脊髓小腦萎縮症第17型轉殖小鼠之呼吸變異性與聲門功能異常

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 脊髓小腦萎縮症第十七型轉殖小鼠之呼吸變異性與聲門功能異常 Respiratory variability and glottal dysfunction in spinocerebellar ataxia type 17 transgenic mice. 研究生：林孟緯 Meng-Wei Lin 指導教授：黃基礎博士 Ji-Chuu Hwang. 中華民國九十七年六月.

(2) 誌謝在就讀研究所的這些日子，首先要感謝黃基礎老師對我的教導，學習到許多對於科學研究該有的觀念與態度。在實驗上也有給了我許多自由揮灑的空間，可以盡情的去探索科學的奧秘，也培養了解決問題的能力。不管是待人處事或是治學態度，老師也都是我學習的典範。謝謝實驗室學長姊對我的指導與照顧，宜蓉學姊總會在實驗挫折時給予安慰，舒如學姊帶領我磨練實驗技術的第一步。感謝昆澤學長總是與我討論整個實驗的設計與改良，思考如何去解決實驗中的難題。緻怡學姊給了我實驗上的建議，也帶給我們許許多多的歡樂。國棟學長也總是在我忙碌之餘，很貼心的幫助我處理了很多實驗室的大小事務。在艱辛忙碌的實驗生活中，幸好還有怡帆一起作伴奮鬥，討論實驗數據，彼此分攤了許多辛勞。感謝欣曄總是能耐心的聽我吐苦水，給我意見。謝謝亭諭與大學部的姿伶、家慈、佳蓉，你們帶給我許許多多的歡笑，讓我在心情低迷之後又有重新啟動的動力。感謝作豪學長耐心的教導我做 IHC，總是不厭其煩的帶著我染色與拍照。謝謝雅津學姊與馨慧帶著我做 genotyping，被我不定時的問一堆轉殖鼠的問題。沒有你們，也沒有我這群可愛小白鼠的誕生。謝謝廷翰的幫忙，果然是有男子漢的義氣。謝謝許庭、俊彥、與祥、緻怡。日常生活中有了你們，讓我感到溫馨。也讓實驗之餘的生活，多了不同的色彩。感謝卓揚與劉曜，總是能讓我有安心自在的感覺。每次回到苗栗，聚一聚的時光總是能夠讓我重新充滿電，去迎接新的挑戰。感謝給予我挫折的人，讓我重新認識自己，重新站起來，讓我更有勇氣去面對未知的一切。謝謝姿伶，在我挫折的時候總是為我打氣，帶給了我許多快樂的回憶。有妳的陪伴，是最開心的事情！.

(3) 最後，我要感謝我的家人對我的栽培與支持，讓我在外求學那麼多年，不用操心家中的情況。謝謝你們！.

(4) 目錄縮寫表．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． i 中文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． iii 英文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． iv 壹、前言一、脊髓小腦萎縮症．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 1 二、第十七型脊髓小腦萎縮症．．．．．．．．．．．．．．．．．． 2 三、脊髓小腦萎縮症與呼吸功能異常．．．．．．．．．．．．．．． 3 四、聲門與吞嚥．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 4 五、影響聲門運動的因素．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 6 （一）二氧化碳濃度對於聲門運動的影響．．．．．．．．．．．． 6 （二）肺迷走 C 纖維．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 7 六、問題與假說．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 9 七、實驗目的．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 10 貳、實驗材料與方法一、實驗動物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 10 二、以 whole body plethysmography 記錄小鼠呼吸運動．．．．．．． 10 三、聲門功能評估．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 13 （一）動物手術．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 13 （二）神經活性的測量．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 14 四、實驗設計與步驟．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 15 五、藥物配製．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 16 六、呼吸變異性分析與實驗資料統計．．．．．．．．．．．．．．． 17 （一）呼吸變異性分析與呼吸參數分析．．．．．．．．．．．．． 17 （二）神經活性分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 18.

(5) （三）統計方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 19 參、實驗結果一、不同年齡 SCA17 型轉殖小鼠的呼吸功能．．．．．．．．．．． 20 （一）不同年齡的呼吸變異性．．．．．．．．．．．．．．．．． 20 （二）不同年齡呼吸週期的改變．．．．．．．．．．．．．．．． 21 （三）不同年齡單位體重分鐘換氣量的改變．．．．．．．．．．． 22 （四）麻醉對於呼吸變異性的影響．．．．．．．．．．．．．．． 23 二、高二氧化碳濃度對 SCA17 型轉殖小鼠呼吸變異性的影響．．．． 23 （一）高二氧化碳降低呼吸變異性．．．．．．．．．．．．．．． 23 （二）高二氧化碳對呼吸週期的影響．．．．．．．．．．．．．． 24 （三）高二氧化碳對潮氣容積與換氣量的影響．．．．．．．．．． 25 三、辣椒素對膈神經與喉返神經呼吸活動的影響．．．．．．．．．． 25 （一）辣椒素對神經呼吸活動的影響．．．．．．．．．．．．．． 25 （二）辣椒素對呼吸時間的影響．．．．．．．．．．．．．．．． 27 肆、討論一、Whole-body barometric plethysmography 測量法的探討．．．．． 28 二、呼吸變異性．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 30 三、脊髓小腦萎縮症第十七型轉殖小鼠的 Chemosensitivity ．．．．． 34 四、脊髓小腦萎縮症第十七型轉殖小鼠的聲門功能異常．．．．．．． 35 五、結論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 37 伍、圖與圖說．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 39 陸、參考文獻．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 59.

(6) 縮寫表. ADCA. autosomal dominant cerebellar ataxia. CV. coefficient of variation. hTBP. human TATA-box binding protein. IA. interarytenoid muscle. IS. irregularity score. ITR. intertrigeminal region. KF. Kölliker-Fuse complex. LCA. lateral cricoarytenoid muscle. NA. nucleus ambiguous. PCA. posterior cricoarytenoid muscle. PCFs. pulmonary vagal C-fiber receptors. polyQ. polyglutamines. preBötC. pre-Bötzinger complex. RARs. rapidly pulmonary stretch receptors. RLN. recurrent laryngeal nerve. RLNA. recurrent laryngeal nerve activity. RTN. retrotrapezoid nucleus. SARs. slowly pulmonary stretch receptors. SCA. spinocerebellar ataxia. SLN. superior laryngeal nerve. TA. thyroarytenoid muscle. TBP. TATA-box binding protein. Tg. transgenic mice i.

(7) TRPV1. transient receptor potential vanilloid-1. WT. wild-type. ii.

(8) 中文摘要脊髓小腦萎縮症（spinocerebellar ataxia）是一種體染色體顯性遺傳的神經退化疾病。脊髓小腦萎縮症各型的基因表現不同、臨床上的病徵上也各型不一，但主要病因皆是小腦的區域產生損傷，尤其是 Purkinje cells。脊髓小腦萎縮症第十七型的致病因子則是由於 TATA-box 結合蛋白（TATA-box binding protein; TBP）有不正常的 CAG 三核苷擴增，臨床上的症狀包含了行動遲緩、運動失調局部張力不全、眼球震顫、發聲與吞嚥困難、以及認知功能障礙。發聲與吞嚥的動作與呼吸道肌肉的調節有著密切關係，有些患者於疾病晚期在進食時因為異物進入呼吸道而引起吸入性肺炎，病因而導致死亡，因此可能暗示了聲門，甚至是呼吸功能的調節有異常的情形。但是臨床上有關於脊髓小腦萎縮症第十七型呼吸功能的研究卻甚少。本研究是利用 whole body plethysmography 來測量這些未拘束之清醒脊髓小腦萎縮症第十七型轉殖小鼠的呼吸功能，並與正常野生型小鼠相比較，以瞭解呼吸是否發生異常情形，並於麻醉的模式下以辣椒素興奮其肺迷走神經 C 纖維，引起反射，觀察其喉返神經的變化。實驗結果發現，脊髓小腦萎縮症第十七型轉殖小鼠於出生後的第三週出現呼吸不規律，呼吸週期變異性大，且呼吸頻率較慢的現象。但是在給予 3%或 5％二氧化碳刺激之後這個呼吸變異性會逐漸降低至與野生型無顯著差異。此外，投予 0.625 μg/kg 以及 1.25 μg/kg 之辣椒素興奮肺迷走神經 C 纖維引起肺化學反射，結果是野生型小鼠呼吸暫停，支配聲門運動的喉返神經活性增強，但是轉殖小鼠在興奮後的呼吸暫停時間較短，且喉返神經反應較弱。轉殖小鼠呈現呼吸的變異性以及喉返神經反射性反應微弱，暗示了脊髓小腦萎縮症第十七型轉殖小鼠的呼吸功能與聲門運動的調控是有障礙的。. iii.

(9) 英文摘要 Autosomal dominant spinocerebellar ataxias（SCA）are a clinically and genetically heterogeneous group of neurodegenerative disorders primarily affects the Purkinje cells in cerebellum. Spinocerebellar ataxia type 17 (SCA17) is one of the neurodegenerative diseases which display cytosine-adenineguanine (CAG) repeat expansion coding for polyglutamine tracts in the transcription factor TATA box-binding protein (TBP). Clinical symptoms of patients with SCA17 display ataxia, dystonia, bradykinesia, cognitive impairment, dysphonia and dysphagia. Dysphonia and dysphagia may implicate that their regulatory mechanism of the vocal folds and respiratory system may have been malfunctioned. We aimed to examine whether the vocal fold movements and respiratory function of the SCA17 transgenic (Tg) mice was dysfunctional. Respiratory pattern was evaluated with a whole body plethysmography under unrestraint and unanesthesia. Pressure fluctuation representing respiratory pattern was recorded through a differential pressure transducer and amplifier and then stored in the hard disc via PowerLab system. We also observed the activity of the recurrent laryngeal nerve (RLNA) in response to capsaicin-induced activation of pulmonary vagal C-fiber receptor in Tg mice. Results obtained revealed that Tg mice displayed a prolonged and significantly varied respiratory duration at the third week after postnatal development. This respiratory variability was much reduced in the challenge to the increase in CO2 at a level of 3% or 5% CO2 condition. Additionaly, administration of capsaicin (0.625 and 1.25 μg/kg) produced pulmonary chemoreflex characterized by apnea, and also an enhancement of RLNA during period of apnea in wild-type mice. However, apnea and RLNA enhancement iv.

(10) induced by capsaicin administration was much less in Tg mice, suggesting that modulation of vocal fold movement might be dysfunctional. These results indicate that respiratory functions of Tg mice with SCA 17 symptom may have been disordered, and the respiratory control mechanism of Tg mice with SCA 17 may have been disorder.. v.

(11) 壹、前言一、脊髓小腦萎縮症（Spinocerebellar ataxias）脊髓小腦萎縮症（spinocerebellar ataxias，SCAs）是一種罕見的神經退化性疾病，發生率約為十萬分之一到十萬分之四，目前至少已有28種不同的類型被發現，每一種類型的致病基因都不盡相同(Duenas et al., 2006; Manto, 2005; Soong and Paulson, 2007)。脊髓小腦萎縮症大多數是體染色體顯性的遺傳性神經元退化性疾病。患者會由於小腦與小腦深部Purkinje神經細胞的萎縮、退化產生漸進性運動失衡，且常常伴隨了眼球振動、身體震顫、認知障礙甚至還有發聲困難與吞嚥困難的情形 (Abele et al., 1997; Lin et al., 2007; Manto, 2005; Shiba and Isono, 2006)。依據Harding的研究中，他將體染色體顯性的小腦性運動失調症 (Autosomal dominant cerebellar ataxia；ADCA)，依據臨床上觀察到的病徵將分為ADCA I-III (Harding, 1982)。但是因為脊髓小腦萎縮症各型的病理及病徵相當類似，使得臨床上分類的工作並不容易。而近年來藉著分子生物學的檢測，許多SCA的基因已被鑑定出來，大致可以分為三類： 1 ) 因為致病基因轉譯區內CAG三核苷的擴增，導致含有多麩醯胺酸（polyglutamines；polyQ）的蛋白沉積，因為glutamine具有極性的性質，所以當連續且大量的glutamine胺基酸重複序列出現時，常會使蛋白質的構形改變造成功能異常，甚至也會影響到蛋白質的交互作用，對細胞產生毒性傷害，這些類型包含了：SCA1，SCA2， SCA3，SCA7，SCA17等。2 ) 不正常的核苷酸重複序列位於非轉譯區並改變了基因或蛋白的表現，例如：SCA8，SCA10，SCA12等。3 ) 第三類則是離子通道疾病，例如SCA6(Margolis, 2002)。在眾多的SCAs類型當中，SCA1、SCA2、SCA3、SCA6與SCA7是較為常見的類型。平均的發病年齡約在30歲左右，但是在不同的SCAs類型的病患之間也有很大的差異，像是SCA1，SCA2，SCA3，SCA7，SCA8，SCA12， 1.

(12) SCA13，SCA17與SCA25就有可能在十歲左右發病，而在SCA6可能在65 歲之後才觀察到運動失調的情形(Manto, 2005)。事實上，許多不同類型的 SCAs都有廣泛性的小腦萎縮現象，包含了分子層，蒲金氏細胞層以及顆粒細胞層（molecular，Purkinje cell and granule cell layers）。除此之外，很多不同類型SCAs的腦幹區域都有萎縮的情形，像是polyglutamines所引起五種類型的 SCAs 都發現腦幹區域有顯著的萎縮 (Soong and Paulson, 2007)。而根據腦部MRI的影像，萎縮的模式可以分為從只有小腦的部份萎縮 (SCA4，SCA5，SCA6，SCA8，SCA9，SCA10，SCA11，SCA14，SCA15， SCA16 ， SCA18 ， SCA21 與 SCA22) 、進而橄欖核橋腦小腦萎縮 (olivopontocerebellar atrophy，SCA1，SCA2，SCA3，SCA7，SCA13)，以及遍及整個腦的萎縮 (SCA12，SCA17，SCA19) (Manto, 2005)。三核苷酸的重複序列可藉由DNA複製時增加其重複長度，而一般SCAs 的病人發病年齡多在中年有了家庭之後，所以往往在下一代時，他們遺傳到的三核苷酸重複序列數會較上一代更多，而下一代的發病年齡可能也會因此比上一代提早，這也成為此病的特徵之一。. 二、第十七型脊髓小腦萎縮症（Spinocerebellar ataxias type 17）第十七型脊髓小腦萎縮症（spinocerebellar ataxias type 17，SCA17）於 2001年在四個日本家族中被鑑定出 (Nakamura et al., 2001)。SCA17的患者發病年齡從19歲到48歲，臨床上的症狀包含了行動遲緩、運動失調、局部張力不全、眼球震顫、發聲與吞嚥困難、以及認知功能障礙 (Hagenah et al., 2004; Lin et al., 2007; Mariotti et al., 2007; Nakamura et al., 2001; Soong and Paulson, 2007)。SCA17的致病因子則是由於TATA-box結合蛋白（TATA-box binding protein，TBP）有不正常的CAG三核苷擴增所導致 (Nakamura et al., 2001)。TBP位於細胞核內，在真核生物的三種核糖核酸聚合酶（RNA polymerases I、II、and III）當中，TBP對於起始轉錄出正確的核糖體RNA、 2.

(13) Messenger RNA 、 Transfer RNA 以及 small nuclear RNA 是不可或缺的 (Burley and Roeder, 1996; Reid et al., 2003)。一般人的TBP在N端有著25-42 次重複的polyQ，而在病人卻可以發現到46次重複以上的polyQ (Mariotti et al., 2007; Reid et al., 2003)。但是在一些其他的物種之中，TBP有較短甚至是不存在的polyQ (Hancock, 1993)。這可能也暗示了位於TBP的N端polyQ 重複數目對於正常的轉錄作用可能不是必須的 (Seipel et al., 1993)。在一些利用SCA17轉殖小鼠模式的研究中，發現了擴增的polyQ會增強了TBP與 transcription factor IIB 的交互作用，並減少了small heat shock protein HSPB1 的表現，而這些現象都可能影響神經細胞的存活 (Friedman et al., 2007)；含有擴增polyQ的TBP亦會對TATA-dependent的轉錄有抑制作用，並影響了與DNA結合的能力，引起神經細胞毒性 (Friedman et al., 2008)。. 三、脊髓小腦萎縮症與呼吸功能異常在臨床上有些SCAs的病人會有吞嚥與發聲困難的情形，以及在進行吸氣運動有異常的聲音產生 (Abele et al., 1997; Lin et al., 2007; Shiba and Isono, 2006)。除此之外，這些SCAs的病人在發病的晚期，常會有吸入性肺炎的症狀出現(Nakamura et al., 2001; Sasaki et al., 1996)。這些症狀暗示聲門（vocal fold）的協調作用可能產生了異常，甚至病變。聲門活動與呼吸運動之間的協調可以維持上呼吸道的暢通與阻力，聲門也扮演一些防禦性的反射作用。在呼氣運動時，聲門的內收運動可以增加上呼吸道的阻力以利於氣體交換 (Lara et al., 2002)，在吞嚥時聲門必須關閉，以避免於異物進入呼吸道；聞到刺激性氣體時，聲門也會關閉，以防止有害氣體進入氣管與肺 (Bartlett, 1989; Bauman et al., 1998; Lu et al., 2006; Lu et al., 2005)。在臨床上SCA1的病人中，經由喉部內視鏡發現在呼吸以及發聲時，管制聲門運動的外展肌麻痺（Vocal cord abductor paralysis；VCAP）的症狀，甚至於晚間睡眠時因為VCAP而引起喘鳴（stridor）的現象 (Barbieri et al., 2001; 3.

(14) Shiojiri et al., 1999)。病人也會因為發聲困難而產生人際間的溝通障礙，進而感到孤獨與疏離感，對生活帶來不便，也影響了生活品質 (Krischke et al., 2005; Wilson et al., 2002)。此外，確實有SCAs的病人在疾病晚期於進食時因為異物進入呼吸道引起吸入性肺炎而死亡 (Nakamura et al., 2001; Sasaki et al., 1996)，顯示SCA病人也有呼吸異常的問題，但是這方面的相關研究卻甚少。從以上這些文獻的探討中，可以看出病人在呼吸神經控制方面可能異常，聲門的防禦性反射作用可能也有所缺失 (Knight et al., 2004)。可是要在這方面進行研究工作卻不容易，利用動物疾病模式來研究應是合理、可行的策略。. 四、聲門與吞嚥兩片聲帶所包圍的空間稱為聲門。聲門位於喉部，氣管與食道交接處，是呼吸氣流必經的通道，在呼吸週期，吸氣時，聲帶外展使聲門面積增大，降低對氣流的阻力，呼氣時，聲帶內收(向聲門的中央移動)使聲門面積變小，增加對呼氣氣流的阻力。聲門也參與發聲功能，也有協助吞嚥及調控上呼吸道暢通的功能，以維持呼吸運動的效率(Shiba et al., 1999)。控制喉頭肌肉運動的神經主要為上喉神經（superior laryngeal nerve；SLN）及喉返神經（recurrent laryngeal nerve；RLN）。上喉神經的運動神經元細胞體起源於延腦的迷走神經背側運動核（dorsal motor nucleus of the vagus nerve）與疑核（nucleus ambiguous；NA）(Furusawa et al., 1996)，沿迷走神經下行，支配喉頭的環甲肌。喉返神經運動神經元細胞體起源於延腦的疑核 (Yoshida et al., 1982)，沿迷走神經下行到胸腔，從迷走神經分支出來沿氣管兩側上行到喉頭，從背側進入喉部。喉返神經則支配了後環杓肌（posterior cricoarytenoid muscle；PCA）、杓間肌（interarytenoid muscle； IA）、側環杓肌（lateral cricoarytenoid muscle；LCA）與甲杓肌（thyroarytenoid muscle；TA）。 4.

(15) 吸氣活動時，喉返神經外展支(abducent branch)所支配的後環杓肌與杓間肌收縮，帶動聲帶向外移動，促使聲門的面積變大，藉以降低對吸氣氣流的阻力以利氣體進入肺部。呼氣時，喉返神經內收支(adducent branch) 所支配的側環杓肌與甲杓肌的收縮，使聲帶向聲門中央移動(內收)，於是聲門的面積縮小、孔徑減小，增加對呼氣氣流的阻力(Bartlett, 1989; Poliacek et al., 2003)，避免呼氣的氣流速度過快導致肺部塌陷，維持功能肺餘量並有助於延長肺泡內氣體交換的時間 (Dreshaj et al., 2001)。聲門關閉是吞嚥時很重要的一個環節，但是光只有聲門關閉是不足夠的(Wilson et al., 1995)。當進行吞嚥的動作時，舌、咽及食道彼此要有精密配合才能完成。食物在口中經咀嚼與唾液充份混合磨碎後，舌頭將食團送至口腔後方，經由隨意肌(主要是舌頭肌肉)將食團推入咽喉中。當食物進入咽喉的同時，聲門會關閉以及會厭(epiglottis)會將聲門蓋住以保護呼吸道，使得食物不會掉入十到，同時，上食道括約肌（upper esophageal sphincter）則會放鬆讓食團進入食道完成吞嚥 (Leder and Ross, 2005; Wilson et al., 1995)。在整個吞嚥的過程中，聲門關閉、吸氣活性受到抑制、呼氣時間延長，同時舌下神經會有呼氣後的放電活動。假設不慎讓食物進入了呼吸道，則會啟動呼吸道的另一道防線，在食物的刺激下，會產生咳嗽反射來將異物排出呼吸道，而咳嗽時，剛ㄧ開始是深吸氣，然後是聲門關閉，緊接著是用力呼氣以產生很大的胸腔壓力、配合聲門張開，將誤入氣管的食物咳出。SCAs 的患者，有吞嚥困難，甚至因而引起吸入性肺炎，很有可能是聲門運動的調控機制異常，也有可能是上呼吸道或是帶有呼吸節律或與吞嚥相關的中樞神經核區發生病變，使得聲門無法阻擋異常侵入呼吸道。我們可以利用 SCA 動物模式，來測試聲門關閉作用或是管制聲門運動的喉返神經活動是否正常，以探究聲門的功能是否發生異常現象。. 5.

(16) 五、影響聲門運動的因素在呼吸週期，吸氣時，聲帶外展使聲門面積增大，呼氣時，聲帶內收使聲門面積變小，增加了呼氣氣流呼出的阻力。當身體接收到呼吸相關刺激時，呼吸與循環系統會做出相對應的反射，當然，掌控呼吸道暢通的聲門也不例外。. （一）二氧化碳濃度對於聲門運動的影響呼吸系統主要的功能是維持血液中氣體（氧與二氧化碳）濃度恆定，這要依賴肺進行氣體交換，以維持身體的氧消耗與二氧化碳的排出(Davis et al., 2006)。當身體所需的氧不足或產生的二氧化碳過多時，會藉由肺換氣量的改變，調節氧以及二氧化碳的交換效率。至於掌控換氣量的中樞核區域之一，則是位於腦幹的呼吸調節中樞(Janczewski and Feldman, 2006; Ramirez et al., 2002)。延腦的呼吸調節中樞可以藉由調整呼吸的頻率及深度，調節肺泡二氧化碳的呼出量來維持體內二氧化碳濃度之恆定。而會隨著二氧化碳濃度改變的 pH 值，則是主要引起延腦產生反應的關鍵。當延腦 pH 值降低，便增加了呼吸頻率與深度，以調節血液中的二氧化碳濃度與 pH 值。但是當過度換氣時反而會使體內的二氧化碳排出過多，血液中的二氧化碳下降，呼吸調節中心因此會對橫膈發出神經衝動，反而抑制吸氣活動，產生呼吸暫停的現象，直到血液中二氧化碳濃度回升，以避免體內的二氧化碳與 pH 有過度劇烈的改變(Dempsey, 2005; Feldman et al., 2003)。體內二氧化碳與 pH 的變化是由化學接受器（chemoreceptors）所偵測 (Cohen, 1979; Feldman et al., 2003)。化學接受器包含了中樞化學接受器與周邊化學接受器。中樞化學接受器大部分位於延腦腹面，一部分位於小腦。中樞化學接受器包含位於延腦腹面的 retrotrapezoid nucleus (RTN)、 locus ceruleus、孤獨徑核（nucleus of the solitary tract）、preBötzinger 6.

(17) Complex、raphe 與位於小腦的 fastigial nucleus，這些區域感知了二氧化碳與 pH 的變化進而調控了呼吸的節律與強度 (Feldman et al., 2003; Nattie and Li, 2006; Nattie, 2001; Nattie et al., 1991; Takakura et al., 2006)。周邊的化學接受器主要則是頸動脈體（Carotid body）。頸動脈體有神經神經徑路傳到延腦的孤獨徑核，再由孤獨徑核傳到 RTN (Takakura et al., 2006)，化學接受器接收到二氧化碳或 H+的刺激後，訊息經過整合而藉由呼吸相關運動神經調控了呼吸運動與氣體交換。支配聲門運動的喉返神經，也可以看到隨著不同濃度二氧化碳的刺激，有著其相對應的反應。在高濃度的二氧化碳情況下，狗的喉返神經與支配橫膈肌運動的膈神經活性有隨之增加的情形，且呼氣時間會縮短 (Ledlie et al., 1981; Nielsen et al., 1986; Weiner et al., 1982)。而在以貓為實驗動物的研究中，平時帶有吸氣活性的喉返神經外展支，在高濃度二氧化碳環境下會增強其呼氣活性的產生(Zhou et al., 1989)。而在一些疾病導致呼吸功能異常的研究，運用剔除了一些與呼吸節律有關的基因的剔除／轉殖小鼠，其呼吸模式從一出生就有異常，甚至對於高二氧化碳或低氧的反應是有異常的 (Gaultier and Gallego, 2008; Gaultier ., 2006) 。例如 Rett syndrome（Mecp2 deficiency）小鼠，發現其呼吸節律凌亂，自發性的呼吸中止及較長的呼氣後時間（duration of postinspiration；post-I）(Stettner et al., 2007; Viemari et al., 2005)。較長的呼氣後時間也暗示了聲門內收的時間可能是較久且不利於呼吸道暢通的。這些結果都顯示在高二氧化碳環境下，聲門的正常活動對於維持氣體交換與體內恆定是有其重要性的。. （二）肺迷走 C 纖維在肺以及呼吸道的區域分佈了一些由迷走傳入的感覺神經。這些感覺神經，根據對不同的傳導速率、不同刺激的敏感性以及型態，可以分為三類，分別為快速適應接受器（rapidly pulmonary stretch receptors；RARs）、 7.

(18) 慢速適應接受器（slowly pulmonary stretch receptors；SARs）及肺迷走C纖維（pulmonary vagal C-fiber receptors；PCFs）。這些分佈於氣道的接受器有調節呼吸以及保護呼吸道避免吸入更多有害氣體的功能 (Coleridge and Coleridge, 1994)。其中，C纖維不具有髓鞘，且對於化學性的刺激較為敏感，是肺主要的化學接受器，約佔了呼吸道迷走傳入神經的75% (Agostoni et al., 1957; Ho et al., 2001)。C纖維的細胞體位於頸神經節（jugular ganglion）與節狀神經節（nodose ganglian），並且投射於延腦的孤獨徑核（nucleus tractus solitarius；NTS；(Wilson et al., 1996)）。能興奮C纖維的物質包含了辣椒素（capsaicin）、血清素 (serotonin)、組織胺(histamine)、緩激肽(bradykinin) 和前列腺素(Prostaglandin)等 (Coleridge and Coleridge, 1994; Lee and Pisarri, 2001; Paintal, 1973)。辣椒素是 Transient receptor potential vanilloid-1 （ TRPV1 ；或稱為 vanilloid receptor 1；VR1）的專一性致效劑。TRPV1主要表現在C纖維與少數的Aδ感覺神經，辣椒素可以專一的興奮這些神經纖維 (Reynolds et al., 2006)。在大白鼠的實驗中，於頸靜脈投予辣椒素，會經由肺循環刺激肺C 纖維，使肺C纖維興奮 (Coleridge and Coleridge, 1984)。當肺C纖維受到辣椒素刺激後，會促使神經末梢釋放出神經肽（neuropeptide），例如物質P （substance P）與tachykinins，進而藉由NK1與NK2接受器引發支氣管收縮、血漿外滲及呼吸道黏液分泌增加等神經發炎的情形，這個現象稱為軸突反射（axon reflex）(Barnes, 2001)。此外，C纖維將神經訊號經由迷走神經傳至延腦的孤獨徑核，經中樞整合後引發肺化學反射（ pulmonary chemoreflex），包含了呼吸中止（apnea）、心搏減慢（bradycardia）與血壓降低（hypotension）的反應 (Lai and Kou, 1998; Lee et al., 1996; Lu et al., 2002; Lu et al., 2006; Lu et al., 2005)。在本實驗室近年的研究中發現，在大白鼠的動物模式中，由右頸靜脈給予辣椒素刺激肺迷走C纖維除了會引起典型的肺化學反射之外，亦會興 8.

(19) 奮喉返神經的呼氣活動 (Lu et al., 2005)。而利用影像拍攝與肌電位測量的技術，進一步的觀察到在辣椒素興奮肺迷走C纖維引起呼吸中止的時間，甲杓肌的收縮力增強，聲門下壓力增加，且聲門緊閉 (Lu et al., 2006)。這些肺化學反射的反應可能暗示了當動物處在含有刺激性氣體的環境下，一個避免呼吸道與肺部受到持續性傷害的保護機制。而在這個機制之中，聲門與其他支配呼吸道的運動神經要有良好的協調與反應，才能避免有害物質的侵害。而SCAs的病人在疾病晚期於進食時因為異物進入呼吸道引起吸入性肺炎而死亡 (Nakamura et al., 2001; Sasaki et al., 1996)，也暗示了這些防禦性反射，甚至是聲門運動的調控，可能已經有功能異常的情形。. 六、問題與假說 SCAs 病人的臨床病症是身體運動失衡、眼球振動、身體震顫、認知障礙，甚至還有發聲與吞嚥困難的情形。發聲與聲門運動有關，吞嚥時聲門必須關閉，發聲與吞嚥困難暗示聲門調控機轉可能異常。運動功能失調會影響行動能力，但吞嚥困難則可能影響到生命，有許多患者因為異物進入呼吸道引起吸入性肺炎而致命，顯示這方面的研究非常重要。然而，卻很少有文獻提到 SCAs 病患有關聲門與呼吸功能的相關研究，事實上，聲門也是呼吸氣流必經的路徑，聲門的問題也可能引起呼吸功能發生變化。所以，本實驗以動物模式來探討 SCA17 型有關聲門與呼吸的調控，所擬探討的問題有三：第一，如果聲門異常而導致呼吸的問題，最有可能發生的現象是呼吸頻率不穩定，然而有關 SCAs 病患有無呼吸功能異常的相關研究根本沒有，那麼藉由轉殖動物的模式來探討呼吸功能是否發生異常，應該是很重要的問題。如果真的是這樣，那麼，呼吸異常又是在何時發生？第二，根據腦部 MRI 的影像的資料發現，SCA 17 型病患有整個腦部萎縮的現象。那麼萎縮的腦幹很可能影響到與呼吸有關的神經細胞，甚至是正 9.

(20) 常偵測血液中化學如二氧化碳變化的接受器或是調控呼吸作用的的神經細胞有無變化？我們可利用轉殖動物，來研究呼吸神經細胞與化學接受器的活性，就可以推論呼吸相關神經細胞是否發生病變。第三，在文獻中提到有些患者因為異物進入呼吸道引起吸入性肺炎而致命。這樣的問題有可能是聲門運動調控機制或是反射性反應可能發生異常。利用轉殖動物，我們可以研究調控聲門運動的運動神經，對於反射性反應是否正常，如果異常，那就暗示聲門的調控機制可能發生病變。. 七、實驗目的為了解決並驗證上述的問題與假說，本實驗的目的如下：（1）觀察不同年齡的 SCA17 型轉殖小鼠是否在呼吸週期上有變異的情形。（2）在提高二氧化碳濃度的環境中，SCA17 型轉殖小鼠各項呼吸參數是否有與野生型不同的反應。（3）利用辣椒素引起肺化學反射，觀察 SCA17 型轉殖小鼠對於外在刺激的反應是否與野生型有無不同。. 10.

(21) 貳、實驗材料與方法一、實驗動物脊髓小腦萎縮症第十七型之轉殖小鼠取自於國立臺灣師範大學生命科學系謝秀梅副教授實驗室。此 FVB 品系之轉殖小鼠由該實驗室建立，轉殖的基因為帶有 109 個重複擴增多麩醯胺酸序列人類 TATA-box 結合蛋白（human TATA-box binding protein with 109 polyQ；hTBP）。此小鼠自行繁殖並飼養於本系動物房，室溫維持於 25 ± 2 ℃，飼料與水讓動物可以自由取得，日夜週期為 12-12 小時。ICR 品系之小鼠則購自國立台灣大學動物中心，飼養環境與 FVB 品系相同。所有例行性的小鼠基因型鑑定由謝秀梅副教授實驗室協助進行（圖一），動物手術及實驗步驟皆經由國立臺灣師範大學動物管理委員會審核通過。. 二、以 whole body plethysmography 記錄小鼠呼吸運動為測定清醒小動物的呼吸運動，我們必須先建立 whole body plethysmography 來進行呼吸活動。這個裝置包含動物室與參考室（animal and reference chambers）體積各為 250 ml，兩室之間以一小段 PE 管聯通（圖二），由於這段 PE 管細小，動物室的壓力變化不致受到影響，參考室宛如一個緩衝空間，卻又不影響動物呼吸時的壓力變化，所以，所測量動物室的壓力其實是這兩室之間的壓力差。實驗時，這兩室都置於恆溫水浴槽（Water Bath B206，Firstek，Taipei，ROC）內，水溫維持在 28～29 ℃（測量新生鼠時水溫則維持在 32～33℃，以避免動物失溫）。動物置於動物室中，當動物就在這個密閉的動物室內呼吸，吸氣時，動物室裡的氣體溫度較低，被吸入肺部後因為體溫使之加溫且潮濕而壓力增加；呼氣時，動物所呼出的氣體，進入到溫度較體溫為低的動物室中，使壓力降低(Bartlett and Tenney, 1970; Drorbaugh and Fenn, 1955; Epstein et al., 1980)。所以，動 11.

(22) 物室內的壓力隨著動物呼吸運動而升降，我們可利用 differential pressure transducer（model ML141 Spirometer, ADInstruments, Castle Hill, Australia）偵測動物室壓力的變化並與參考室做比較，也可以說是兩室之間的壓力差，即可得到呼吸運動的壓力變化曲線。我們也同時記錄實驗時的氣壓，以便計算呼吸體積時，作為校正之用。將所記錄的呼吸運動曲線資料經由 PowerLab system（ADInstruments, Castle Hill, Australia），將類比的訊號轉為數位的訊號後，儲存在個人電腦的硬碟裡，以實驗完成後進行 off-line 分析。得到的數值包含了壓力變化高低、呼吸週期、吸氣時間與呼氣時間。每次實驗前後利用針筒給予 0.1 ml 之氣體，作為動物室的壓力校正之用，如此即可利用下列公式利用壓力變化來求得潮氣容積(Bartlett and Tenney, 1970; Drorbaugh and Fenn, 1955; Onodera et al., 1997)。. 上式中的符號分別是： VT = 潮氣容積 VK = 校正時注入動物室的體積（0.1ml） PT = 潮氣容積的壓力變化 PK = 校正時注入一定量氣體體積時的壓力變化 TR = 動物的體溫 TC = 動物室的溫度 PB = 大氣壓 PR = 在體溫37℃時的水蒸氣壓力約為 6.27 kpa PC = 動物室29℃時的水蒸氣壓力約為4.00 kpa 所有利用 whole body plethysmography 進行測量的實驗皆在下午 1 時至 12.

(23) 5 時之間進行，該時間處於動物的光週期。實驗開始前將小鼠在持續給予新鮮空氣的情況下先於動物室內適應 30 分鐘以上，然後才開始進行實驗。實驗開始測量時會關閉進氣口與出氣口，在動物室密閉的環境下進行測量 3 分鐘，取其穩定非睡眠時的連續 100 次呼吸運動作分析，並於測量結束後進行秤重。在每次測量時，每隻動物都有其獨自的動物室，之所以如此是因為動物不進入有味道的動物室，也為了避免動物各自的體味影響實驗結果，結束測量後，每一個動物室都必需清洗乾淨，並以 70%酒精噴灑去除氣味，以供下一次測量時使用。. 三、聲門功能評估聲門於吸氣時外展、面積增大，呼氣時內收、面積縮小，這是受到聲帶運動的調控，而聲帶運動是由喉返神經管制，本研究以辣椒素興奮肺部迷走神經 C 纖維引起反射，即所謂肺化學反射，聲門功能正常時，會促使聲門關閉(Lu et al., 2005, 2006)，也就是評估喉返神經的反應，在辣椒素的作用下，喉返神經活動增強，使聲門內收作用增強而關閉。. （一）動物手術在建立小鼠神經胞外記錄動物模式的過程中，實驗動物年齡橫跨 2 個月至 6 個月，實驗動物體重 FVB 品系約 20-29 克，ICR 品系約 28-40 克重。實驗前先進行肌肉注射 atropine（0.5 mg/kg，Sigma，St. Louis，MO，U.S.A.）減少呼吸道黏液分泌，避免阻礙呼吸。以 urethane 腹腔注射（1.4 g/kg， Sigma）進行麻醉，將動物仰臥並固定在恆溫墊（Homeothermic Blanket system，Stoelting Co.，Illinois，U.S.A.）上，插入肛溫棒測量體溫，利用系統的回饋控制將體溫恆定在 36-37 ℃。接著進行氣管插管，保持呼吸道的暢通。利用 PE30 軟管進行右頸靜脈插管以作為投予藥物的途徑。右頸靜脈插管的管端位於右心房入口處，並於距管端 30 μl 的位置有一分支， 13.

(24) 接有微量注射針筒（Hamilton microsyringe），欲投予的藥物（辣椒素）會藉由微量注射針筒推入右頸靜脈插管，接著再以 1 毫升針筒推入 0.05 毫升的生理食鹽水，使藥物直接進入右心房，並經由肺循環進入肺部興奮肺迷走 C 纖維接受器。動物的呼吸模式分為自動呼吸與人工送氣。在人工送氣的動物模式下，會以人工呼吸機（ Model 131 ventilator ， NEMI Scientific, Inc. ， Framingham，U.S.A.）維持其呼吸功能，由頸靜脈注射 gallamine thriethiodide （5 mg/kg）麻痺動物肌肉以排除其自發的呼吸運動。將氣管插管連接上人工呼吸器給予純氧，送氣體積調整在 0.3～0.5 毫升，送氣頻率調整在每分鐘 110～130 次，人工呼吸器呼氣端管子置入水面下 2 公分以維持功能肺餘量。並利用二氧化碳分析儀（ Micro CapnoGraph CI240 ， Columbus Instruments，Ohio，U.S.A.）分析呼氣末之二氧化碳濃度，藉由調整送氣體積與送氣頻率使動物維持在高氧的狀態，呼氣末之二氧化碳濃度維持在 4～5％之間。. （二）神經活性的測量本實驗同時紀錄了支配橫隔肌運動的膈神經，支配聲門運動的喉返神經，以及支配舌肌的舌下神經的活性變化。分離膈神經的方法是先切開鎖骨附近的皮膚及肌肉層，在鎖骨周圍的臂神經叢附近與第四頸脊神經基部找到膈神經，特徵是平行於迷走神經，下行至胸腔，而脊神經則是走向上臂的末端方向。將膈神經與組織分離後，剪斷神經的遠端，利用不銹鋼雙極電極與機械臂（KITE Economy Manual Micromanipulator，World Precision Instruments，Berlin, Germany）將膈神經置於電極上進行胞外記錄。喉返神經位於氣管的兩側，向頭側延伸至喉部。為確保足夠的長度，選取鎖骨至甲狀腺部份的喉返神經進行紀錄。先將喉返神經游離，可見到喉返神經位於甲狀腺的下方。將神經從氣管與組織上游離，在接近喉部的一端剪斷， 14.

(25) 利用白金絲雙極電極（Silver wire，A-M System Inc.，Washington State， USA）與機械臂，將神經置於雙極電極上進行記錄。舌下神經亦是將遠端切斷之後，利用機械臂將神經掛於不銹鋼雙極電極上進行測量。但因為舌下神經雜訊較大以及樣本數目較少等因素，在本實驗並未加以統計分析。在實驗過程中，利用液態石蠟油（paraffin oil）維持神經的溼潤。神經訊號以放大器（P511，Grass，MA，U.S.A.）將訊號放大及濾波（0.3-3 kHz），神經訊號經由 Power Lab system 數位化之後，利用這個系統所提供的軟體進行積分（Time constant＝0.05. s）並儲存於電腦硬碟中。. 四、實驗設計與步驟實驗共有三個部份，第一部份實驗是利用 Whole body plethysmography 來測量清醒、未拘束狀態下 SCA17 轉殖小鼠與 FVB 野生型小鼠的呼吸運動。在實驗開始前，都會先使其於動物室內適應 30 分鐘以上，待其平靜下來才開始進行實驗。實驗開始先通氣含有 20％氧氣、80％氮氣模擬空氣成份的氣體。測量時會關閉進氣口與出氣口，在動物室密閉的環境下進行測量 3 分鐘後，再打開進氣口與出氣口，通入 20％氧氣、80％氮氣之氣體使其回復。取其穩定非睡眠時的連續 100 次呼吸運動作分析，並於測量結束後進行秤重。二氧化碳濃度於三分鐘末時低於 1.5％。此外，並測量以腹腔注射較低劑量 urethane（0.6g/kg）麻醉之後的動物，觀察麻醉前後對於呼吸變異性的影響。第二部份為測量在提高二氧化碳濃度的情況下，SCA17 轉殖小鼠與 FVB 野生型小鼠對偵測二氧化碳的能力及其相對應的反應是否有無差異。在提高二氧化碳濃度的實驗中，在小鼠適應穩定之後，同樣先關閉進氣口與出氣口，在動物室密閉的環境下進行測量 3 分鐘，觀察其對空氣的反應作為控制組。再以空氣對動物室通氣 5 分鐘，確保空氣成份穩定。之 15.

(26) 後通入 3％或是 5％的二氧化碳氣體（其餘部份為 20％的氧氣與用氮氣平衡）於動物室，確定二氧化碳濃度是否是 3％或是 5％是利用二氧化碳分析儀測定，在確定二氧化碳濃度正確 1 分鐘後，關閉進氣與出氣口，並開始測量 3 分鐘對二氧化碳濃度增加的反應。之後打開進氣口與出氣口，通入空氣 5 分鐘維持成份穩定。再關閉進氣口與出氣口測量對空氣的反應 3 分鐘，觀察其恢復的情形。測量結束後進行秤重，當通入 3％二氧化碳濃度於三分鐘末時低於 4.5％，通入 5％二氧化碳濃度於三分鐘末時低於 6.8 ％。經由測試，以流速 9 ml／秒通氣 30 秒內動物室可以充滿 90％以上的目標氣體。資料的取得以其穩定非睡眠時的連續 100 次呼吸運動作呼吸變異性的統計與分析。第三部份實驗是為了測試 SCA17 轉殖小鼠的肺迷走 C 纖維功能是否正常，藉以推測其聲門功能是否正常，觀察喉返神經對投予不同劑量之 capsaicin 的反應，並同時記錄膈神經的活動。在大鼠的研究中，由右頸靜脈給予辣椒素刺激肺迷走 C 纖維，會引起典型的肺化學反射，亦會興奮喉返神經的呼氣活動(Lu et al., 2005)。參考了本實驗室之前的研究，選擇了 0.625 μg/kg 以及 1.25 μg/kg 之辣椒素，由頸靜脈注射進入肺循環以興奮肺迷走 C 纖維。每劑量投予間隔為 20 分鐘，避免每次投予間的加成反應，且兩種劑量為隨機注射。觀察是否於轉殖小鼠中此反應與野生型有無不同，是否暗示了支配聲門運動的喉返神經有功能異常的情形。. 五、藥物配製 Urethane 配製手術進行前以 urethane（Sigma，St. Louis，MO，U.S.A.）腹腔注射（1.2 g/kg）進行麻醉，Urethane 以生理食鹽水溶解為濃度 0.3 g/ml 置於常溫下備用。. 16.

(27) Atropine 配製 Atropine（Sigma，St. Louis，MO，U.S.A.）以生理食鹽水溶成 0.5 mg/ml 的溶液，避光保存在 4 ℃的冰箱中，麻醉前依動物體重肌肉注射（0.5 mg/kg），減少實驗過程中動物呼吸道黏液分泌。. Gallamine triethiodide 配製人工送氣模式下所使用的肌肉麻痺劑 gallamine triethiodide（Sigma）溶於生理食鹽水中（5 mg/ml），並避光保存於 4 ℃的冰箱中，於實驗中經由頸靜脈注射（5 mg/kg）以避免自發性的呼吸。若於實驗過程中發現動物恢復呼吸則再補充 2.5 ～ 5 mg/kg 的 gallamine triethiodide。. Capsaicin 配製 Capsaicin（Tocris，Bristol，UK）的調配比例則是 10％酒精（95％）， 10％ polyoxyethylene sorbitan monooleate（Tween 80，Hanawa Chemical Pure，Osaka，Japan）與 80％的生理食鹽水互相混合而成，以 500 μg/ml 的濃度儲存於 -20 ℃的環境中。使用時以生理食鹽水根據不同體重的小鼠進行稀釋，調整成當注射 5，10 l 時的給藥量為 0.625，1.25 μg/kg。. 六、呼吸變異性分析與實驗資料統計神經活性以及 Whole body plethysmography 測量的呼吸相關參數皆以 PowerLab system 紀錄於電腦中，利用 Visual C++撰寫之程式分析神經活性高度或壓力變化、吸氣時間與呼氣時間。. （一）呼吸變異性分析與呼吸參數分析在以 whole body plethysmography 測量的實驗當中，為了計算小鼠呼吸週期的變異性，我們採用變異係數（coefficient of variation；CV）以及變 17.

(28) 異性分數來做分析（irregularity score；IS）(Viemari et al., 2005)。因為單純的使用標準差無法有效的比較不同觀察值間分布之分散程度，所以我們採用變異係數。變異係數的計算方式是以樣本的標準差去除以平均數，在本實驗中則是以連續100次呼吸運動的呼吸週期標準差除以平均數。得到的數值愈大，則表示該動物的呼吸週期愈不規律。但是若只使用變異係數無法完整的表達呼吸變異性，因為變異係數缺乏了時間的因子，會高估了漸進性變化呼吸週期的呼吸變異性。變異性分數的計算方式是 100 X ABS (Pn-Pn-1)/Pn-1，ABS代表絕對值，Pn與Pn-1代表第n次與第n-1 次的呼吸運動週期。本實驗分析連續100次呼吸運動的呼吸週期變異性分數之平均值。壓力變化的資料從differential pressure transducer 測量並傳入PowerLab 的訊號所獲得。呼吸周期、吸氣時間與呼氣時間是以Visual C++撰寫之程式分析，這個程式原來適用於分析神經活動高度、膈神經活動時間(代表吸氣時間)與膈神經不活動時間(代表呼氣時間)，在此用於分析吸氣時間與呼氣時間。而潮氣容積與單位體重分鐘換氣量（ventilation，ml/min/g）的運算則利用Microsoft office Excel 2003進行處理。. （二）神經活性分析喉返神經與膈神經的活性同時記錄於電腦硬碟，以PowerLab轉存為通用的文字檔格式之後，再利用我們以C++所撰寫的程式讀取並分析。我們把膈神經開始放電到放電結束的時間稱為吸氣時間，放電結束後到下一次開始放電前的時間則為呼氣時間，一個吸氣時間加呼氣時間就是一個呼吸週期。以程式計算出給藥前15次呼吸週期的平均積分神經高度為基礎值作為對照，將投予capsaicin引起呼吸暫停後的呼吸週期與神經高度逐口分析，觀察神經活性與呼吸週期的改變，也核計在呼吸暫停時間的喉返神經活動。 18.

(29) （三）統計方法採用多重比較檢驗（multiple comparisons test），方法是先以雙因子變異數分析（two-way ANOVA measures）進行，接著以Student-Neuman-Kurls 作為 post-hoc檢定分析，分析軟體是利用SigmaStat 3.0，當P值小於0.05就表示達到顯著差異。所有的數據皆以平均值±標準誤表示。. 19.

(30) 參、實驗結果一、不同年齡 SCA17 型轉殖小鼠的呼吸功能（一）不同年齡的呼吸變異性以 whole body plethysmography 測量動物室的壓力變化，代表實驗動物 (野生型與基因轉殖小鼠)的呼吸活動，測量的年齡從出生後 4 天（p4；「p」是 post natal）至 6 個月（p180），所得結果顯示，在出生後 4 至出生後 10 天（p4～p10），野生型（Wild type）與轉殖小鼠（Transgenic mice）的呼吸節律逐漸的由凌亂趨於規律（圖三 A1，A2，B1 及 B2）。但是當到了出生後 17 天（p17），野生型的節律仍十分規律（圖三 C2），但是在轉殖小鼠的呼吸節律則開始變得快慢不一（圖三 C1）。經分析連續 100 次呼吸週期（圖四），將所得結果以呼吸週期時間作為縱坐標，並以這 100 次的呼吸次數為橫座標，製作呼吸週期分佈圖（圖四），可以見到在 p10 至 p17 這段時間，野生型動物呼吸週期時間分部並未有太大的改變，但是轉殖小鼠的呼吸時間分布在 p17 開始趨於不規則，從呼吸週期的分佈也顯得比較分散（圖四 B2）。從另ㄧ種表示方式，是將呼吸週期時間作為橫座標，將呼吸次數作為縱座標，可以見到呼吸週期時間的分布(圖五)，也可以見到轉殖小鼠在出生後 17 天(p17)，分散度較大(圖五 B2)。不論是以何種表達方式，都可以清楚看出，轉殖小鼠在出生後 17 天，呼吸週期發生很大的變化。從圖三更可以看出在出生後 17 天至六個月之間，野生型呼吸週期一直維持其規律而無明顯變化（圖三 D2-G2），相對地，轉殖小鼠不規律的情形卻隨著年齡的增加一直處於不穩定狀態（圖三 D1-G2）。為了量化實驗動物呼吸週期變異性，我們分析呼吸週期變異係數（coefficient of variation；CV）與變異性分數 (irregularity score；IS），將實驗動物的呼吸週期不規律現象量化，以便進行統計分析。當數值愈高的時候，也就代表著呼吸的變異性愈大。圖六 A 與 B 分別是分析後所得之變 20.

(31) 異係數與變異性分數，很清楚地，在 p4 的時候，野生型與轉殖小鼠的呼吸變異性都相當高，野生型的 CV 為 20.76±1.16，IS 為 25.20±1.70；轉殖小鼠的 CV 為 22.14±1.72，IS 為 22.03±1.57。到了 p10 的時候，野生型的 CV 降低為 11.70±0.63，IS 亦降低為 12.97±0.95；轉殖小鼠的變異性同樣的也降低了，CV 減少為 9.46±0.47，IS 降為 10.22±0.50。不管是在 p4 或是 p10 的時間點，兩種基因型的小鼠之間並無顯著差異（P>0.05）。但是在 p17 的時候卻有了重大的變化。野生型的 CV（14.63±0.52）與 IS（13.86±0.76）仍然維持在相當於 p10 的範圍，但轉殖小鼠呼吸週期的變異性卻明顯升高，CV 與 IS 顯著的增加至 27.16±2.07 與 25.15±1.77（p<0.01，與野生型動物相比較）。此後，轉殖小鼠的呼吸週期變異性一直處在這麼高的壯代，甚至還有逐漸增加的趨勢，而野生型動物年齡從 p24 到 p30，甚至到半年，其呼吸變異性，不論是 CV 或是 IS 都處在與 p17 相當的範圍(圖六 A 與 B， p>0.05，與 p10 相比較)，相對地，轉殖小鼠的呼吸變異性相當大，在相對應於年齡（p24，p30，p60,p120,p180），野生型動物的 CV 值分別是：23.25 ±0.92，24.70±0.98，26.67±1.12，33.43±1.40，以及 39.24±1.75 (圖六 A， p<0.01，與同年齡野生型的 CV 值相比較)；同樣地，其 IS 值在相對應的年齡分別是：20.88±1.20，23.27±1.92，22.69±1.65，26.58±1.52，以及 27.77± 2.14 (圖六 B，p<0.01 與同年齡野生型的 IS 值相比較）。. （二）不同年齡呼吸週期的改變同樣分析了連續一百次呼吸運動的呼吸週期，從 p4 到 p31，野生型（WT）與轉殖小鼠（Tg）之間並無顯著差異（圖七 A，P>0.05）。但是從 p60 開始，轉殖小鼠的呼吸週期開始顯著的較野生型為長（圖七 A； p60-p180；WT: 133.4±6.0 msec，129.9±8.2 msec，153.0±10.0 msec；Tg：162.2 ±5.8 msec，176.8±9.5 msec，189.1±12.1 msec；在同年齡相比較，P<0.05）。在 p17，p24，p31 時轉殖小鼠的吸氣週期為 68.7±3.1 msec，62.1±1.7 21.

(32) msec，59.9±1.7 msec，顯著的短於野生型的 82.2±6.9 msec，71.2± 2.3 msec， 71.0±1.5 msec（圖七 B ，P<0.05）。但是在 p120 的時間點，轉殖小鼠的吸氣時間轉變成 62.±2.5 msec，顯著的較野生型的 59.5±2.8 msec 為長（P<0.05）。但是其他的時間點，這兩者間是沒有顯著差異的。呼氣時間於出生後四天的測量就表現出轉殖小鼠顯著的以 184.2±11.8 msec 長於野生型的 170.9±7.9 msec (圖七 C，P<0.05）。在接著 p10-p31 的時期兩者之間並沒有顯著的差異。直到 p60 開始，轉殖小鼠呼氣時間又較野生型為長的，兩者分別是 100.2±4.4 msec 與 87.7±3.3 msec，差別顯著 (P<0.05）。這種不同的差別現象從 p60 一直持續到 p180（p120-p180，WT： 94.8±5.4 msec，106.9±5.7 msec。Tg：112.6±7.7 msec，113.8±8.6 msec； P<0.05）。. （三）不同年齡單位體重分鐘換氣量的改變潮氣容積在胚後發育逐漸增加，從 p4 到 p17 間，轉殖小鼠與野生型都增加，彼此之間並無顯著差異（圖八 A；P>0.05）。但是於 p24，轉殖小鼠的潮氣容積為 0.114±0.006 ml，顯著小於野生型 0.148±0.011 ml（圖八 A， P<0.05）。於 p31 時轉殖小鼠的潮氣容積為 0.150±0.008 ml，亦顯著小於野生型 0.179±0.012 ml（圖八 A，P<0.05）。但是於 p31 之後，p60 至 p180 時期，兩者間並無顯著差異。於 p180 時，轉殖小鼠潮氣容積為 0.131±0.004 ml，野生型的潮氣容積為 0.132±0.005 ml（p>0.05）。單位換氣量也是隨著出生後逐漸增加，同樣的在 p4-p17 之間並無太大差別，到 p24 時差異才顯現出來（圖八 B）。在 p24 時轉殖小鼠的換氣量為 3.24±0.24 ml/min/g，顯著的低於野生型的 3.89±0.32 ml/min/g（圖八 B， p<0.05）。此後轉殖小鼠的換氣量有低於野生型的趨勢。在 p60 與 p120 時，轉殖小鼠的換氣量為 1.95±0.12 與 1.82±0.09 ml/min/g，亦顯著的低於野生型的 2.74±0.19，2.49±0.12 ml/min/g（圖八 B，p<0.05）。 22.

(33) （四）麻醉對於呼吸變異性的影響以腹腔注射 urethane（1.2 g/kg）麻醉轉殖小鼠與野生型小鼠，測量麻醉前、後的呼吸活動，仍以 whole body plethysmography 測量實驗動物的呼吸活動變化。動物在接受麻醉之後，呼吸節律並未有太大改變，野生型的呼吸運動仍舊十分規律（圖九 A1，A2），轉殖小鼠呼吸運動的變異性於麻醉後也依然存在（圖九 B1，B2），不論是野生型或是轉殖小鼠，麻醉劑主要是引起呼吸高度降低。經分析連續 100 次呼吸運動所得結果，野生型動物的呼吸週期時間相同(（圖九 C1)，轉殖小鼠的呼吸週期時間甚至更長（圖九 C2）。. 二、高二氧化碳濃度對 SCA17 型轉殖小鼠呼吸變異性的影響（一）高二氧化碳降低呼吸變異性以六個月大的野生型與轉殖小鼠為材料，利用 whole body plethysmography 測量其對於吸入不同二氧化碳濃度後呼吸運動，然後再分析其呼吸變異性。在一般空氣成份的環境下，轉殖小鼠的呼吸節奏較野生型來的不規則（圖十 A1 與 A2）。但是在增加了二氧化碳的環境下，轉殖小鼠的節奏逐漸變得規律（圖十 B1 與 B2），在 5％二氧化碳的環境下與野生型已無太大差別（圖十 C1 與 C2）。經分析呼吸變異係數（CV）與 irregularity score（IS）將其呼吸週期不規律的現象量化並統計分析。野生型小鼠，吸入空氣（air），然後增加二氧化碳到 3%與 5％，呼吸變異性並無顯著變化，在這三種氣體環境下 CV 值分別是：Air：17.62±1.19，3％CO2：17.72±2.53，5％CO2：20.20±2.44 （圖十一 A 彼此間並無差異，p>0.05）同樣地， IS 值分別是：Air：16.87 ±2.13，3％CO2：15.18±2.11，5％CO2：12.38±1.50(圖十一 B，彼此間並無差異，p>0.05）。但是在轉殖小鼠，呼吸週期的變異性會隨著二氧化碳的增 23.

(34) 加而逐漸降低，在這三種環境下，其 CV 值分別是：Air：39.83±2.53，3 ％CO2：29.77±3.06，5％CO2：21.44±3.34，隨二氧化碳增加而顯著降低 (圖十一 A，p<0.01)，而 IS 值分別是：Air：28.43±2.38，3％CO2：21.91±1.91， 5％CO2 ：15.49±2.33，也是隨二氧化碳濃度增加而明顯降低(圖十一， p<0.01）。比較這兩種實驗動物，在呼吸空氣的環境下，轉殖小鼠的 CV 值明顯高於野生型動物(圖十一，p<0.01)，當吸入 3％CO2 時，轉殖小鼠的 CV 雖然降低，但仍然高於野生型動物(圖十一，p<0.05)，當 CO2 增加到 5 ％的時候，其 CV 值降低到與野生型小鼠一樣（圖十一，p>0.05），同樣地，轉殖小鼠的 IS 值也是有同樣的趨勢，當 CO2 增加到 5％的時候，其 IS 值變得與野生型相類似（圖十一 B，p>0.05）。. （二）高二氧化碳對呼吸週期的影響在提高至 5％二氧化碳環境下 SCA17 型轉殖小鼠呼吸週期為 142.7±8.8 msec，顯著的低於野生型的 203.5±31.6 msec（圖十二 A；P<0.05），且兩者反應的趨勢不盡相同。野生型在 3％與 5％二氧化碳環境的呼吸週期有較 Air 時延長的趨勢，但是轉殖小鼠卻反而較為縮短（圖十二 A）。轉殖小鼠的吸氣時間在不同程度二氧化碳環境下並無太大差異，但是野生型的吸氣時間卻有隨二氧化碳濃度增加的趨勢（圖十二 B）。且 5％二氧碳化濃度環境下的野生型吸氣時間為 89.4±14.5 msec，顯著的長於轉殖小鼠的 60.3±4.2 msec（圖十二 B；P<0.05）。呼氣時間於轉殖小鼠有隨著二氧化碳濃度增加而逐漸縮短的趨勢（圖十二 C），從空氣時的 110.5±9.5 msec 縮短到 5％二氧化碳時的 82.5±5.1 msec。但是在野生型的變化卻有所不同，從空氣時的 98.4±11.8 msec，於 3 ％二氧化碳時增加為 133.9±18.4 msec，再於 5％二氧化碳時稍降為 114.1± 17.3 msec。然而在轉殖小鼠與野生型之間的呼氣時間，無論二氧化碳濃度的高低並無顯著差異（P>0.05）。 24.

(35) （三）高二氧化碳對潮氣容積與換氣量的影響提高二氧化碳會促使潮氣容積增加，野生型動物呼吸空氣、3%與 5% 二氧化碳時，潮氣容積分別是 0.117±0.005 ml、0.144±0.004 ml 以及 0.170± 0.006 ml (圖十三 A，p<0.05)，轉殖小鼠的潮氣容積在這三種環境下，分別是 0.123±0.007 ml、0.127±0.008 ml 與 0.144±0.009 ml。於 5%二氧化碳環境下的轉殖小鼠潮氣容積顯著的較野生型小（p<0.05），不過野生型與轉殖小鼠在空氣與 3％二氧化碳環境下的潮氣容積是沒有顯著差異的（P>0.05）。而野生型小鼠潮氣容積隨著二氧化碳增加的現象，在轉殖小鼠卻沒有被我們所觀察到。在單位體重分鐘換氣量在野生型小鼠呼吸空氣、3%與 5%二氧化碳時，分別為 1.578±0.149 ml/min/g、1.430±0.139 ml/min/g 與 1.974±0.230 ml/min/g。轉殖小鼠則是 1.595±0.160 ml/min/g、1.668±0.179 ml/min/g 以及 2.218±0.210 ml/min/g。兩種基因型在同樣環境的單位體重分鐘換氣量並無差別（圖十三 B；P>0.05）。但是在轉殖小鼠中，卻發現有隨著二氧化碳濃度增加，單位體重分鐘換氣量逐漸增加的情形（P<0.05）。不過在每分鐘換氣量的分析中，卻未觀察到這個趨勢（結果未呈現）。. 三、辣椒素對膈神經與喉返神經呼吸活動的影響 (一) 辣椒素對神經呼吸活動的影響在大鼠的動物模式中，由右頸靜脈給予辣椒素刺激肺迷走 C 纖維會引起典型肺化學反射（pulmonary chemoreflex），其反應包含了呼吸暫停、心搏減慢、血壓降低及興奮喉返神經的呼氣活動(Lu, Lee et al. 2005)。在野生型的小鼠動物模式中，由右頸靜脈給予 0.625 μg/kg 以及 1.25 μg/kg 辣椒素，以刺激肺迷走 C 纖維，亦引起了典型的肺化學反射，不過，由於小鼠的血壓不容易記錄，僅記錄膈神經與喉返神經活動，圖十四 A2 與 B2，可 25.

(36) 以清楚觀察到，辣椒素注入後，不論是低劑量或高劑量，膈神經活動都會暫停，並出現連續性活動 (toninc activity)，在膈神經恢復後的第一次活動高度比注射前高，連續性活動經一段時間後逐漸恢復。喉返神經在呼吸暫停期間的活動增高，在呼吸恢復的第一次呼吸週期，喉返神經活動仍然增強，不僅如此，喉返神經的活動時間也延長，在正常未注射辣椒素前，喉返神經呈現吸氣與呼氣活動，其呼氣活動僅出現在呼氣早期，ㄧ般稱之為第一期呼氣(stage I expiration)，可是在辣椒素的作用下，喉返神經呼氣活動時間延長到整個呼氣時間，不僅是整個呼氣暫停期間都在活動，在呼吸恢復後，其活動仍然佔了整個呼氣時間，也就是說，包括第二期呼氣也在活動，事實上，呼氣活動並沒有降到基線，在外觀上，喉返神經的反應是呼氣活動根本就是轉變為連續性活動，只是在吸氣時間稍稍降低，使得喉返神經活動積分後的基線向上移動(圖十四，A2 與 B2)。但是對轉殖小鼠來說，辣椒素所引起的肺化學反射並不是很明顯，以圖十四這隻動物為例，低劑量辣椒素對膈神經與喉返神經活動幾乎沒有影響(圖十四 A1)，提高辣椒素的濃度，對膈神經活動的影響仍很微弱，僅呈現呼吸些微暫停，喉返神經活動的反應類似野生型動物，惟在反應的程度上比野生型動物小，其積分後的基線向上移動程度較小(圖十四 B1）。在所觀察的動物，對辣椒素的反應相當一致，經分析並將這些結果平均，如圖十五 A 所示。在野生型投予辣椒素之後，在 0.625 μg/kg 的劑量下看到了喉返神經活性增加為給藥前的 226.06±27.87 ％，在 1.25 μg/kg 的劑量下則增加到給藥前的 517.20±53.66 ％。這些活性都顯著的大於轉殖小鼠喉返神經活性在 0.625 μg/kg 劑量下的 151.89±27.87 ％與 1.25 μg/kg 劑量下的 221.94±20.87％（圖十五 A；P<0.05）。分析投予辣椒素之後連續的 15 次呼吸運動，低劑量的實驗中，刺激後的第二次呼吸運動的喉返神經活性就已經恢復到與給藥前相似的強度，這個現象在轉殖小鼠與野生型之中都類似。但是在給予高劑量辣椒素刺激的 26.

(37) 情況下，轉殖小鼠的喉返神經活性增加較野生型為小（P<0.01），且在第二次呼吸運動就已經與基礎值沒有顯著差異。野生型喉返神經活性增加的情形在刺激後的 15 次呼吸運動依然存在，這個情形平均會在約 15 分鐘左右完全恢復（結果未呈現）。而膈神經的活性在投予辣椒素之後連續的 15 次呼吸運動不管在高劑量或是低劑量都沒有看到顯著的差異（圖十五 B1 與 B2；P>0.05）。. （二）辣椒素對呼吸時間的影響在圖十六 A 中可以發現，在野生型中投予較低劑量 0.625 μg/kg 的辣椒素，會引起原來呼氣時間 715.47±181.66 ％的呼吸暫停，較高劑量 1.25 μg/kg 會引起相較給藥前呼氣時間 1754.46±285.93 ％的呼吸暫停。這些時間顯著的較轉殖小鼠的低劑量反應 110.88±11.76 ％與高劑量反應 411.81± 116.15％有延長的現象（P<0.05）。分析在投予辣椒素之後連續的 15 次呼吸運動，吸氣時間在野生型與轉殖小鼠之間並無太大的差別（圖十六 B1 與 B2；P>0.05）；但是可以發現在辣椒素刺激之後的第一次呼吸運動，轉殖小鼠的呼氣時間在低劑量（0.55 ±0.13sec）顯著的較野生型（3.65±0.81sec）為短（圖十六 C1；P<0.001）。而在高劑量也看到了相同的情況（圖十六 C2；WT:4.09±0.71 sec，Tg：1.25 ±0.17 sec；P<0.001）。這種呼吸型態只維持了 1-2 次的呼吸運動，第 3 次之後的呼吸運動就回復到與給藥前的呼氣時間沒有顯著差異。. 27.

(38) 肆、討論本研究有三個重要發現是，第一，SCA 17 型轉殖小鼠呼吸節奏有不規律的現象，這種呼吸變異性開始於出生後第二至第三週之間，此後，就ㄧ直維持在這種不規則的呼吸節奏。第二，呼吸變異性在高二氧化碳環境下會降低而趨於正常，與野生型小鼠之間沒有差別，但是這種呼吸變異性卻不受麻醉劑的抑制。第三，轉殖小鼠對右頸靜脈投予辣椒素興奮肺迷走 C 纖維，所引起的反射性反應非常微弱，呼吸暫停的時間較野生型短，所興奮的喉返神經活性也較弱，這些結果暗示轉殖小鼠的聲門調控機制、甚至是其呼吸功能，可能異常。. 一、Whole-body barometric plethysmography 測量法的探討呼吸的參數包含了呼吸週期、吸氣與呼氣時間、潮氣容積與換氣量。其中，測量清醒動物的方法主要可以分兩種，非拘束式的 whole-body barometric plethysmography 與較為拘束的 head-out plethysmography (Hoymann, 2006, 2007)。whole-body barometric plethysmography 測量的原理是藉由，吸氣時被吸入肺部的氣體因為溫度上升而壓力增加；呼氣時，動物所呼出的氣體被冷卻而使壓力降低(Bartlett, 1989; Bartlett and Tenney, 1970; Drorbaugh and Fenn, 1955; Epstein et al., 1980)，而利用這些壓力變化即可計算出容積的改變，推算出呼吸運動的相關參數。而利用 head-out plethysmography 在進行測量時，將動物置於要測量的裝置內，將動物的頸部與測量的 chamber 做密封，防止漏氣，如此可以測量到位於 chamber 內胸腔大小的變化，但缺點是很難去避免因為密封頸部對於動物所造成的壓迫，產生不可預期的影響(Gaultier and Gallego, 2008)。相對地，若利用 whole-body barometric plethysmography 就可能可以避免拘束所帶來的影響。也因此，我們參考了這些文獻，依據 Bartlett and Tenney, 於 1970 年發 28.

(39) 表的研究，參考並設計出我們的實驗裝置。小鼠的但是除了呼吸運動之外，水分蒸汽壓，環境與生物體溫度，以及生物體的移動也都會影響到壓力的變化(Drorbaugh and Fenn, 1955; Gaultier and Gallego, 2008; Gaultier et al., 2006)。校正時所注入的氣體也無法確保與動物室內的氣體等溫(DeLorme and Moss, 2002)。除了不同小鼠種間的差異之外，這種校正上的誤差也很可能是我們所測量到的潮氣容積和換氣量與其他所不同的原因之一。雖然無法直接量測到容積的變化，只能估計潮氣容積與換氣量，但是目前這個方法是普遍認為在自由運動的動物中，唯一能夠半定量潮氣容積與換氣量的方法(Enhorning et al., 1998; Gaultier et al., 2003; Gaultier and Gallego, 2008; Onodera et al., 1997)。在我們的實驗結果中，我們在六個月大的野生型小鼠與轉殖小鼠觀察到了快速的呼吸頻率（392±60 次／分與 317±50 次／分）。與一些利用拘束式測量的研究相較之下，我們的呼吸頻率較快。這個現象可能除了因為頸部受到壓迫之外，拘束式的裝置還必須要有一股力量防止小鼠後退，以防止其頭部從頸部拘束器掙脫，而這可能是造成拘束式與非拘束式測量到呼吸頻率不同的原因(DeLorme and Moss, 2002)。然而，在過去一些以非拘束式 plethysmography 進行的研究中，該呼吸頻率也較我們的結果為慢 (Hamelmann et al., 1997; Tankersley et al., 1997)。在 Ztm:MF1 品系的小鼠中，利用影像記錄與慢動作重播技術並以人工計數的方式測量了其呼吸頻率為 254±28 次(Bernhard et al., 2001)。在該實驗中，作者計數的過程中已將小鼠主動嗅氣味（sniff）的動作排除。因此，推測在小鼠呼吸的過程中，可能有不易被觀察到之嗅氣味的行為(DeLorme and Moss, 2002)，才使結果呈現出快速的呼吸頻率。且小鼠在以 urethane 輕微麻醉之後有呼吸頻率降低，但呼吸變異性仍存在的情形。對於 urethane 使呼吸頻率降低，但呼吸變異性仍存在的作用機制仍不是十分瞭解，但是麻醉之後會降低大腦皮質的活動，減少意識對呼吸的控制(Gonsenhauser et al., 2004)。麻醉後的呼吸 29.

(40) 頻率與其他相關研究較為相似。因此，推測在實驗過程中，動物的心理因素可能也會影響了呼吸頻率的改變。. 二、呼吸變異性在我們的實驗結果中，發現野生型與轉殖小鼠的呼吸週期在出生兩週是一樣的，剛出生的第一週，呼吸週期比較不穩，出生後 10 天呼吸不穩的程度降低。為方便量化以評估呼吸週期不穩，本研究量化呼吸變異性 (respiratory variability)的指標是將所測量的呼吸週期轉換計算成 CV 值與 IS 值，這兩個值大代表呼吸變異性大，是常用於呼吸週期不穩的量化指標 (Viemari et al., 2005)，根據 CV 值與 IS 值，我們發現剛出生第一週，野生型與轉殖小鼠的 CV 值與 IS 值高，到第二週，這兩種實驗動物的 CV 值與 IS 值都降低，野生型動物就ㄧ直維持在這樣的 CV 值與 IS 值達半年，鼠類年齡達半年，ㄧ般就認為是年老年齡。因此我們認為野生型小鼠的呼吸變異性在剛出生是比較高，第二週之後就轉變為穩定狀態，這樣的穩定呼吸週期就維持到年老。然而轉殖小鼠的 CV 值與 IS 值卻在 p17 之後升高，且ㄧ直維持在這樣高的 CV 值與 IS 值到年老，與野生型動物相比較，顯示轉殖小鼠的呼吸週期從第三週開始就呈現不穩定，這是第一次在脊髓小腦萎縮症的動物看到呼吸不穩現象。呼吸變異性大也就是呼吸週期不穩，暗示呼吸頻率時快、時慢，是否因為這樣而導致聲門運動控管機制異常？或是聲門運動異常而引起呼吸不穩？目前並不清楚，這兩種生理異常有無因果關係？甚至是同一個機制異常所引起，也不知道。野生型小鼠的呼吸變異性從剛出生的不穩轉變穩定狀態，與大鼠相似 (Liu et al., 2006b；Mortola, 1984)。Liu 等 (2006b)從他們的研究結果，認為腦幹的神經元在胚後發育過程(postnatal development)有一個重要時期 (critical period)，這個重要時期大約是在出生後第二週，他們發現腦幹神經元，尤其是 pre-Bötzinger complex (preBötC) 神經元的麸胺酸及其受器，在 30.

(41) p12 會降低，preBötC 是目前大家所認為可能是呼吸節律產生中樞，麸胺酸作用於麸胺酸受器對引起神經元興奮以及引發吸氣活動扮演重要角色 (Feldman and Del Negro, 2006；Guyenet and Wang, 2001)；有趣的是大約在這個時期 (p10-p12)，GABA receptor α3-subunit 減少，且α1-subunit 表現增加 (Liu and Wong-Riley, 2004, 2006a)；不僅如此，glycine 含量卻在 p12 增加 (Liu and Wong-Riley, 2004; Wong-Riley and Liu, 2005)。顯示神經傳遞物質在 p12 時期是一個轉變的重要時期，興奮性神經傳遞物質如麸胺酸減少，但抑制性的 glycine 卻增多，而 GABA 受器也改變其結構，可能與呼吸頻率變化有關。本研究觀察到呼吸變異性在第二週發生轉變，與上述神經傳遞物質在出生後的變化，在時間上相當ㄧ致，惟這種呼吸變異性在出生後兩週的轉變，是否就是由於神經傳遞物質的變化，目前並無直接的證據，由於在時間上的相關性，這樣的可能性卻不能排除。呼吸節律的產生雖然是與延腦神經元有關，尤其是 preBötC 這裡的神經元，惟也受到橋腦呼吸調節中樞的影響。在發育過程中，橋腦呼吸調節中樞的功能是維持正常呼吸節律所不可或缺的 (St-John and Paton, 2004)。在橋腦，有三大主要核區與呼吸頻率調控有相當密切的關係。這三大核區，從吻端到尾端分別是 Parabrachial/Kölliker-Fuse complex（PB/KF）， intertrigeminal region（ITR）與 noradrenergic A5 cell group (Alheid et al., 2004; Dutschmann and Herbert, 2006)。KF 接收許多呼吸相關的傳入信息，參與調控吸氣後活性 (post-inspiratory activity) (Dutschmann et al., 2004; Dutschmann and Herbert, 2006; Kron et al., 2007a)，也參與多種呼吸相關的反射調控機制，如 nasotrigeminal reflex (Dutschmann and Herbert, 1998)，賀伯反射（Hering Breuer reflex）(Ezure, 2004)，吸入反射（aspiration reflex） (Jakus et al., 2004)，chemoreceptor reflex(Song and Poon, 2004)以及感壓反射 (baroreceptor reflex) (Erickson and Millhorn, 1994)，這些反射性反應也與呼吸頻率有關，例如：潛水時所引起的 nasotrigeminal reflex，呼吸必須暫停， 31.

(42) 賀伯反射卻抑制吸氣，所以，這些反射性反應都會影響呼吸頻率。Kron et al. 最近(2007b)發現出生後十天(p10)以前的新生大鼠，KF 核區 GABAergic 抑制性突觸傳遞佔主要多數，但卻在出生十天之後逐漸減少、並轉變為以 glycnergic 抑制性突觸傳遞為主。換句話說，KF 核區的抑制性突觸傳遞會在出生之後發生轉變，從 GABAergic 轉變為以 glycnergic 為主的傳遞作用。KF 這種發育上的成熟與轉變，在時間上也與本研究所得有關呼吸變異性相關，是否可以解釋本實驗所觀察到的結果，值得考慮。呼吸變異性也見於 Rett syndrome 病人，這是一種遺傳疾病，與 MECP2 基因病變有關，病患在尚未發病前正常，病發後呈現呼吸不穩的問題，尤其是在白天或生氣時尤甚 (Nomura, 2001)，原因不明。利用動物轉殖小鼠模式研究呼吸週期變異性 (Julu et al., 2001; Viemari et al., 2005)，發現轉殖小鼠延腦腹呼吸神經核 (ventral respiratory group; VRG）的呼吸相關神經元，其呼吸節律呈現不規則活動，這種不規律的活動現象會在投予正腎上腺素之後恢復其呼吸節奏(Viemari et al., 2005)，作者因而推測其呼吸變異性的原因可能是延腦所分泌的 tyrosine hydroxylase 與血清素的神經細胞缺失所導致。此外，在 SCA 17 轉殖小鼠的動物模式中，也發現轉殖小鼠在腦中 small heat shock protein HSPB1 的表現量較少，這種 HSPB1 的表現量與神經細胞的正常功能與存活有關 (Friedman et al., 2007)，暗示 SCA 17 型轉殖小鼠正腎上腺素或血清素的分泌與作用可能有異常的情形，且神經細胞的正常功能與存活可能受到了影響，進而使自發性的呼吸節律調節產生異常，導致了呼吸變異性的產生。Stettner et al. 最近 (2007) 發現 MECP2 基因剔除 (knouk-out) 的小鼠，其 post-inpiratory activity 非常不穩，若是以麸胺酸刺激橋腦的 KF 核區，結果是 pos-tinpiratory activity 增強，呼吸暫停的時間延長，不僅如此，電刺激迷走神經傳入感覺神經，呼吸暫停時間並不會更為延長。前述 KF 涉及許多呼吸相關反射作用，MECP2 基因剔除的小鼠，迷走神經所引起的反射遲鈍，且興奮 KF 引起 postinspiratory activity 32.