生型動物就ㄧ直維持在這樣的 CV 值與 IS 值達半年，鼠類 年齡達半年，ㄧ般就認為是年老年齡。因此我們認為野生型小鼠的呼吸變 異性在剛出生是比較高，第二週之後就轉變為穩定狀態，這樣的穩定呼吸 週期就維持到年老。然而轉殖小鼠的CV 值與 IS 值卻在 p17 之後升高，且 ㄧ直維持在這樣高的CV 值與 IS 值到年老，與野生型動物相比較，顯示轉 殖小鼠的呼吸週期從第三週開始就呈現不穩定，這是第一次在脊髓小腦萎 縮症的動物看到呼吸不穩現象。呼吸變異性大也就是呼吸週期不穩，暗示 呼吸頻率時快、時慢，是否因為這樣而導致聲門運動控管機制異常？或是 聲門運動異常而引起呼吸不穩？目前並不清楚，這兩種生理異常有無因果 關係？甚至是同一個機制異常所引起，也不知道。
野生型小鼠的呼吸變異性從剛出生的不穩轉變穩定狀態，與大鼠相似 (Liu et al., 2006b；Mortola, 1984)。Liu 等 (2006b)從他們的研究結果，認 為腦幹的神經元在胚後發育過程(postnatal development)有一個重要時期 (critical period)，這個重要時期大約是在出生後第二週，他們發現腦幹神經 元，尤其是pre-Bötzinger complex (preBötC) 神經元的麸胺酸及其受器，在
p12 會降低，preBötC 是目前大家所認為可能是呼吸節律產生中樞，麸胺酸 作用於麸胺酸受器對引起神經元興奮以及引發吸氣活動扮演重要角色 (Feldman and Del Negro, 2006；Guyenet and Wang, 2001)；有趣的是大約在 這個時期 (p10-p12)，GABA receptor α
3
-subunit 減少，且α1
-subunit 表現 增加 (Liu and Wong-Riley, 2004, 2006a)；不僅如此，glycine 含量卻在 p12 增加 (Liu and Wong-Riley, 2004; Wong-Riley and Liu, 2005)。顯示神經傳遞 物質在p12 時期是一個轉變的重要時期，興奮性神經傳遞物質如麸胺酸減 少，但抑制性的glycine 卻增多，而 GABA 受器也改變其結構，可能與呼 吸頻率變化有關。本研究觀察到呼吸變異性在第二週發生轉變，與上述神 經傳遞物質在出生後的變化，在時間上相當ㄧ致，惟這種呼吸變異性在出 生後兩週的轉變，是否就是由於神經傳遞物質的變化，目前並無直接的證 據，由於在時間上的相關性，這樣的可能性卻不能排除。呼吸節律的產生雖然是與延腦神經元有關，尤其是 preBötC 這裡的神 經元，惟也受到橋腦呼吸調節中樞的影響。在發育過程中，橋腦呼吸調節 中樞的功能是維持正常呼吸節律所不可或缺的 (St-John and Paton, 2004)。
在橋腦，有三大主要核區與呼吸頻率調控有相當密切的關係。這三大核 區，從吻端到尾端分別是 Parabrachial/Kölliker-Fuse complex（PB/KF），
intertrigeminal region（ITR）與 noradrenergic A5 cell group (Alheid et al., 2004; Dutschmann and Herbert, 2006)。KF 接收許多呼吸相關的傳入信息，
參與調控吸氣後活性 (post-inspiratory activity) (Dutschmann et al., 2004;
Dutschmann and Herbert, 2006; Kron et al., 2007a)，也參與多種呼吸相關的 反射調控機制，如nasotrigeminal reflex (Dutschmann and Herbert, 1998)，賀 伯反射（Hering Breuer reflex）(Ezure, 2004)，吸入反射（aspiration reflex）
(Jakus et al., 2004)，chemoreceptor reflex(Song and Poon, 2004)以及感壓反射 (baroreceptor reflex) (Erickson and Millhorn, 1994)，這些反射性反應也與呼 吸頻率有關，例如：潛水時所引起的nasotrigeminal reflex，呼吸必須暫停，
賀伯反射卻抑制吸氣，所以，這些反射性反應都會影響呼吸頻率。Kron et al. 最近(2007b)發現出生後十天(p10)以前的新生大鼠，KF 核區 GABAergic 抑制性突觸傳遞佔主要多數，但卻在出生十天之後逐漸減少、並轉變為以 glycnergic 抑制性突觸傳遞為主。換句話說，KF 核區的抑制性突觸傳遞會 在出生之後發生轉變，從 GABAergic 轉變為以 glycnergic 為主的傳遞作 用。KF 這種發育上的成熟與轉變，在時間上也與本研究所得有關呼吸變 異性相關，是否可以解釋本實驗所觀察到的結果，值得考慮。
呼吸變異性也見於Rett syndrome 病人，這是一種遺傳疾病，與 MECP2 基因病變有關，病患在尚未發病前正常，病發後呈現呼吸不穩的問題，尤 其是在白天或生氣時尤甚 (Nomura, 2001)，原因不明。利用動物轉殖小鼠 模式研究呼吸週期變異性 (Julu et al., 2001; Viemari et al., 2005)，發現轉殖 小鼠延腦腹呼吸神經核 (ventral respiratory group; VRG）的呼吸相關神經 元，其呼吸節律呈現不規則活動，這種不規律的活動現象會在投予正腎上 腺素之後恢復其呼吸節奏(Viemari et al., 2005)，作者因而推測其呼吸變異 性的原因可能是延腦所分泌的 tyrosine hydroxylase 與血清素的神經細胞 缺失所導致。此外，在SCA 17 轉殖小鼠的動物模式中，也發現轉殖小鼠 在腦中small heat shock protein HSPB1 的表現量較少，這種 HSPB1 的表現 量與神經細胞的正常功能與存活有關 (Friedman et al., 2007)，暗示 SCA 17 型轉殖小鼠正腎上腺素或血清素的分泌與作用可能有異常的情形，且神經 細胞的正常功能與存活可能受到了影響，進而使自發性的呼吸節律調節產 生異常，導致了呼吸變異性的產生。Stettner et al. 最近 (2007) 發現 MECP2 基因剔除 (knouk-out) 的小鼠，其 post-inpiratory activity 非常不穩，若是以 麸胺酸刺激橋腦的 KF 核區，結果是 pos-tinpiratory activity 增強，呼吸暫 停的時間延長，不僅如此，電刺激迷走神經傳入感覺神經，呼吸暫停時間 並不會更為延長。前述KF 涉及許多呼吸相關反射作用，MECP2 基因剔除 的小鼠，迷走神經所引起的反射遲鈍，且興奮KF 引起 postinspiratory activity
增強，暗示Rett syndrome 病人或動物模式，KF 異常可能與呼吸不穩有關。
有趣的是，glycinergic pathway 與 post-inspiratory activity 有密切關係 (Dutschmann and Paton, 2002)，Post-inspiratory activity 其實就是喉返神經在 呼氣第一期的活動，換一個角度來看，MECP2 有缺失的動物或是 Rett syndrome 病人，KF 功能可能異常，所以，呼吸不穩。
此外，在本實驗結果中，我們觀察到了轉殖小鼠呼吸頻率較慢現象。
若進一步分析，發現野生型與轉殖小鼠的吸氣時間並沒有太大差別，但是
若進一步分析，發現野生型與轉殖小鼠的吸氣時間並沒有太大差別，但是